兩株纖維堆囊菌的轉(zhuǎn)化方法
【專利說明】
[0001] 本分案申請為申請?zhí)?201410049382. 7,發(fā)明名稱：兩株纖維堆囊菌的轉(zhuǎn)化方法， 申請日：2014年02月12日的專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域：
[0002] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及兩株纖維堆囊菌的轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】：
[0003] 纖維堆囊菌是一種能降解利用纖維素的粘細(xì)菌，由于纖維堆囊菌能產(chǎn)豐富的活 性代謝產(chǎn)物而受到廣泛關(guān)注，據(jù)報道，纖維堆囊菌活性次級代謝產(chǎn)物占粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)總量 的48. 4%。如纖維堆囊菌生產(chǎn)的埃博霉素具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。因此，通過建立適當(dāng) 的遺傳操作體系，利用基因工程手段提高其次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量具有十分重要的意義，但 由于纖維堆囊菌極易成團(tuán)，生長緩慢，而且缺乏適合的遺傳操作載體，因此對于纖維堆囊 菌的遺傳操作改造進(jìn)展較為緩慢。夏志潔等（XiaZ-J，WangJ，HuW，LiuH，GaoX-Z，Wu Z_H，ZhangP_Y，LiY-Z.ImprovingconjugationefficacyofSorangiumcellulosumby theadditionofdualselectionantibiotics.Journalofindustrialmicrobiology& biotechnology，2008, 35 (10) : 1157-1163)利用結(jié)合轉(zhuǎn)移和自然轉(zhuǎn)化等方法將外源基因轉(zhuǎn) 入纖維堆囊菌，但重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)換過程耗時較長，雖然1992年Jaoua等（Jaoua，S.，S. Neff,T.Schupp.TransferofmobilizableplasmidstoSorangiumcellulosumand evidencefortheintegrationintothechromosome.Plasmid, 1992，（28):157-165)建 立了利用IncPCR質(zhì)粒pME305介導(dǎo)PSJB55結(jié)合轉(zhuǎn)移至菌株Soce26中，但由于纖維堆囊 菌的菌株特異性，該方法并不適用于其他菌株。因此完善纖維堆囊菌的轉(zhuǎn)化方法，建立纖維 堆囊菌的遺傳操作體系對于促進(jìn)纖維堆囊菌的基因工程改造以獲得更多的活性次級代謝 產(chǎn)物就顯得十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種纖維堆囊菌SoceMl的轉(zhuǎn)化方法，利用該方法可 以成功的將外源基因轉(zhuǎn)入纖維堆囊菌SoceMl中，為建立纖維堆囊菌的遺傳操作體系并促 進(jìn)纖維堆囊菌的基因工程改造奠定基礎(chǔ)，從而提高纖維堆囊菌中活性次級代謝產(chǎn)物的豐度 和產(chǎn)量。
[0005] 本發(fā)明的纖維堆囊菌SoceMl的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟：制備纖維 堆囊菌SoceMl的原生質(zhì)體，將外源基因與質(zhì)粒PBEP43連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PBEP43-外源 基因，然后將重組質(zhì)粒PBEP43-外源基因利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至纖維堆囊菌SoceMl的原生 質(zhì)體中。
[0006] 所述的外源基因為透明顫菌血紅蛋白基因vgb。
[0007] 具體步驟優(yōu)選為：
[0008]a.原生質(zhì)體的制備：以體積分?jǐn)?shù)2. 5 %的接種量將纖維堆囊菌SoceMl接種至液 體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心得到菌體，用PBS溶液洗滌2次，再用體積分?jǐn)?shù)14%甘露 醇溶液充分懸浮SoceMl細(xì)胞，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%EDTA溶液處理細(xì)胞30min，PBS洗滌， 再用3mg/ml溶菌酶于30°C作用2h，用體積分?jǐn)?shù)14%甘露醇溶液充分洗滌以去除殘留酶液， 得到纖維堆囊菌SoceMl的原生質(zhì)體；
[0009]b.原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：在纖維堆囊菌SoceMl的原生質(zhì)體中加入重組質(zhì)粒 PBEP43-vgb，于冰上混合30min，加入體積分?jǐn)?shù)40%PEG溶液于30°C作用lOmin，然后于含 體積分?jǐn)?shù)10%甘露醇的液體培養(yǎng)基中復(fù)壯24h，涂布于含有50yg/mL卡那霉素和100yg/ mL氨芐青霉素的固體平板，經(jīng)篩選得到含有重組質(zhì)粒PBEP43-vgb的纖維堆囊菌SoceMl。
[0010] 所述的質(zhì)粒PBEP43為帶有P43強(qiáng)啟動子和終止子以及氨芐青霉素和卡那霉素雙 抗性的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體PBEP43。
[0011] 本發(fā)明的第二個目的是提供纖維堆囊菌SoceM6的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括 以下步驟：將外源基因與質(zhì)粒PLA2917連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PLA2917-外源基因，然后將帶有 重組質(zhì)粒PLA2917-外源基因的供體菌、含質(zhì)粒PRK2013的幫助菌和纖維堆囊菌SoceM6 的受體菌混合，經(jīng)過篩選獲得轉(zhuǎn)入有重組質(zhì)粒PLA2917-外源基因的纖維堆囊菌SoceM6。
[0012] 所述的外源基因為透明顫菌血紅蛋白基因vgb，最好其5'端連有組成型啟動子 P43,其3'端有終止子序列，這樣的話，可以轉(zhuǎn)入纖維堆囊菌后無需誘導(dǎo)就能表達(dá)發(fā)揮其功 能。
[0013]所述的幫助菌和供體菌可以為大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM109或大腸桿菌HB101〇
[0014] 具體步驟優(yōu)選為：
[0015]a.供體菌株的構(gòu)建：將透明顫菌血紅蛋白基因vgb插入到載體PLA2917中，得到 重組質(zhì)粒PLA2917-vgb，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，作為供體菌；
[0016]b.三親本結(jié)合轉(zhuǎn)化法：將含有重組質(zhì)粒PLA2917_vgb的大腸桿菌DH5a、含有質(zhì)粒 PRK2013的大腸桿菌DH5a的幫助菌和纖維堆囊菌SoceM6培養(yǎng)至對數(shù)生長期前期，按照 供體菌、幫助菌和纖維堆囊菌SoceM6受體菌的細(xì)胞總數(shù)之比為1:1:2,將上述三種菌混 合，于無抗性平板的濾紙上培養(yǎng)24h，配制濃度為109個/mL的菌液，涂布于含有10yg/mL 四環(huán)素和50yg/mL卡那霉素的平板上培養(yǎng)，經(jīng)篩選得到轉(zhuǎn)入有重組質(zhì)粒PLA2917-vgb的纖 維堆囊菌SoceM6。
[0017] 本發(fā)明的纖維堆囊菌SoceMl和SoceM6分離自廣東的土壤樣品，其公開于文 獻(xiàn)：張慶波，王磊，章衛(wèi)民。廣東6株纖維堆囊菌的分離與鑒定。吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010， 32 (4) :387-393,該菌種本發(fā)明人也持有，保證自本發(fā)明的申請日起20年內(nèi)向公眾提供。
[0018] 鑒于目前纖維堆囊菌的轉(zhuǎn)化方法和可用質(zhì)粒載體相對較少，因此本發(fā)明選用帶雙 抗性的穿梭質(zhì)粒載體和廣宿主載體分別將外源基因（vgb)導(dǎo)入至兩株纖維堆囊菌中，為建 立纖維堆囊菌的遺傳操作體系并促進(jìn)纖維堆囊菌的基因工程改造奠定基礎(chǔ)，從而提高纖維 堆囊菌中活性次級代謝產(chǎn)物的豐度和產(chǎn)量。
【附圖說明】：
[0019] 圖1為SoceMl的陽性克隆平板。
[0020] 圖 2 為SoceMl的PCR鑒定圖，M:DL2000DNAmarker，lanel:空白對照，lane 2 :重組SoceMl陽性克隆PCR，lane3:以重組質(zhì)粒PBEP43-vgb為模板PCR。
[0021] 圖3為SoceMl和SoceM6陽性克隆用vgb基因引物的測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù) 庫比對結(jié)果圖。
【具體實施方式】：
[0022] 以下將參照附圖，結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋。但實施例本身對發(fā) 明不做任何形式的限定。
[0023] 實施例1 :纖維堆囊菌SoceMl的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，包含如下步驟：
[0024] (1)原生質(zhì)體的制備：按如下配方配制液體培養(yǎng)基：8g/L馬鈴薯淀粉，2g/L葡 萄糖，2g/L大豆蛋白