專利名稱：一株產(chǎn)苯乳酸的菌株及該菌發(fā)酵法制備苯乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能夠產(chǎn)苯乳酸的片球菌屬乳酸菌，更具體地說，本發(fā)明涉及一種戍糖片球菌{PediococcusSK25發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化制備苯乳酸的方法,屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展以及人們對(duì)食品安全性要求的提高，天然食品防腐劑的研究與開發(fā)已成為食品工業(yè)的研究熱點(diǎn)之一，也是今后防腐劑發(fā)展的主要方向。天然食品防腐劑按其來源的不同可分為植物源天然防腐劑、動(dòng)物源天然防腐劑以及微生物源天然防腐劑等類型，其中微生物源防腐劑又常被稱為生物抗菌劑?，F(xiàn)已從微生物中得到的天然防腐劑有細(xì)菌素類的乳酸菌素和放線菌類的納他霉素、霉菌類的米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的曲酸以及某些酵母菌、真菌、食用菌和聚賴氨酸等。開發(fā)研制來自微生物的天然食品防腐劑是尋求新型防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)的重要方向。目前新型微生物源天然食品防腐劑主要有5種，包括乳球菌肽、溶菌酶、聚賴氨酸、苯乳酸及曲酸。其中苯乳酸(phenyllactic acid)作為一種新型天然抗菌物質(zhì)，與其它新型防腐劑相比有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，它是一種小分子物質(zhì)，抑菌譜寬、穩(wěn)定性高。一般常見生物防腐劑如乳酸鏈球菌素等親水性差，不易擴(kuò)散。而苯乳酸的親水性卻較強(qiáng)，能夠在各種食品體系中均勻分散。苯乳酸對(duì)熱和酸的穩(wěn)定性也較好，熔點(diǎn)為121°C 125°C.并于121°C 條件下可保持20min不被破壞。其可在廣泛的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。研究表明苯乳酸對(duì)多種食源性致病菌如致病性大腸桿菌r&cAericAia coli 0157:H7),單增李斯特菌，金黃色葡萄球菌aureus、,腐敗菌包括產(chǎn)毒素的絲狀真菌如赭曲霉、撫孢青霉和桔青霉，有很強(qiáng)的抑菌作用，其抑菌活性強(qiáng)于常見的防腐劑。乳酸菌能產(chǎn)多種抑菌效果的物質(zhì)，如乳酸、醋酸、Nisin (乳鏈球菌素)等，部分已經(jīng)用于食品工業(yè)，如Nisin和納他霉素，但是存在諸如抑菌譜窄、理化性質(zhì)差等問題，如Nisin只能抑制除乳酸菌以外的G+細(xì)菌，而對(duì)絕大部分G—細(xì)菌、酵母菌和霉菌沒有作用；納他霉素只對(duì)霉菌有抑制作用。與Nisin和納他霉素相比，苯乳酸安全性高，是一種新型天然抑菌物質(zhì)、防腐劑，它存在于天然蜂蜜中，對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞無毒，作為一種新型生物防腐劑，苯乳酸在乳品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前苯乳酸的制備有化學(xué)催化合成以及生物轉(zhuǎn)化方法。化學(xué)合成法有許多不利的因素，例如產(chǎn)生多種副產(chǎn)物和化學(xué)污染物，而形成的眾多副產(chǎn)物又使分離、純化步驟變得復(fù)雜。近年來研究人員都在尋找生物轉(zhuǎn)化的方法來制備苯乳酸，由于乳酸菌是GRAS (公認(rèn)為安全)的微生物，用安全菌株合成苯乳酸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前關(guān)于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)苯乳酸的菌種很多，包括Zac tobacillus.、Weissella^ En terococcus^Leuconos toe 等都可以生物合成苯乳酸，然而片球菌屬乳酸菌的苯乳酸合成能力至今未知,本發(fā)明證明了片球菌(/fet/iococciAs)屬中的戍糖片球菌pentosaceus) 5 "具有產(chǎn)苯乳酸的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)苯乳酸的菌株，具體涉及片球菌(I>ediococcus')屬的一株乳酸菌戍糖片球菌(PediococcusSK25發(fā)酵轉(zhuǎn)化法獲得這種新型天然防腐劑，開拓了乳酸菌生物轉(zhuǎn)化制備苯乳酸的研究領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案一株產(chǎn)苯乳酸的片球菌屬乳酸菌，其分類命名為戍糖片球菌 {Pediococcus pentosaceus) SK25,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011360。用所述的CCTCC NO M 2011360菌株發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸的方法，以CCTCC NO M 2011360作為出發(fā)菌種，以添加有苯丙氨酸、或苯丙酮酸的MRS培養(yǎng)基為發(fā)酵液，發(fā)酵法生物轉(zhuǎn)化制備苯乳酸；工藝為
(1)菌種CCTCCNO M 2011360 ；
(2)培養(yǎng)基，以g/L計(jì)
保藏培養(yǎng)基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氫二鉀2，無水乙
酸鈉5，檸檬酸二銨2，硫酸鎂O. 58，硫酸錳O. 25，吐溫-80 lmL/L, pH 6. 2-6. 4;2%瓊脂粉，以自來水配制；
f種子培養(yǎng)基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氫二鉀2，無水乙
酸鈉5，檸檬酸二銨2，硫酸鎂O. 58，硫酸錳O. 25，吐溫-80 lmL/L，pH 6. 2-6. 4，以自來水配制；
f發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氫二鉀2，無水乙
酸鈉5，檸檬酸二銨2，硫酸鎂O. 58，硫酸錳O. 25，吐溫-80 lmL/L，苯丙氨酸或苯丙酮酸 1-10 mmol/L, pH 6. 2-6. 4,以自來水配制；
(3)制備工藝
t菌種保藏將CCTCC NO M 2011360保藏在保藏培養(yǎng)基上，4°C保存，兩周轉(zhuǎn)接一次；
或在活化菌種對(duì)數(shù)期時(shí)按照保藏培養(yǎng)基甘油質(zhì)量比為1:1將其保藏在_80°C超低溫冰箱中；
f種子培養(yǎng)將CCTCC NO M 2011360從保藏培養(yǎng)基接種至種子培養(yǎng)基需活化2代，每次30°C靜止培養(yǎng)12 h，即總共24h ；
I發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)后的種子液按發(fā)酵液質(zhì)量2%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C靜止培養(yǎng) 36h ；
Z發(fā)酵液后處理通過低溫離心法和O. 22ΜΠ1微濾法除去發(fā)酵液中的菌體，即得產(chǎn)品苯乳酸。
離心除菌體后，其上清部分經(jīng)過微孔濾膜過濾(O. 22Mffl),濾液上HPLC分析。所述的發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸的方法，發(fā)酵液中添加苯丙酮酸或苯丙氨酸的最終濃度為 5-6mmo1 /I, η檢測苯乳酸的方法如下
發(fā)酵液離心，棄菌體沉淀，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾(O. 22Mm),濾液上HPLC分析。HPLC
條件了 AgilentllOO 色譜柱Z0RBAX 300SB C18 (5 μ m、4. 6X250mm)，空流動(dòng)相
- 3-·
(A)O. 05%三氟乙酸/甲醇和(B)O. 05%三氟乙酸/水，f梯度洗脫程序0、18、20、21、24分鐘時(shí)的洗脫液A/B體積比組成分別為10:90、100: 0,100: 0,10:90、10:90，「|:檢測器紫
外檢測器波長210nm,道柱溫30°C，f流速lmL/min，T進(jìn)樣量10μ ，%苯乳酸標(biāo)樣濃度0. 5mg/mL。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次提供了一種利用微生物轉(zhuǎn)化制備苯乳酸的方法， 表明戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) SK25經(jīng)36h發(fā)酵能產(chǎn)苯乳酸、且在MRS發(fā)酵培養(yǎng)液中苯乳酸含量可達(dá)O. 8mmol/L,是目前報(bào)道的產(chǎn)苯乳酸最高的菌種；發(fā)酵培養(yǎng)基中添加底物苯丙氨酸(phenylalanine)、或苯丙酮酸(phenylpyruvic acid)時(shí)苯乳酸的產(chǎn)量會(huì)提聞。生物材料樣品保藏一株戍糖片球菌SK25 {PediococcusSK25,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏單位地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011360，保藏日期2011年10月21日。


圖I發(fā)酵時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)苯乳酸的影響。圖2 36h后發(fā)酵液中苯乳酸(PLA)的HPLC檢測。其中(A)為苯乳酸標(biāo)樣(B)為 36h后發(fā)酵液HPLC檢測。圖3苯丙氨酸、苯丙酮酸對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響。
具體實(shí)施例方式通過實(shí)驗(yàn)，得到了影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的主要因素
實(shí)施例I發(fā)酵時(shí)間對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響
按說明書所述的發(fā)酵條件，通過對(duì)戍糖片球菌(PediococcusSK25在不
同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)苯乳酸的檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵36h苯乳酸含量最高，故確定發(fā)酵時(shí)間36h為最佳發(fā)酵時(shí)間。表I發(fā)酵時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)苯乳酸的影響
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)苯乳酸的片球菌屬乳酸菌，其分類命名為戍糖片球菌ipediococcus pentosaceus) SK25，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011360。
2.用權(quán)利要求I所述的CCTCCNO M 2011360菌株發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸的方法，其特征在于以CCTCC NO M 2011360作為出發(fā)菌種，以添加有苯丙氨酸、或苯丙酮酸的MRS培養(yǎng)基為發(fā)酵液，發(fā)酵法生物轉(zhuǎn)化制備苯乳酸；工藝為(1)菌種CCTCCNO M 2011360 ；(2)培養(yǎng)基，以g/L計(jì):X保藏培養(yǎng)基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氫二鉀2，無水乙酸鈉5，檸檬酸二銨2，硫酸鎂O. 58，硫酸錳O. 25，吐溫-80 lmL/L, pH 6. 2-6. 4 ;2%瓊脂粉， 以自來水配制；2種子培養(yǎng)基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氫二鉀2，無水乙酸鈉5，檸檬酸二銨2，硫酸鎂O. 58，硫酸錳O. 25，吐溫-80 lmL/L，pH 6. 2-6. 4，以自來水配制；.5發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨10，牛肉膏10，磷酸氫二鉀2，無水乙酸鈉5，檸檬酸二銨2，硫酸鎂O. 58，硫酸錳O. 25，吐溫-80 lmL/L，苯丙氨酸或苯丙酮酸 1-10 mmol/L, pH 6. 2-6. 4,以自來水配制；(3)制備工藝X菌種保藏將CCTCC NO M 2011360保藏在保藏培養(yǎng)基上，4°C保存，兩周轉(zhuǎn)接一次； 或在活化菌種對(duì)數(shù)期時(shí)按照保藏培養(yǎng)基甘油質(zhì)量比為1:1將其保藏在_80°C超低溫冰箱中；S種子培養(yǎng)將CCTCC NO M 2011360從保藏培養(yǎng)基接種至種子培養(yǎng)基需活化2代，每次30°C靜止培養(yǎng)12 h，即總共24h ；.1:發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)后的種子液按發(fā)酵液質(zhì)量2%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C靜止培養(yǎng) 36h ；X發(fā)酵液后處理通過低溫離心法和O. 22Mffl微濾法除去發(fā)酵液中的菌體，即得產(chǎn)品苯乳酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸的方法，其特征在于發(fā)酵液中添加苯丙酮酸或苯丙氨酸的最終濃度為5-6mmol/L。
全文摘要
一株產(chǎn)苯乳酸的菌株及該菌發(fā)酵法制備苯乳酸的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一株產(chǎn)苯乳酸的片球菌屬乳酸菌，具體涉及篩選獲得能產(chǎn)苯乳酸的片球菌屬乳酸菌(Pediococcuspentosaceus)SK25，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM2011360。本發(fā)明以此片球菌為出發(fā)菌株，在MRS培養(yǎng)基發(fā)酵完成液中，苯乳酸含量達(dá)到0.8mmol/L，目前已報(bào)道的最高野生菌種MRS培養(yǎng)基發(fā)酵液中最高產(chǎn)量僅為0.57mmol/L。當(dāng)在MRS培養(yǎng)基中添加有苯丙氨酸、或苯丙酮酸時(shí)，苯乳酸產(chǎn)量會(huì)提高，其中添加苯丙酮酸的效果更為明顯，確定其最適添加量為5-6mmol/L。本發(fā)明所得產(chǎn)品安全可靠，可用作藥用中間體，食品添加劑，具有很強(qiáng)的抑菌防腐功能。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102604858SQ20121000554
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者江波, 沐萬孟, 郁書懷 申請(qǐng)人:江南大學(xué)