篩選25羥基維生素d3高產(chǎn)菌株和發(fā)酵培養(yǎng)基中聚山梨酯-80含量的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】篩選巧超基維生轟〇3高產(chǎn)菌株和發(fā)醒培養(yǎng)基中聚山梨 醋-80含量的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明設(shè)及一種篩選25徑基維生素化高產(chǎn)菌株和發(fā)酵培養(yǎng)基的方法。
[000引【背景技術(shù)】： 骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis,OP)日益成為嚴(yán)重威脅老年人的健康的一種慢性疾??；維 生素D類(lèi)藥物中的25徑基維生素化是自然存在人體內(nèi)的維生素D3的活性代謝產(chǎn)物；多年 來(lái)，25徑基維生素化主要用于治療老年人骨質(zhì)疏松癥等各種慢性骨素亂，W及與慢性腎衰 竭有關(guān)的代謝性骨疾病，低巧血病，另外，近年也作為飼料添加劑用于飼料行業(yè)。
[0003] 25徑基維生素化的制備有化學(xué)合成和生物發(fā)酵兩種方法；化學(xué)合成反應(yīng)步驟繁 多、需要昂貴試劑、反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生外消旋體，需要進(jìn)行復(fù)雜的拆分過(guò)程，不僅大大影響 收率，而且難W拆分完全，而且化學(xué)合成生產(chǎn)25徑基維生素化會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生較大的污染。 而微生物發(fā)酵的方式能夠利用微生物細(xì)胞內(nèi)的酶特異性的解決25徑基維生素的手性 結(jié)構(gòu)問(wèn)題，其生產(chǎn)條件溫和，收率高，成本低廉，環(huán)境友好，成為一種有效替代化學(xué)合成的方 法。
[0004]隨著25徑基維生素化市場(chǎng)需求量正日益擴(kuò)大，優(yōu)良的25徑基維生素D3高產(chǎn)菌株 就成為發(fā)酵生產(chǎn)25徑基維生素化的關(guān)鍵。
[0005] 從當(dāng)前國(guó)內(nèi)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)來(lái)看，目前高產(chǎn)的工業(yè)生產(chǎn)菌種的獲得主要還是采用 隨機(jī)選育，包括自然選育、誘變育種和W原生質(zhì)體融合為代表的雜交育種技術(shù)，常常正突變 率低，導(dǎo)致篩選工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，從而不易篩選到高產(chǎn)菌株。
[0006] 由于細(xì)胞膜對(duì)底物和產(chǎn)物的透性屏障作用，常導(dǎo)致微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率低下。 主要表現(xiàn)為細(xì)胞催化效率一般比酶催化效率低10到100倍。此外，如果產(chǎn)物不能及時(shí)從 細(xì)胞中釋放出來(lái)而在其中過(guò)度積累，通常會(huì)造成反饋抑制效應(yīng)，使目標(biāo)產(chǎn)物的得率下降。因 此，有必要采取措施來(lái)改善細(xì)胞膜對(duì)底物及產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力，利用細(xì)胞膜通透性的變化來(lái) 提高微生物的代謝通量，提高菌體發(fā)酵過(guò)程中的催化效率，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。利用 細(xì)胞膜通透性的變化來(lái)提高微生物的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量已經(jīng)逐步應(yīng)用到發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中。例如，汪 江波(汪江波.調(diào)控細(xì)胞通透性W提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量.華西藥學(xué)雜志，2006,21 (5):465 ~ 467)報(bào)道了誘變選育甘油缺陷型菌株，添加甘油調(diào)控使得細(xì)胞膜的通透性大大 增加，大幅提高了透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。魏娜(魏娜.丫-亞麻酸產(chǎn)生菌深黃被抱霉細(xì)胞膜通透 性調(diào)控的研究(碩±學(xué)位論文）.上海水產(chǎn)大學(xué)，2007)報(bào)道了W深黃被抱霉甜RJ-13為出 發(fā)菌株，通過(guò)低頻超聲波4min與制霉菌素0. 05ml方法使得菌體細(xì)胞膜通透性的增加，從而 提高了丫-亞麻酸產(chǎn)率。胡炎華(胡炎華.逐級(jí)誘變及細(xì)胞膜通透性調(diào)節(jié)改造谷氨酸棒桿 菌.2011年國(guó)際氨基酸產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新與聯(lián)盟發(fā)展高峰論壇論文集，152~156)報(bào)道了通過(guò)香豆 素抗性篩選，增加細(xì)胞膜通透性提高了谷氨酸產(chǎn)量。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的是提供了一種培養(yǎng)基原料來(lái)源廣，成本低，出發(fā)菌株正突變株的幾率高、 突變株25徑基維生素化效價(jià)高的篩選25徑基維生素D3高產(chǎn)菌株的方法。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種25?基維生素化高產(chǎn)菌株生產(chǎn)25?基維生 素化的發(fā)酵培養(yǎng)基中聚山梨醋-80含量的篩選方法。
[0009] 本發(fā)明是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的： 篩選25徑基維生素化高產(chǎn)菌株的方法，包括如下步驟： (1) 初篩：將誘變處理的自養(yǎng)假諾卡氏菌單抱子懸浮液稀釋后涂布于含有聚山梨 醋-80含量為15-20g/L的分離培養(yǎng)基做成的若干平板上，在29°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)144-19化， 從若干平板中挑選生長(zhǎng)和產(chǎn)抱良好的菌株接種于斜面培養(yǎng)基制成的若干斜面上，在29°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16化，斜面成熟后挖塊種入=角瓶中的種子培養(yǎng)基中，同時(shí)將用于誘變處理 的出發(fā)菌株斜面也挖塊種入S角瓶中的種子培養(yǎng)基中，作為對(duì)照，搖床轉(zhuǎn)速為280r/min， 29 °C培養(yǎng)7化后，種入發(fā)酵培養(yǎng)基，將S角瓶置于搖床上，搖床轉(zhuǎn)速為280r/min，29 °C培養(yǎng) 4化后，補(bǔ)入維生素化，使得維生素化在發(fā)酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)72h，停止 發(fā)酵，測(cè)定兩種菌的發(fā)酵效價(jià)，與出發(fā)菌株相比，選出自養(yǎng)假諾卡氏菌突變株相對(duì)發(fā)酵效價(jià) 較高的菌株若干支進(jìn)行復(fù)篩， (2) 復(fù)篩：將發(fā)酵效價(jià)較高的若干菌株接種于若干=角瓶中的種子培養(yǎng)基中，將=角瓶 置于搖床上，搖床轉(zhuǎn)速為280r/min，29°C培養(yǎng)7化后接種于若干個(gè)S角瓶中的發(fā)酵培養(yǎng) 基中，將S角瓶置于搖床上，搖床轉(zhuǎn)速為280r/min，29°C培養(yǎng)4化后，補(bǔ)入維生素化，使得 維生素化在發(fā)酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)72h，停止發(fā)酵，測(cè)定若干個(gè)S角瓶中 的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵效價(jià)，挑選出一個(gè)=角瓶中發(fā)酵效價(jià)最高的一支菌株為最終產(chǎn)品。
[0010]25徑基維生素高產(chǎn)菌株生產(chǎn)25徑基維生素D3的發(fā)酵培養(yǎng)基中聚山梨醋-80 含量的篩選方法，將種子培養(yǎng)基裝入3個(gè)250ml=角瓶中，每瓶30ml，滅菌后，從25徑基 維生素化高產(chǎn)菌株的斜面挖塊接入3個(gè)=角瓶種子培養(yǎng)基中，將=角瓶置于搖床上，搖床 轉(zhuǎn)速為280r/min，29°C培養(yǎng)72h，將3個(gè)S角瓶中的種子液分別移入含有不同含量聚山 梨醋-80的若干個(gè)=角瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，將=角瓶置于搖床上，搖床轉(zhuǎn) 速為280r/min，29 °C培養(yǎng)4化后，補(bǔ)入維生素化，使得維生素化在發(fā)酵液中的終濃度為 500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3天，停止發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵效價(jià)，確定一個(gè)S角瓶中的發(fā)酵效價(jià)最高的 發(fā)酵培養(yǎng)基，其聚山梨醋-80的含量為最佳值。
[0011] 所述的步驟（1)中所述分離培養(yǎng)基成分和含量為：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/l， 玉米漿3g/l，氯化鋼4g/l，瓊脂15旨/1，聚山梨醋-80 15g/l，PH7.0。
[0012] 所述的步驟（1)中所述斜面培養(yǎng)基成分和含量為：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/ 以玉米漿3g/l，氯化鋼4g/l，瓊脂15g/l，PH7.0。
[0013] 所述的種子培養(yǎng)基成分和含量為：蛋白腺15g/l，玉米漿15g/l，葡萄糖15g/l， 黃豆粉4肖/1，氯化鋼5肖/1，憐酸二氨鐘2肖/1，抑7.2。
[0014] 所述的含聚山梨醋-80量不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，聚山梨醋-80含量分別為1-9g/L 中之一，其他成分和含量均為：蛋白腺15g/l，玉米漿15g/l，葡萄糖15g/l，黃豆粉4g/ 以氯化鋼5g/l，憐酸二氨鐘2g/l，倍他環(huán)糊精3g/l，pH7. 2。
[0015] 步驟（I)中所述誘變處理為將出發(fā)菌株自養(yǎng)假諾卡氏菌成熟斜面用生理鹽水制 成單抱子懸液，經(jīng)振蕩，玻璃珠分散30min，無(wú)菌過(guò)濾收集單抱子懸液約IOml于無(wú)菌培養(yǎng)皿 中，使其抱子的終濃度達(dá)到120-130個(gè)/ml,紫外功率30W，燈距25cm照射30s。
[0016] 步驟（1)中所述誘變處理為將出發(fā)菌株自養(yǎng)假諾卡氏菌成熟斜面用抑7. 0的憐 酸鋼緩沖液成單抱子懸液，經(jīng)振蕩，玻璃珠分散30min，無(wú)菌過(guò)濾收集單抱子懸液約10ml， 使其抱子的終濃度達(dá)到120-130個(gè)/ml,加入燒化劑甲基橫酸乙醋EMS，終濃度為3%，振蕩 處理30min，加入硫代硫酸鋼終止反應(yīng)，振蕩20min。
[0017] 發(fā)酵培養(yǎng)基中聚山梨醋-80的含量為3 -8g/L。
[0018]針對(duì)隨機(jī)選育正突變率低，工作量大，不易篩選到高產(chǎn)菌株的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了 一種篩選25徑基維生素化高產(chǎn)菌株的方法，該方法在常規(guī)誘變選育的基礎(chǔ)上，結(jié)合調(diào)控細(xì) 胞膜通透性的方法，能有效地提高獲得正突變株的幾率，為25徑基維生素化發(fā)酵生產(chǎn)提供 優(yōu)良菌種，從而提高25徑基維生素化發(fā)酵生產(chǎn)水平。
[0019] 表面活性劑主要是通過(guò)影響細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子間和脂質(zhì)分子與膜蛋白之間的相 互作用