一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 西瓜枯萎病是一種由尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f. sp niveum F0N)引起的維管束土傳病害，是西瓜產(chǎn)業(yè)中最普遍、危害最嚴(yán)重的病害之一，一般發(fā)病率為 10 % -30 %，嚴(yán)重的達(dá)80 % -90 %，重茬地甚至造成絕產(chǎn)。病原菌從土壤根系侵入，引起維管 束變褐壞死，導(dǎo)致瓜秧枯死，其厚垣孢子在土壤中可存活10年之久，嚴(yán)重影響西瓜的種植。 目前，對(duì)該病害尚無(wú)有效的防治方法，傳統(tǒng)的輪作雖在一定程度上能減輕病害發(fā)生，但隨著 市場(chǎng)對(duì)西瓜需求量的增長(zhǎng)，西瓜種植面積逐年擴(kuò)大，輪作防病措施難以實(shí)施?；瘜W(xué)防治雖然 具有一定的防治效果，但是病原菌對(duì)化學(xué)藥劑的抗性逐年增強(qiáng)，藥劑用量不斷提高?；瘜W(xué)藥 劑的長(zhǎng)期大量使用，造成自然生態(tài)環(huán)境日益嚴(yán)重的污染。研究表明，在植物體內(nèi)存在大量的 益生菌，已在多種植物體內(nèi)分離篩選到防病效果明顯的內(nèi)生細(xì)菌，有些內(nèi)生細(xì)菌還具有促 生、固氮等生物功能，是植物病害防治的重要資源，尤其對(duì)化學(xué)藥劑難以控制的土傳病害、 維管束病害及系統(tǒng)性病害發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，尋找防治西瓜枯萎病的拮抗微生物具 有重要意義。
[0003] 利用生防菌株防治植物病害在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，至今美國(guó)已有4種芽孢桿菌制備 的生防菌劑獲得了生產(chǎn)許可證；經(jīng)檢索，申請(qǐng)者在現(xiàn)有的專(zhuān)利和非專(zhuān)利文獻(xiàn)中檢索到一些 關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的文獻(xiàn)報(bào)道和專(zhuān)利。例如，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?013100328384公開(kāi)了"一 種促生抑菌解淀粉芽孢桿菌、調(diào)理劑制備方法及應(yīng)用"，報(bào)道多粘類(lèi)解淀粉芽孢桿菌Pb-4對(duì) 番茄等作物有明顯的促生和抑菌防病作用。專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01210342838X公開(kāi)了"解淀粉 芽孢桿菌Bal68及其發(fā)酵培養(yǎng)方法和應(yīng)用"，利用解淀粉芽孢桿菌Bal68制備菌劑，對(duì)尖孢 鐮刀菌引起的白術(shù)根腐病、西洋參根腐病和三七根腐病等根腐病害具有很好的防治作用。 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?014100362727公開(kāi)了"解淀粉芽孢桿菌噻枯唑復(fù)配可濕性殺菌粉劑及其應(yīng) 用"，利用解淀粉芽孢桿菌和噻枯唑復(fù)配可濕性殺菌粉劑，用于防治水稻細(xì)菌性條斑病和水 稻白葉枯病。但目前并沒(méi)有對(duì)西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、核桃根腐病菌等重要植物病原 菌有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為改進(jìn)現(xiàn)有防治技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng) 用，該解淀粉芽孢桿菌對(duì)西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、核桃根腐病菌等多種病原菌具有顯 著的拮抗作用。
[0005] 本發(fā)明第一方面提供了一種解淀粉芽孢桿菌，其于2015年5月15日保藏于武 漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2015299,命名為解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)XK_2〇
[0006] 解淀粉芽孢桿菌XK-2的菌學(xué)特性：
[0007] a、形態(tài)特征：ΧΚ-2為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈桿狀，芽孢橢圓，在LB平板上形成的菌落成 圓形，邊齊，稍隆起，濕潤(rùn)，有光澤，乳白色，半透明。
[0008] b、生理生化特征：水解淀粉，周生鞭毛，氧化酶陰性，接觸酶陽(yáng)性。
[0009] 解淀粉芽孢桿菌XK-2的16S rDNA序列如序列表SEQ ID No. 1所示，與Genbank 上已報(bào)道序列進(jìn)行比對(duì)，最終確定菌株Hi-2為解淀粉芽孢桿菌。
[0010] 本發(fā)明第二方面提供了解淀粉芽孢桿菌)(Κ-2在抑制西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病 菌、核桃根腐病菌中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明第三方面提供了解淀粉芽孢桿菌)(Κ-2的篩選方法，具體步驟包括：
[0012] (1)從西瓜植株的根部中分離芽孢桿菌；
[0013] (2)用平板對(duì)峙法從步驟（1)分離的芽孢桿菌中篩選出對(duì)西瓜枯萎病菌有抑菌作 用的菌株。
[0014] 本發(fā)明第四方面提供了一種解淀粉芽孢桿菌}(Κ-2菌劑，所述菌劑為解淀粉芽孢 桿菌)(Κ-2經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵后得到的菌劑。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：（1)解淀粉芽孢桿菌ΧΚ-2是一株西瓜內(nèi)生菌株，對(duì)人、畜、 農(nóng)作物安全，對(duì)環(huán)境友好。
[0016] (2)本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌)(Κ-2具有較廣的抑菌譜，對(duì)常見(jiàn)的土傳病原菌，西 瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum)、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani)、核桃根腐病菌 (Fusarium solani)等菌絲生長(zhǎng)均具有較好的抑制效果，其中對(duì)西瓜枯萎病菌和水稻紋枯 病菌的抑菌率達(dá)80%以上。
[0017] (3)本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌)(K-2菌劑對(duì)西瓜枯萎病具有顯著的防治效果，盆栽 防治效果達(dá)75. 8%，對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)有明顯抑制作用，使菌絲生長(zhǎng)緩慢，出現(xiàn)末端 細(xì)小，扭曲，崩潰等畸形癥狀，且生產(chǎn)周期短，工藝簡(jiǎn)單，在植物病害的生物防治中具有十分 廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為解淀粉芽孢桿菌ΧΚ-2在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)；
[0019] 圖2為解淀粉芽孢桿菌)(Κ-2對(duì)西瓜枯萎病菌的拮抗作用示意圖；
[0020] 圖3為解淀粉芽孢桿菌)(Κ-2對(duì)水稻紋枯病菌的拮抗作用示意圖；
[0021] 圖4為解淀粉芽孢桿菌)(Κ-2對(duì)核桃根腐病菌的拮抗作用示意圖；
[0022] 圖5為解淀粉芽孢桿菌ΧΚ-2對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的致畸作用示意圖，其中， A為未經(jīng)解淀粉芽孢桿菌ΧΚ-2處理的對(duì)照組，B為經(jīng)解淀粉芽孢桿菌ΧΚ-2處理的實(shí)驗(yàn)組。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明第一方面提供了一種解淀粉芽孢桿菌，其于2015年5月15日保藏于武漢 大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2015299,命名為解淀粉芽孢桿菌ΧΚ-2。
[0024] 所述解淀粉芽孢桿菌ΧΚ-2的16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示。
[0025] 本發(fā)明第二方面提供了解淀粉芽孢桿菌)(K-2在抑制西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病 菌、核桃根腐病菌中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明第三方面提供了解淀粉芽孢桿菌)(K-2菌株的篩選方法，具體步驟包括：
[0027] (1)從西瓜植株的根部中分離芽孢桿菌；
[0028] (2)用平板對(duì)峙法從步驟（1)分離的芽孢桿菌中篩選出對(duì)西瓜枯萎病菌有抑菌作 用的菌株。
[0029] 優(yōu)選的，步驟（1)所述西瓜植株的根部經(jīng)過(guò)酒精浸泡、升汞浸泡、無(wú)菌水漂洗后， 加入無(wú)菌水進(jìn)行研磨，混合均勻制為懸浮液。所述分離芽孢桿菌是將懸浮液稀釋后涂布于 LB平板，28-30°C下培養(yǎng)23-26h，挑取芽孢桿菌單菌落；步驟（2)所述篩選為將西瓜枯萎病 菌接種在PDA平板中心，將步驟（1)所得細(xì)菌呈三角狀對(duì)稱(chēng)接入PDA平板，距離中心l-3cm， 28°C下培養(yǎng)，得到有抑菌作用菌株，轉(zhuǎn)入LB平板上培養(yǎng)保存。
[0030] 本發(fā)明第四方面提供了一種解淀粉芽孢桿菌)(K-2菌劑，所述菌劑為解淀粉芽孢 桿菌)(Κ-2經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵后得到的菌劑。
[0031] 優(yōu)選的，所述活化為將解淀粉芽孢桿菌)(Κ-2菌株接種于培養(yǎng)基中，于28-30°C下 培養(yǎng) 20-24h。
[0032] 更加優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基，其配置方法為酵母提取物5g，胰化蛋 白胨l〇g，氯化鈉 l〇g，瓊脂粉20g，用NaOH調(diào)pH至7. 0-7. 2,于121°C下高壓滅菌20min。
[0033] 優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)為將經(jīng)活化后的解淀粉芽孢桿菌)(K-2菌株接種于培養(yǎng)基 中，于 28-30°C、115-125r/min 下振蕩培養(yǎng) 20-24h。
[0034] 優(yōu)選的，所述發(fā)酵為將經(jīng)種子培養(yǎng)后的解淀粉芽孢桿菌)(K-2菌株以5%的接種比 例接種于培養(yǎng)基中，于28-30°C、115-125r/min下振蕩培養(yǎng)40-44h。
[0035] 更加優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，其配置方法為酵母提取物5g，胰化蛋 白胨10g，氯化鈉10g，用NaOH調(diào)pH至7. 0-7. 2,于121°C下高壓滅菌20min。
[0036] 優(yōu)選的，所述解淀粉芽孢桿菌XK-2菌劑稀釋至有效成分含量 1.0 X IO6-L OX 10scfu/mL后使用，用于抑制西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、核桃根腐病菌。
[0037] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用予以進(jìn)一步說(shuō) 明。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] -、解淀粉芽孢桿菌)(K-2的獲得與鑒定，及其對(duì)西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、核 桃根腐病菌拮抗作用的測(cè)試。
[0040] 本實(shí)施例所述西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、核桃根腐病菌由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植 物病理學(xué)研究室提供，其它方式獲得的西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、核桃根腐病菌也適用 于本發(fā)明。
[0041] 分離：從湖北荊州周邊西瓜種植田塊中采集長(zhǎng)勢(shì)旺盛的西瓜植株，取其幼嫩的根 部，用清水洗凈，剪成Icm左右的小段，置于滅菌的培養(yǎng)皿中，用75 %酒精浸泡50s，再用 0. 1%升萊浸泡30s，然后無(wú)菌水漂洗4次。置于滅菌的研缽中，加入少許無(wú)菌水，研磨，取研 磨后的菌液lmL，加到盛有9mL無(wú)菌水的試管中，振蕩混勾，制成樣品懸浮液。取ImL樣品懸 浮液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中依次進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)謩e取10 6、10 7、10 8的稀釋液 50 μ L涂布于LB平板，置于28 °C培養(yǎng)24h。根據(jù)形態(tài)、大小、色澤等特點(diǎn)，共挑取單菌落236 株，轉(zhuǎn)接于LB平板上培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?br>[0042] 篩選：將西瓜枯萎病菌接種在PDA平板中心，用滅菌的牙簽將上述分離純化的細(xì) 菌呈三角狀對(duì)稱(chēng)接入PDA平板，距離中心約2cm，28°C培養(yǎng)觀察對(duì)峙培養(yǎng)抑菌情況。將抑菌 作用明顯的菌株)《-2轉(zhuǎn)入LB平板上培養(yǎng)，保存?zhèn)溆茫獾矸垩挎邨U菌)(K-2在LB固體培養(yǎng) 基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)見(jiàn)附圖1，解淀粉芽孢桿菌ΧΚ-2在LB平板上形成的菌落成圓形，邊齊， 稍隆起，濕潤(rùn)，有光澤，乳白色，半透明。所述PDA培養(yǎng)基的配制方法為：馬鈴薯200g，葡萄 糖20g，瓊脂18g，補(bǔ)足蒸餾水至lOOOmL，121°C濕熱滅菌20min。
[0043] 鑒定：對(duì)篩選的菌株XK-2進(jìn)行生理生化鑒定，確定為芽孢桿菌屬，然 后提取菌株的總基因組DNA為模板擴(kuò)增其16S rDNA序列。所用正向和反向引 物分別為 27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，即序列表 SEQ ID No.2;1429R: 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，即序列表 SEQ ID No. 3。PCR 反應(yīng)體系為 15 μ L 反應(yīng)體系， 包括：DNA 模板 0· 6 μ L ;Η20 8. 57 μ L !buffer 1. 65 μ L ;Mg2+2. 75 μ L ;dNTP 0· 66 μ L ;27F : 0.33yL;1429R 0.33yL;Tsg O.llyL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4Γ3π?η;94Γ3〇8,5〇Γ458， 72°C 100s，35個(gè)循環(huán)；72°C 7min?；厥詹⒓兓疨CR產(chǎn)物，測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果將菌株XK-2鑒 定為解淀粉芽孢桿菌。
[0044] 進(jìn)一步的，