解淀粉芽孢桿菌植物亞種wk1菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物純化及其在植物疾病防治中的應(yīng)用，具體是解淀粉芽抱桿菌植 物亞種Bacillus amyloliquefaciens subsp.plan 1:a;rum WK1菌株及該菌株在防治山核桃 干腐病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 芽抱桿菌生物特征豐富多樣，分布極其廣泛，是±壤微生物系統(tǒng)中的優(yōu)勢生物種 群。芽抱桿菌突出的特征是能產(chǎn)生對熱、干旱、紫外線和一些化學(xué)物品有很強(qiáng)的抗逆性的芽 抱，因此在不同環(huán)境中存活、定殖與繁殖的能力很強(qiáng)。很多優(yōu)良的芽抱桿菌已經(jīng)應(yīng)用到防治 植物病害上，并且獲得商品化許可。芽抱桿菌防治植物病害的作用機(jī)制W競爭、括抗和誘導(dǎo) 植物抗性為主，其中括抗作用主要是產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制有害病原物的生長或發(fā)展或直接殺 滅病原物。非核糖體合成的脂膚類抗生素是抗菌物質(zhì)中的一類，且對真菌具有強(qiáng)烈的括抗 作用。脂膚類物質(zhì)在很多芽抱桿菌中發(fā)現(xiàn)，有伊枯草菌素（Iturin)，生物表面活性素 (Surf act in )、豐原素（fengycin)S 大家族（參見 Ongena Μ 著 Bacillus lipopept ides : versatile weapons for plant disease bioconhol)，其相應(yīng)的抗真菌活性的報道中， ;Uu;rins和fengycins抗真菌效果相對顯著。Fengycins具有強(qiáng)烈的抗真菌效果，特別是抗絲 狀真菌（參見Deleu Μ著Effect of fengycin,a lipopeptide produced by Bacillus subtilis,on model 111011113招]108)〇此夕1'，與1化1'1]18和8山寸曰〇1：1]18相化^兩]1邑7〇1]18具有明顯 的降低溶血活性的效果（參見Kumar A著Antimicrobial lipopeptides of Bacillus: natural weapons for biocontrol of plant pathogens)。
[0003] 山核桃化巧a cathayensis為胡桃科化glandaceae山核桃屬化巧a落葉喬木，是投 入產(chǎn)出效益很高的經(jīng)濟(jì)樹種之一。山核桃干腐病是近年來山核桃林中發(fā)生的一種新病害， 該病在浙江省的臨安、淳安、桐廬的山核桃栽培區(qū)普遍發(fā)生，個別地區(qū)株發(fā)病率達(dá)80%~ 100%。病原菌有性態(tài)為子囊菌亞口 Ascomycotion座囊菌目Dothidelales葡萄座腔菌科 Bohyosphaeriaceae葡萄座腔菌Botryosphaera. sp.。有關(guān)山核桃干腐病的化學(xué)防治的研 究報道的有春季刮除病斑結(jié)合噴灑藥劑。藥劑主要有402抗菌劑、乙蒜素乳油、硫酸銅晶體 等。隨著人們環(huán)保意識的不斷增強(qiáng)W及高新技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用，利用有益生物來控制植 物病害越來越得到廣泛重視。施用化學(xué)藥劑產(chǎn)生農(nóng)藥殘留、提高病原菌的抗藥性、污染環(huán)境 等對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成危害的一系列問題已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。因此，尋找環(huán)境友好 型的植物病害防治技術(shù)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一。生物防治就是其中一項備受關(guān)注的技術(shù) 與方法。
[0004] 本發(fā)明中所設(shè)及的解淀粉芽抱桿菌植物亞種Bacillus a町loliquefaciens subsp. plantarum WKl (簡稱WKl)，不僅菌株本身具有防效作用，其菌體發(fā)酵液和滅菌發(fā)酵 液都有較高的防效。從WK1菌株發(fā)酵液中提取的脂膚類化合物，表現(xiàn)為fengycin類脂膚占絕 對優(yōu)勢，且成分多樣。由此說明WK1菌對真菌病原菌有很強(qiáng)的抑制效果，可作為一種生物防 治菌開發(fā)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種解淀粉芽抱桿菌植物亞種Bacillus amyloliquefaciens subsp.plan1:a;rum WK1菌株及其在抑制山核桃干腐病病原菌生長方面 的應(yīng)用。
[0006] 解決上述技術(shù)問題，采用W下技術(shù)方案：
[0007] 本解淀粉芽抱桿菌植物亞種WK1菌株，其分類命名為解淀粉芽抱桿菌植物亞種 (Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum WK1)，保藏在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中屯、（地址：北京市朝陽市北辰西路1號院3號），保藏編號為： CGMCCNo. 11640，保藏日期為2015年11月9日；該菌株在牛肉膏蛋白腺瓊脂平板生長時，菌落 直徑為2.0~3.0mm、圓形、凸起、邊緣波狀、表面權(quán)皺粘稠、乳白色、不透明的菌落;革蘭氏陽 性桿菌，單個或成對排列，有芽抱，芽抱端生，楠圓形，芽抱囊膨大;營養(yǎng)肉湯液體靜置培養(yǎng)， 表面產(chǎn)生菌膜，液體渾濁;在質(zhì)量比為10 % NaCl水溶液、pH= 1~13條件中生長。
[0008] 本解淀粉芽抱桿菌植物亞種WK1菌株的應(yīng)用，是應(yīng)用該菌株及其發(fā)酵液或滅菌發(fā) 酵液上清液來抑制山核桃干腐病病原真菌的生長。
[0009] 本解淀粉芽抱桿菌植物亞種WK1菌株抑制山核桃干腐病病原真菌的生長的主要成 分為脂膚類物質(zhì)中的豐原素 fengycins，成分有C15 fengycin A、C16 fengycin A、C17 fengycin A、C18 fengycin A及其異構(gòu)體，異構(gòu)體為側(cè)鏈的11〇1'1]1日1-、13〇-和日]11日13〇^種異 構(gòu)化形式。
[0010] 本解淀粉芽抱桿菌植物亞種WK1菌株及其發(fā)酵液和滅菌發(fā)酵液上清液的制備方法 按如下步驟進(jìn)行：
[0011] (1)活化菌種：
[0012] 將保存在斜面培養(yǎng)基中的解淀粉芽抱桿菌植物亞種WK1菌株，在NA固體培養(yǎng)基上 劃線生長48小時；
[001引（2)WK1菌株發(fā)酵液的制備：
[0014] 選取NA固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于100ml NA液體培養(yǎng)基中，在37°C、180r/min 條件下培養(yǎng)14小時，得到種子液;再將種子液按接種量為3% (v/v)分別接種于500ml ΝΑ液 體培養(yǎng)基中，在37°C、180r/min條件下培養(yǎng)48小時，得到WK1菌株發(fā)酵液；
[001引（3)WK1滅菌發(fā)酵液上清液的制備：
[0016] 將步驟(2)所述菌體的WK1菌株發(fā)酵液于高溫高壓滅菌鍋里12rC滅菌30min后，將 滅菌發(fā)酵液3000r/min離屯、15min后，得WK1滅菌發(fā)酵液上清液。
[0017] 本解淀粉芽抱桿菌植物亞種WK1菌株的應(yīng)用，其特征是所述的脂膚類物質(zhì)具有抑 制杉木枯萎病、棉花黃病、哈密瓜枯萎病、黃瓜枯萎病、立枯絲核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒 根腐病病原菌菌絲生長的作用。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：
[0019] WK1菌株是針對山核桃干腐病而篩選出來的有較強(qiáng)生防效果的生防菌，且在生防 應(yīng)用上芽抱桿菌具有很強(qiáng)的生位態(tài)，能在環(huán)境中很好的存活，因此具有很強(qiáng)的生長優(yōu)勢。不 僅WK1菌株本身具有防效作用，其菌體發(fā)酵液和滅菌發(fā)酵液的上清液都有較高的防效。最大 的特點(diǎn)是，WK1菌株主要代謝物的脂膚類化合物成分表現(xiàn)為fengycin類脂膚占絕對優(yōu)勢，且 成分多樣，而fengycin被證明是3種脂版類化合物中抗真菌效果最好（參見Deleu Μ著 Effect of fengycin,a 1ipopeptide produced by Bacillus subtilis,on model membrane s)。由此說明WK1菌具有很強(qiáng)的抗真菌病原菌的效果。因此，該菌株在病害的生物 防治實踐中具有潛在的商業(yè)開發(fā)和應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0020] 圖1為菌株WK1菌落形態(tài)圖
[0021] 圖2為菌株WK1革蘭氏染色鏡檢圖
[0022] 圖3為菌株WK1芽抱染色鏡檢圖
[0023] 圖4為菌株WK1對山核桃干腐病的抑制5天的效果顯示圖
[0024] 圖5為菌株WK1對山核桃干腐病的抑制15天的效果顯示圖
[0025] 圖6為菌株WK1的系統(tǒng)發(fā)育樹圖
[0026] 圖7為流動相條件1(乙臘:0.05%Ξ氯乙酸水溶液= 40:60)的WK1菌株脂膚粗提物 高效液相色譜圖
[0027] 圖8為流動相條件1 (乙臘：0.05 % Ξ氯乙酸水溶液=40 : 60)的地衣芽抱桿菌 (Bacillus licheniformis)脂膚高效液相色譜圖
[0028] 圖9為流動相條件2(乙臘:0.05%Ξ氯乙酸水溶液= 49:51)的WK1菌株脂膚粗提物 高效液相色譜圖
[0029] 圖10為流動相條件2的高效液相色譜圖中保留時間12.78min的fengycins質(zhì)譜圖
[0030] 圖11為流動相條件2的高效液相色譜圖中保留時間15.18min的fengycins質(zhì)譜圖 [0031 ]圖12為流動相條件2的高效液相色譜圖中保留時間16.98min的fengycins質(zhì)譜圖