專利名稱：一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物樣品的檢測(cè)與鑒別，更具體地說，涉及一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，新的核酸擴(kuò)增技術(shù)不斷出現(xiàn)。2000年Notomi 等建立了一種新的體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，其特點(diǎn)是針對(duì)革E基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物共4種特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶在等溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，在Ih內(nèi)就能擴(kuò)增出109個(gè)靶序列拷貝。LAMP反應(yīng)的原理以及所使用到內(nèi)、外引物如圖I所示。4條引物中2條為內(nèi)引物，2條為外引物。其中，內(nèi)引物FIP(forward inner primer)包含F(xiàn)lc序列和F2 (F2c區(qū)域的互補(bǔ)序列)，即5' _Flc_F2 ;內(nèi)引物BIP (backward iner primer)包含Blc (BI區(qū)域的互補(bǔ)序列)和B2序列，即5' _Blc_B2。外引物為F3和 B3序列。LAMP技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、過程快速、操作及結(jié)果判定簡(jiǎn)單，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品衛(wèi)生檢疫及基因芯片的開發(fā)。LAMP技術(shù)的結(jié)果判定方法常用的有三種(I)瓊脂糖電泳檢測(cè)，若擴(kuò)增條帶呈明顯梯狀分布說明擴(kuò)增成功；(2)焦磷酸鎂作為L(zhǎng)AMP的副產(chǎn)物是一種肉眼可見的白色沉淀，可以直接通過肉眼判斷確定有沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)反應(yīng)后在體系中加入SYBR GREEN I 1-2 μ L，如果體系中顏色呈橙色，說明擴(kuò)增失?。蝗绻伾示G色，說明存在擴(kuò)增產(chǎn)物。當(dāng)樣品中只含有一種待測(cè)核酸時(shí)，LAMP技術(shù)簡(jiǎn)單快速易用；但是，利用現(xiàn)有LAMP技術(shù)對(duì)樣品中可能存在的幾種核酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，上述判定方法只能區(qū)分樣品中是否含有待測(cè)的核酸，卻無(wú)法區(qū)分含有幾種，或具體哪幾種，檢測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確。因此，迫切需要一種新的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，該方法能夠同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸，并且能根據(jù)檢測(cè)結(jié)果區(qū)分待測(cè)樣品中具有哪幾種核酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中同時(shí)檢測(cè)多種核酸時(shí)，不能準(zhǔn)確區(qū)分待測(cè)樣品中含有哪幾種核酸的問題。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，包括以下步驟A.利用與多種靶標(biāo)核酸分別對(duì)應(yīng)的引物，在同一反應(yīng)體系中，對(duì)待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行多種靶標(biāo)核酸的LAMP擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；與每種靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的引物中的至少一條帶有標(biāo)記物，各靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的弓I物所帶的標(biāo)記物不同；B.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物所攜帶的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)標(biāo)記物的檢測(cè)結(jié)果判定待測(cè)樣品中所含有的靶標(biāo)核酸的種類。其中，所述步驟B之前還包括步驟CN 102586439 A B’ .對(duì)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)之后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到帶標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，所述步驟A之前還包括步驟A’ .對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理，得到待測(cè)靶標(biāo)核酸處理液。進(jìn)一步的，所述步驟A’中的對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理的方法采用凍融處理、通透處理和核酸提取中的至少一種。其中，上述步驟A’中對(duì)樣品進(jìn)行處理，其目的是使待測(cè)多種核酸的序列能夠暴露于后續(xù)的擴(kuò)增體系中，能夠讓帶有不同標(biāo)記的引物結(jié)合其上順利進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。其中，所述步驟A中的標(biāo)記物，與引物結(jié)合的連接形式為R1-R-R2，其中Rl為引物上攜帶的末端基團(tuán)，R2為標(biāo)記物上所攜帶的末端基團(tuán)，R則為Rl與R2之間形成的化學(xué)鍵或中間偶聯(lián)劑。其中，上述步驟A中的標(biāo)記物，包括但不限于放射性物質(zhì)、抗原、半抗原、抗體、 酶、生物素、寡核苷酸標(biāo)簽或熒光標(biāo)記物。其中，所述標(biāo)記物為寡核苷酸標(biāo)簽，該寡核苷酸標(biāo)簽優(yōu)選位于內(nèi)引物中。所述內(nèi)引物如圖I中所示，以FIP為例，該內(nèi)引物包含F(xiàn)lc序列和F2-(F2c區(qū)域的互補(bǔ)序列)兩部分， 即5' -F1C-F2，其互補(bǔ)靶標(biāo)序列相對(duì)外引物F3的位于靶標(biāo)序列內(nèi)部，因此稱為內(nèi)引物。當(dāng)寡核苷酸標(biāo)簽位于內(nèi)引物時(shí)，只能位于內(nèi)引物中Flc與F2兩部分連接的中間位置。進(jìn)一步的，若上述標(biāo)記物為寡核苷酸標(biāo)簽，則步驟B中所述檢測(cè)方法采用熒光探針雜交法、基因測(cè)序法中的至少一種；若上述標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物，則步驟B中所述檢測(cè)方法采用光譜分離法。上述光譜分離法是指利用不同熒光標(biāo)記物的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜不同的特點(diǎn)，采用多色分光儀進(jìn)行光譜分離從而準(zhǔn)確區(qū)分?jǐn)U增物的方法。其中，上述待測(cè)樣品包括但不限于食源性致病菌、病毒或臨床檢測(cè)樣品。其中，上述步驟A中擴(kuò)增反應(yīng)體系中包含有尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil-DNA Glycocasylase, UDG)。由上可知，本發(fā)明所述同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，通過LAMP技術(shù)在同一反應(yīng)體系中同時(shí)快速檢測(cè)多種靶標(biāo)核酸，根據(jù)待測(cè)的多種靶標(biāo)核酸設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)帶標(biāo)記物的引物，擴(kuò)增完成之后，通過檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物上攜帶的標(biāo)記物進(jìn)行判斷，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確區(qū)分待測(cè)樣品中含有哪幾種靶標(biāo)核酸的目的；同時(shí)在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)DG酶，防止假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn)， 確保檢測(cè)結(jié)果的正確性。


圖I是LAMP反應(yīng)原理示意圖；圖2是本發(fā)明一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法流程圖；圖3是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法流程圖；圖4是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法流程圖；圖5是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)
4本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖2示出了本發(fā)明一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，包括以下步驟SI.利用與多種靶標(biāo)核酸分別對(duì)應(yīng)的引物，在同一反應(yīng)體系中，對(duì)待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行多種靶標(biāo)核酸的LAMP擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；與每種靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的引物中的至少一條帶有標(biāo)記物，各靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的弓I物所帶的標(biāo)記物不同；S2.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物所攜帶的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)標(biāo)記物的檢測(cè)結(jié)果判定待測(cè)樣品中所含有的靶標(biāo)核酸的種類。本發(fā)明所述同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法的優(yōu)點(diǎn)在于利用LAMP擴(kuò)增技術(shù)在同一反應(yīng)體系中同時(shí)快速檢測(cè)多種靶標(biāo)核酸，根據(jù)待測(cè)的多種靶標(biāo)核酸設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)帶不同標(biāo)記物的引物，擴(kuò)增結(jié)束后，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物上所攜帶的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而判斷有哪些帶標(biāo)記的引物得到了擴(kuò)增，從而根據(jù)引物與靶標(biāo)核酸之間的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系準(zhǔn)確區(qū)分待測(cè)樣品中含有哪幾種靶標(biāo)核酸。需要說明的是步驟SI中，所述多種靶標(biāo)核酸是指待測(cè)樣品中所包含的多種待測(cè)核酸，包括直接得到的或者是經(jīng)過處理間接得到的，其種類包括但不限于基因組DNA、RNA或cDNA。所述待測(cè)樣品包括但不限于食源性致病菌、病毒或臨床檢測(cè)樣品。在本步驟之前還可以包括對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理的步驟，所述對(duì)樣品進(jìn)行處理的目的在于使待測(cè)樣品中的多種靶標(biāo)核酸序列能夠暴露于后續(xù)的擴(kuò)增體系中，能夠讓帶標(biāo)記物的引物結(jié)合其上并順利進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。對(duì)于處理方法，只要能滿足上述目的即可，結(jié)合后續(xù)圖示將給出不同的優(yōu)選處理方法。步驟SI中所述的引物對(duì)應(yīng)于不同靶標(biāo)核酸，兩者之間一一對(duì)應(yīng)；且對(duì)應(yīng)每一種靶標(biāo)核酸的引物中的至少一條引物帶有標(biāo)記物，引物與標(biāo)記物之間也一一對(duì)應(yīng)，即不同靶標(biāo)核酸的引物所帶的標(biāo)記物不同。所述標(biāo)記物，可以使用已知的標(biāo)記物和方法與引物結(jié)合，其結(jié)合的方式以及結(jié)合的位置可以多變，原則上只要不抑制引物與模板鏈結(jié)合以及后續(xù)的延伸反應(yīng)。標(biāo)記物可以為多種物質(zhì)，包括但不限于放射性物質(zhì)、抗原、半抗原、抗體、酶、生物素、寡核苷酸標(biāo)簽或熒光標(biāo)記物。標(biāo)記物與引物之間一一對(duì)應(yīng)，兩者結(jié)合后的連接形式為R1-R-R2，其中Rl為引物上攜帶的末端基團(tuán)，R2為標(biāo)記物上所攜帶的末端基團(tuán)，R則為Rl與R2之間形成的化學(xué)鍵或中間偶聯(lián)劑。上述末端基團(tuán)是指暴露于引物或標(biāo)記物外表，能用于連接的基團(tuán)。其中，Rl為抗體攜帶的羧基或氨基；R2為寡核苷酸標(biāo)簽上攜帶的修飾基團(tuán)如氨基、羧基或生物素等洱為酰胺鍵或中間偶聯(lián)劑如均苯三甲酸(TMA)、N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)、N，N’ -二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基乙胺(DIEA)等。若R為Rl和R2形成的化學(xué)鍵在一個(gè)實(shí)施例中，Rl選用抗體上所攜帶的氨基，而寡核苷酸標(biāo)簽經(jīng)過羧基化修飾，從而R2為寡核苷酸標(biāo)簽上的羧基，R則為二者形成的酰胺鍵。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗體經(jīng)過鏈霉親和素修飾，Rl為抗體上所帶的鏈霉親和基團(tuán)，而寡核苷酸標(biāo)簽經(jīng)過生物素修飾，R2為生物素基團(tuán)，R為鏈霉親和生物素融合體。若R為中間偶聯(lián)劑中間偶聯(lián)劑可以包括均苯三甲酸(TMA)、N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶液、二異丙基乙胺(DIEA)的至少一種。在一個(gè)實(shí)施例中，R選用NHS，通過NHS將抗體與寡核苷酸標(biāo)簽偶聯(lián)在一起。對(duì)于標(biāo)記物與引物結(jié)合位置的選擇，同樣遵循不抑制引物與模板鏈結(jié)合以及后續(xù)的延伸反應(yīng)作為原則。因此，當(dāng)標(biāo)記物標(biāo)記外引物時(shí)，優(yōu)選位于外引物的5’端。若標(biāo)記物標(biāo)記內(nèi)引物，則視所用的標(biāo)記物而定在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所用的標(biāo)記物為寡核苷酸標(biāo)簽，且標(biāo)記在內(nèi)引物上，所述內(nèi)引物如圖I中所示，以FIP為例，該內(nèi)引物包含F(xiàn)lc序列和 F2(F2c區(qū)域的互補(bǔ)序列)兩部分，即5' -F1C-F2，其互補(bǔ)靶標(biāo)序列相對(duì)外引物F3的位于靶標(biāo)序列內(nèi)部，因此稱為內(nèi)引物。當(dāng)標(biāo)記物為寡核苷酸標(biāo)簽且位于內(nèi)引物時(shí)，只能位于內(nèi)引物中Flc與F2兩部分連接的中間位置；在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，采用除寡核苷酸標(biāo)簽之外的標(biāo)記物如熒光標(biāo)記物標(biāo)記內(nèi)引物，所述熒光標(biāo)記物優(yōu)選位于內(nèi)引物的5 ’端，當(dāng)然，位于內(nèi)弓I物序列的其他位置也是可行的。在LAMP擴(kuò)增反應(yīng)中，可采用任意能夠進(jìn)行鏈置換反應(yīng)的DNA聚合酶。所述DNA聚合酶可以是完整的酶或其生物學(xué)活性片段。所述酶包括但不限于Bst DNA聚合酶、Vent DNA 聚合酶、Vent (不帶外切酶活性)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent (不帶外切酶活性)DNA聚合酶、Klenow聚合酶、Phi29聚合酶、9°Nm DNA聚合酶。當(dāng)待測(cè)靶標(biāo)核酸為RNA，可以在進(jìn)行LAMP擴(kuò)增之前利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，也可以直接在LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入適宜的逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP)。所述逆轉(zhuǎn)錄酶包括但不限于禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒(AWV)逆轉(zhuǎn)錄酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶、MonsterScript逆轉(zhuǎn)錄酶、Accuscript逆轉(zhuǎn)錄酶、 AffinityScript逆轉(zhuǎn)錄酶、ImProm-II逆轉(zhuǎn)錄酶、Thermoscript逆轉(zhuǎn)錄酶，以及上述逆轉(zhuǎn)錄酶的任何遺傳改變形式或變體。步驟SI中，所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系中，除加入必需的擴(kuò)增試劑外，還可以加入U(xiǎn)DG 酶，以便消除假陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果。在步驟S2開始之前，為了保證后續(xù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化的方式利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的常用方法即可，如蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降、柱層析分離、凝膠電泳純化等，也可直接利用商品化的PCR清潔試劑盒實(shí)現(xiàn)純化，將未反應(yīng)的引物、dNTP等與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離。步驟S2中，所述檢測(cè)的方法根據(jù)之前所使用的標(biāo)記物，采用與之對(duì)應(yīng)的特異性方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物上所帶的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，然后根據(jù)檢測(cè)得到的結(jié)果可以判斷待測(cè)樣品中所含有的靶標(biāo)核酸有哪幾種。以下將結(jié)合后續(xù)的圖示及具體實(shí)施例對(duì)上述本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)以及具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)闡述。圖3示出了本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法流程，該方法包括S101.從待測(cè)樣品中提取核酸，得到待測(cè)核酸處理液；S102.利用與多種靶標(biāo)核酸分別對(duì)應(yīng)的引物，在同一反應(yīng)體系中，對(duì)待測(cè)核酸處理液同時(shí)進(jìn)行多種靶標(biāo)核酸的LAMP擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；每一種引物中的至少一條帶有寡核苷酸標(biāo)簽，各靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的引物所帶的寡核苷酸標(biāo)簽不同；S103.檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物上的寡核苷酸標(biāo)簽得到檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷待測(cè)樣品中含有的靶標(biāo)核酸種類。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于能夠多種靶標(biāo)核酸在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，然后利用與引物一一對(duì)應(yīng)的寡核苷酸標(biāo)簽，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物上帶有的寡核苷酸標(biāo)簽，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得到與引物一一對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)核酸的種類。需要說明的是步驟SlOl中，樣品的處理方法采用直接從待測(cè)樣品中提取DNA或RNA的方式，得到待測(cè)核酸處理液。而提取DNA或RNA的方法可以采用常規(guī)的任意方法進(jìn)行。步驟S102中，引物的設(shè)計(jì)與多種靶標(biāo)核酸之間一一對(duì)應(yīng)，每一種引物對(duì)應(yīng)一種靶標(biāo)核酸，而寡核苷酸標(biāo)簽與引物之間一一對(duì)應(yīng)，從而使得靶標(biāo)核酸與寡核苷酸標(biāo)簽之間也
--對(duì)應(yīng)。根據(jù)LAMP擴(kuò)增的特性，本步驟中使用寡核苷酸標(biāo)簽作為標(biāo)記物，若寡核苷酸標(biāo)簽標(biāo)記內(nèi)引物，所述寡核苷酸標(biāo)簽只能位于內(nèi)引物的Flc和F2兩部分核苷酸連接的中間，且至少有一條內(nèi)弓I物被標(biāo)記。此外，在LAMP擴(kuò)增反應(yīng)中加入U(xiǎn)DG酶，可以消除假陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果。LAMP擴(kuò)增結(jié)束之后，為保證后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化的方式利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的常用方法，如蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降、柱層析分離、凝膠電泳純化等，也可直接利用商品化的PCR清潔試劑盒實(shí)現(xiàn)純化，將未反應(yīng)的引物、dNTP等與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離。步驟S103中，根據(jù)LAMP擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶有寡核苷酸標(biāo)簽，通過熒光探針雜交法或基因測(cè)序法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)得到檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷，從而可以得到其中所含的靶標(biāo)核酸種類。其中，所述熒光探針雜交法，是指利用與寡核苷酸標(biāo)簽互補(bǔ)且?guī)в胁煌瑹晒鈽?biāo)記的熒光探針與寡核苷酸標(biāo)簽雜交，通過檢測(cè)熒光探針?biāo)l(fā)出的熒光判斷出擴(kuò)增產(chǎn)物的種類，進(jìn)而得知靶標(biāo)核酸種類的方法。所述熒光探針與寡核苷酸標(biāo)簽之間也一一對(duì)應(yīng)，以保證雜交結(jié)果的正確性與唯一性。所述基因測(cè)序法，是利用堿基互補(bǔ)原則對(duì)寡核苷酸標(biāo)簽進(jìn)行堿基序列測(cè)定，例如合成測(cè)序法或連接測(cè)序法，然后根據(jù)得到的堿基序列確定寡核苷酸標(biāo)簽，進(jìn)而判斷出所測(cè)靶標(biāo)核酸的種類。所述基因測(cè)序的方法，包括但不限于sanger測(cè)序法、合成測(cè)序法或連接測(cè)序法。所述合成測(cè)序法，是利用與寡核苷酸標(biāo)簽互補(bǔ)的測(cè)序引物，通過DNA聚合酶以及帶可去除標(biāo)記的四種核苷酸混合物進(jìn)行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集加入核苷酸的標(biāo)記信號(hào)， 即可得到相應(yīng)堿基的序列信號(hào)，從而達(dá)到通過合成測(cè)序法采集所述寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)的目的。所述連接測(cè)序法，則是利用含數(shù)個(gè)堿基對(duì)的帶熒光標(biāo)記的核酸探針以及連接酶的作用，采集連接到寡核苷酸標(biāo)簽上的探針的熒光信號(hào)，再切除熒光探針，反復(fù)測(cè)定得到寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)。對(duì)于圖3所示的本發(fā)明的技術(shù)方案，下面將給出具體實(shí)施例加以詳細(xì)闡述。在步驟SlOl的一個(gè)實(shí)施例中，步驟SlOl具體實(shí)施如下以志賀氏菌及沙門氏菌為檢測(cè)對(duì)象，首先對(duì)樣品進(jìn)行常規(guī)液體培養(yǎng)(37°C，12h) 至渾池，取菌液 ImL, 12000rpm 離心 5min,然后以 I X TE (IOmM Tris-HCl ImM EDTA pH = 8. O)緩沖液洗滌重懸，再次12000rpm離心5min，沉淀加入200 μ L ddH20重懸混勻，沸水浴12min,然后冰浴5min, 12000rpm離心5min,取上清即為含有待測(cè)核酸的處理液。應(yīng)當(dāng)說明的是，本實(shí)施例僅是本發(fā)明的步驟SlOl中的一個(gè)實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在步驟S102的一個(gè)實(shí)施例中，步驟S102具體實(shí)施如下以沙門氏菌高度保守的invA基因和志賀氏菌高度保守的ipaH基因作為靶基因， 設(shè)計(jì)兩套用于擴(kuò)增這兩個(gè)基因部分序列的特異性引物，每套2對(duì)。采用寡核苷酸標(biāo)簽作為標(biāo)記物，在合成引物時(shí)，直接通過在每套引物中的一條內(nèi)引物的中間位置分別連上寡核苷酸標(biāo)簽I、II的方式進(jìn)行標(biāo)記。最后使用的兩套引物分別如下所示(I)沙門氏菌invA基因特異性擴(kuò)增引物invA-F3 (SEQ ID NO:I) :5，-GCGGCCCGATTTTCTCTG-3，；invA-B3 (SEQ ID NO 2) :5，-CCACCGAAATACCGCCAAT-3，；invA-FIP (SEQ ID NO :3)5， -GCGCGGCATCCGCATCAATAAGCTCGGACTCTAGCATGGTATGCCCGGTAAACAG-3，；invA-BIP (SEQ ID NO :4)5’ -AGGGAAAGCCAGCTTTACGGTT-ATGATGCCGGCAATAGCG-3’。其中，引物invA-FIP的中間位置帶有寡核苷酸標(biāo)簽I (SEQ ID NO :13)。(2)志賀氏菌ipaH基因特異性擴(kuò)增引物ipaH-F3 (SEQ ID NO :5) :5，-GCATGCCAACACCTTTTCC-3，；ipaH-B3 (SEQ ID NO :6) :5，-TGATGGACCAGGAGGGTT-3，；ipaH-FIP (SEQ ID NO :7)5’ -CGACCTGTTCACGGAATCCGGGCTACGCTGTCAGCACTTGACCGCCTTTCCGATAC-3’ ；ipaH-BIP (SEQ ID NO :8)5’ -TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3’。其中，引物ipaH-FIP的中間位置帶有寡核苷酸標(biāo)簽II (SEQ ID NO 14)。本實(shí)施例所用LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系如下IOXBst buffer (200mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)，IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2S04，20mM MgSO4,0. I % Triton X-100), 2. 5 μ L ；混合引物(FIP BIP F3 B3 = 40 μ M 40 μ M 5μΜ 5 μ Μ)，I μ L ;dNTP (各 10mM)，3.5yL;4Μ甜菜堿，2yL;UDG 酶，IU ; 待測(cè)核酸處理液，6 μ L ;Bst DNA 聚合酶，8U ;ddH20 加至 25yL。反應(yīng)過程為首先將除Bst DNA聚合酶外的試劑混勻，95°C加熱5min，冷卻后加入 8U Bst DNA聚合酶；63°C反應(yīng)lh，然后80°C加熱lOmin，完成LAMP擴(kuò)增，然后以柱層析的方法分離未反應(yīng)的混合引物，緩沖液重懸得到分離純化的擴(kuò)增產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)說明的是，本實(shí)施例僅是本發(fā)明步驟S102中的一個(gè)具體實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，例如在兩條內(nèi)引物上同時(shí)進(jìn)行寡核苷酸標(biāo)簽的標(biāo)記，同樣可以實(shí)現(xiàn)。
在步驟S103的一個(gè)實(shí)施例中，步驟S103具體實(shí)施如下首先根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果中是否出現(xiàn)白色沉淀判斷是否得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，若無(wú)白色沉淀，則說明沒有檢測(cè)到待測(cè)靶標(biāo)核酸，不需再進(jìn)行后續(xù)操作；若有白色沉淀出現(xiàn)，說明至少有一種待測(cè)靶標(biāo)核酸被檢測(cè)到，需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)判斷到底是哪幾種待測(cè)靶標(biāo)核酸。在本步驟的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)之前引物合成時(shí)連在5’端的寡核苷酸標(biāo)簽，合成帶有CY3標(biāo)記的熒光探針I(yè) (SEQ ID NO : 15)，對(duì)應(yīng)于寡核苷酸標(biāo)簽I ;以及帶有TR標(biāo)記的熒光探針I(yè)I(SEQ ID NO :16)，對(duì)應(yīng)于寡核苷酸標(biāo)簽II ;同時(shí)合成熒光探針的時(shí)候，對(duì)其非熒光標(biāo)記的一端進(jìn)行生物素化標(biāo)記。將合成的熒光探針加入純化之后的擴(kuò)增產(chǎn)物中進(jìn)行雜交，然后雜交產(chǎn)物利用柱層析分離的方法，去掉未反應(yīng)的熒光探針，截留物以緩沖液洗脫重懸，然后汞燈條件下檢測(cè)顯色，若只檢測(cè)到綠光，則說明檢測(cè)到與CY3雜交結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽I，進(jìn)而說明只含有沙門氏菌irwA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)樣品中只含有沙門氏菌；若只檢測(cè)到黃光，則說明只檢測(cè)到與TR雜交結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽II，進(jìn)而說明只含有志賀氏菌ipaH基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)樣品中只含有志賀氏菌；若綠光與黃光都能檢測(cè)到，則說明待測(cè)樣品中沙門氏菌和志賀氏菌都存在。在本步驟的另一個(gè)實(shí)施方案中，利用基因測(cè)序法對(duì)寡核苷酸標(biāo)簽進(jìn)行堿基序列的測(cè)定，通過得到的堿基序列直接判斷寡核苷酸標(biāo)簽，進(jìn)而判斷對(duì)應(yīng)的是哪一種或哪幾種靶標(biāo)核酸。利用基因測(cè)序法對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，可以將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物隨即酶切成小片段，然后在片段兩端接上接頭元件，利用接頭元件進(jìn)行測(cè)序引物的結(jié)合，加入四種堿基進(jìn)行合成測(cè)序，得到各片段的堿基序列，通過生物信息技術(shù)對(duì)其進(jìn)行處理，可以得到擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列，從而可以得知擴(kuò)增產(chǎn)物所攜帶的寡核苷酸標(biāo)簽的序列信息，進(jìn)而根據(jù)寡核苷酸標(biāo)簽去確定待測(cè)樣品中靶標(biāo)核酸的種類。應(yīng)當(dāng)說明的是，上述實(shí)施方案僅是步驟S103中的一些具體實(shí)施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖4示出了本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法流程，該方法包括S201.對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行通透處理，得到待測(cè)核酸處理液；S202.利用與多種靶標(biāo)核酸分別對(duì)應(yīng)的引物，在同一反應(yīng)體系中，對(duì)待測(cè)核酸處理液同時(shí)進(jìn)行多種靶標(biāo)核酸的LAMP擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；每一種引物中的至少一條帶有熒光標(biāo)記物，各靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的弓I物所帶的熒光標(biāo)記物不同；S203.檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物上的熒光標(biāo)記物得到檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷待測(cè)樣品中含有的靶標(biāo)核酸種類。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)樣品進(jìn)行通透處理，不再?gòu)闹刑崛“袠?biāo)核酸，在一定程度上簡(jiǎn)化操作；利用與靶標(biāo)核酸一一對(duì)應(yīng)的引物上所帶的熒光標(biāo)記物，其標(biāo)記位置更加靈活多變；同時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物上所攜帶的熒光標(biāo)記物，根據(jù)檢測(cè)得到的結(jié)果判斷LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物， 進(jìn)而得到具體靶標(biāo)核酸的種類。需要說明的是步驟S201中，所述對(duì)樣品進(jìn)行處理，是指不必提取樣品中的核酸，而是利用物理或化學(xué)的方法對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行處理增加其細(xì)胞膜的通透性使得細(xì)胞內(nèi)的核酸能夠穿過細(xì)胞膜到達(dá)體外與引物發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，或通過凍融裂解細(xì)胞使樣品中的核酸暴露出來(lái)。本發(fā)明可以采用常用的方法對(duì)樣品進(jìn)行通透處理，包括但不限于化學(xué)法如有機(jī)溶劑法、抗生素法；物理法如空氣干燥、滲透壓沖擊、溫度沖擊、超聲波處理以及PH擾動(dòng)。步驟S202中，熒光標(biāo)記物與引物一一對(duì)應(yīng)，而引物與多種靶標(biāo)核酸之間一一對(duì)應(yīng)，每一種引物對(duì)應(yīng)一種靶標(biāo)核酸，從而使得熒光標(biāo)記物與靶標(biāo)核酸也一一對(duì)應(yīng)。本步驟中，標(biāo)記物采用熒光標(biāo)記物，其標(biāo)記位置靈活多變。在本步驟的一個(gè)實(shí)施例中，利用熒光標(biāo)記物標(biāo)記外引物，其位置優(yōu)選位于外引物的5’端，同時(shí)還可以位于外引物其他位置。在本步驟的另一個(gè)實(shí)施例中，利用熒光標(biāo)記物標(biāo)記內(nèi)引物，其位置優(yōu)選于內(nèi)引物中間位置，同時(shí)也可以位于內(nèi)引物其他位置。在步驟S203開始之前，為了消除未反應(yīng)的引物所帶的熒光標(biāo)記對(duì)后續(xù)檢測(cè)造成干擾，需要對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)之后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化的方式利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的常用方法即可，如蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降、柱層析分離等，可直接利用商品化的PCR清潔試劑盒實(shí)現(xiàn)純化，將未反應(yīng)的引物與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離。步驟S203中，根據(jù)對(duì)引物進(jìn)行熒光標(biāo)記的是熒光標(biāo)記物，所述檢測(cè)方法采用光譜分離法。所述光譜分離法，是利用所使用的熒光標(biāo)記物不同，其激發(fā)/發(fā)射光譜不同，通過多色分光儀分離它們的光譜檢測(cè)熒光信號(hào)，或直接利用熒光顯微鏡發(fā)出不同波長(zhǎng)的激發(fā)光，激發(fā)熒光標(biāo)記物發(fā)出不同波長(zhǎng)的波譜，檢測(cè)收集不同的熒光信號(hào)，然后根據(jù)檢測(cè)得到的熒光信號(hào)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的種類，進(jìn)而判斷對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)核酸的種類。對(duì)于圖4所示的本發(fā)明的技術(shù)方案，下面將給出具體實(shí)施例加以詳細(xì)闡述。在步驟S201的一個(gè)實(shí)施例中，步驟S201具體實(shí)施如下將待測(cè)樣品放入-80°C冰箱冷凍，取出自然融化，反復(fù)凍融數(shù)次，然后進(jìn)行離心分離，取上清液得到待測(cè)核酸處理液。應(yīng)當(dāng)說明的是，本實(shí)施例僅是本發(fā)明的步驟S201中的一個(gè)實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在步驟S202的一個(gè)實(shí)施例中，步驟S202具體實(shí)施如下以高度保守的沙門氏菌invA基因、志賀氏菌ipaH基因和金黃色葡萄球菌的clfA 基因作為靶標(biāo)基因，設(shè)計(jì)三套用于擴(kuò)增上述三個(gè)基因序列的特異性引物，每套2對(duì)。同時(shí)在合成引物時(shí)，通過中間偶聯(lián)劑亞磷酰胺試劑將熒光標(biāo)記物_CY3、-FITC和-Texas Red(-TR) 分別標(biāo)記到每套引物中的一條內(nèi)引物的5’端，所述引物分別如下所示(I)沙門氏菌invA基因特異性擴(kuò)增引物invA-F3 (SEQ ID NO :1) :5，-GCGGCCCGATTTTCTCTG-3，；invA-B3 (SEQ ID NO :2) :5，-CCACCGAAATACCGCCAAT-3，；invA-FIP (SEQ ID NO :3)5’ -CY3GCGCGGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAG-3’ ；invA-BIP (SEQ ID NO :4)5，-AGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTATGATGCCGGCAATAGCG-3，。(2)志賀氏菌ipaH基因特異性擴(kuò)增引物ipaH-F3 (SEQ ID NO :5) :5，-GCATGCCAACACCTTTTCC-3，；ipaH-B3 (SEQ ID NO :6) :5，-TGATGGACCAGGAGGGTT-3，；
ipaH-FIP (SEQ ID NO :7)5’ -FITC-CGACCTGTTCACGGAATCCGGCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3’ ；ipaH-BIP (SEQ ID NO :8)5，-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3，。(3)金黃色葡萄球菌clfA基因異性擴(kuò)增引物clfA-F3 (SEQ ID NO :9) :5，-GCATGCCAACACCTTTTCC-3’ ；clfA-B3 (SEQ ID NO :10) :5，-TGATGGACCAGGAGGGTT-3J ；clfA-FIP (SEQ ID NO :11)5’ -TR-CGACCTGTTCACGGAATCCGGCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3’ ；clfA-BIP (SEQ ID NO :12)5，-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3，。本實(shí)施中所用LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系如下IOXBst buffer (200mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)，IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2S04，20mM MgSO4,0. I % Triton X-100)，3 μ L ;混合引物(FIP BIP F3 B3 = 40 μ M 40 μ M 5μΜ 5yM),1.5yL；dNTP(各 10mM)，4yL;4M甜菜堿，2yL;UDG 酶，IU ;待測(cè)核酸處理液，6 μ L ；Bst DNA 聚合酶，8U ;ddH20 加至 25yL。反應(yīng)過程為首先將除Bst DNA聚合酶外的試劑混勻，95°C加熱5min，冷卻后加入 8U Bst DNA聚合酶；65°C反應(yīng)lh，然后80°C加熱15min，完成LAMP擴(kuò)增，然后以柱層析的方法分離未反應(yīng)的混合引物，緩沖液重懸得到分離純化的擴(kuò)增產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)說明的是，本實(shí)施例僅是本發(fā)明的步驟S202中的一個(gè)實(shí)施例，對(duì)于本發(fā)明的保護(hù)范圍不做任何具體的限制，如熒光標(biāo)記物的標(biāo)記位置位于內(nèi)引物的中間位置同樣可以實(shí)現(xiàn)本步驟。 在步驟S203的一個(gè)實(shí)施例中，步驟S203具體實(shí)施如下首先根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果中是否出現(xiàn)白色沉淀判斷是否得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，若無(wú)白色沉淀，則說明沒有檢測(cè)到靶標(biāo)核酸，不需再進(jìn)行后續(xù)操作；若有白色沉淀出現(xiàn)，說明至少有一種靶標(biāo)核酸被檢測(cè)到，需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)判斷到底是哪一種靶標(biāo)核酸。根據(jù)之前引物合成時(shí)連在5’端的熒光標(biāo)記物，利用多色分光儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行光譜分離。所用熒光標(biāo)記物的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜分別為_CY3，550/570 ;_FITC， 490/520 ;-TR，583/603。根據(jù)所分離得到的光譜圖以及引物與熒光標(biāo)記及靶標(biāo)核酸的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，若光譜圖中發(fā)射光譜只有570nm波峰，說明待測(cè)樣品中只含有沙門氏菌；若光譜圖中發(fā)射光譜只有520波峰，說明待測(cè)樣品中只含有志賀氏菌；若光譜圖中發(fā)射光譜只有 603波峰，說明待測(cè)樣品中只含有金黃色葡萄球菌；其他情形，以此類推進(jìn)行判斷。應(yīng)當(dāng)說明的是，本實(shí)施例僅是本發(fā)明的步驟S203中的一個(gè)具體實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
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圖5為本發(fā)明一實(shí)施例中同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸并利用基因測(cè)序法鑒別檢測(cè)結(jié)果的方法示意圖。該圖直觀的展示了利用LAMP在同一反應(yīng)體系中同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸后通過基因測(cè)序法鑒別檢測(cè)結(jié)果的過程步驟I.將樣品進(jìn)行常規(guī)液體培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)菌液中直接提取DNA，得到含有多種待測(cè)靶標(biāo)DNA的處理液。步驟2.根據(jù)多種待測(cè)靶標(biāo)DNA設(shè)計(jì)分別相對(duì)應(yīng)的LAMP擴(kuò)增特異性引物，在引物合成時(shí)利用對(duì)應(yīng)的寡核苷酸標(biāo)簽在內(nèi)引物中Flc與F2兩部分的中間進(jìn)行標(biāo)記,然后利用處理液與特異性引物配制LAMP反應(yīng)體系，并加入U(xiǎn)DG酶，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)過層析柱純化，將未反應(yīng)的特異性引物去除，得到帶有寡核苷酸標(biāo)簽的擴(kuò)增產(chǎn)物。步驟3.將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段化處理，接上接頭，結(jié)合測(cè)序引物，利用基因測(cè)序法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列，從而可以得知寡核苷酸標(biāo)簽的堿基序列，根據(jù)檢測(cè)得到的寡核苷酸標(biāo)簽序列信息，以及寡核苷酸標(biāo)簽與靶標(biāo)DNA之間一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，直接判斷待測(cè)樣品中所含有的靶標(biāo)DNA種類。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明對(duì)多種核酸同時(shí)進(jìn)行快速檢測(cè)的方法典型的應(yīng)用于生物樣品檢測(cè)與鑒別，但不限于生物樣品的檢測(cè)與鑒別，任何其他類似的應(yīng)用均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.利用與多種靶標(biāo)核酸分別對(duì)應(yīng)的引物，在同一反應(yīng)體系中，對(duì)待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行多種靶標(biāo)核酸的LAMP擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；與每種靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的引物中的至少一條帶有標(biāo)記物，各靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的引物所帶的標(biāo)記物不同；B.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物所攜帶的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)標(biāo)記物的檢測(cè)結(jié)果判定待測(cè)樣品中所含有的靶標(biāo)核酸的種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，所述步驟B之前還包括步驟B’ .對(duì)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)之后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到帶標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，所述步驟A之前還包括步驟A’ .對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理，得到待測(cè)靶標(biāo)核酸處理液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，所述步驟A’中的對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理的方法采用凍融處理、通透處理和核酸提取中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，所述步驟A中的標(biāo)記物采用放射性物質(zhì)、抗原、半抗原、抗體、酶、生物素、寡核苷酸標(biāo)簽和熒光物質(zhì)中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物為寡核苷酸標(biāo)簽，該寡核苷酸標(biāo)簽位于內(nèi)引物中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，若所述標(biāo)記物為寡核苷酸標(biāo)簽，則步驟B中所述檢測(cè)方法采用熒光探針雜交法和基因測(cè)序法中的至少一種；若所述標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物，則步驟B中所述檢測(cè)方法采用光譜分離法。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)所述的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品包括食源性致病菌、病毒和臨床檢測(cè)樣品中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)所述的同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，其特征在于，所述步驟A中的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中包含有尿嘧啶DNA糖基化酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物樣品的檢測(cè)與鑒別，提供了一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法。一種同時(shí)快速檢測(cè)多種核酸的方法，包括步驟A.利用與多種靶標(biāo)核酸分別對(duì)應(yīng)的引物，在同一反應(yīng)體系中，對(duì)待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行多種靶標(biāo)核酸的LAMP擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；與每種靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的引物中的至少一條帶有標(biāo)記物，各靶標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的引物所帶的標(biāo)記物不同；B.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物所攜帶的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)標(biāo)記物的檢測(cè)結(jié)果判定待測(cè)樣品中所含有的靶標(biāo)核酸的種類。本發(fā)明通過LAMP技術(shù)在同一反應(yīng)體系中同時(shí)快速檢測(cè)多種靶標(biāo)核酸，利用靶標(biāo)核酸與引物及引物上所帶標(biāo)記物一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行判斷，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確區(qū)分待測(cè)樣品中含有哪幾種靶標(biāo)核酸的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586439SQ201210047890
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者盛司潼 申請(qǐng)人:盛司潼