一種含枯草芽孢桿菌菌株xp的菌酶聯(lián)合制劑及其在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株xp，其分類命名為Bacillussubtilis，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為：CCTCCNo：M2011452。本發(fā)明還公開了一種利用所述菌株xp制成的菌酶聯(lián)合制劑及其在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用。
【專利說明】一種含枯草芽孢桿菌菌株XP的菌酶聯(lián)合制劑及其在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種含枯草芽孢桿菌菌株xp的菌酶聯(lián)合制劑及其在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草薄片又稱再生煙葉或均質(zhì)煙葉，它是煙草工業(yè)生產(chǎn)中的綜合利用和精細加工的產(chǎn)品，主要由煙末、碎片、煙?；虻痛螣熑~加入膠黏劑和其他添加劑等組成。實際上所有的煙草物質(zhì)都可以用于煙草薄片的生產(chǎn)制造，將整個卷煙生產(chǎn)過程中廢棄的煙梗、梗簽、碎片和部分低次煙葉、短梗經(jīng)過不同的加工方法，制成性狀接近甚至優(yōu)于天然煙葉的煙草薄片，并且制成的煙草薄片具有成本低，填充性能好并能減少煙氣中焦油含量等優(yōu)點。根據(jù)生產(chǎn)加工工藝的不同，主要有造紙法、稠漿法和輥壓法三種生產(chǎn)工藝。其中造紙法是指煙草原料先用水萃取，不溶性物質(zhì)或添加天然纖維制成漿后進入造紙機形成薄片片基，水溶性萃取物經(jīng)濃縮后和添加劑一并涂布與片基，干燥后即為成品。加工制造時，可從水溶性物質(zhì)中提取或除去某些煙草成分，抑或添加一些新的成分改善薄片的物理化學(xué)與燃燒性能。薄片的主要成分還是煙葉和煙梗，所以這些原材料如果沒有經(jīng)過完全的發(fā)酵和降解，內(nèi)部含有對煙草燃吸有副作用的淀粉，大大降低煙草薄片的品質(zhì)。
[0003]煙葉發(fā)酵又稱為煙葉醇化，其實質(zhì)是在一定溫度和濕度條件下，促使煙葉理化特性發(fā)生深刻變化的過程，是卷煙工業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量的一種初加工方法，也是卷煙加工中極為重要的一個環(huán)節(jié)。未經(jīng) 發(fā)酵處理的原煙和新煙不僅色澤不能令人滿意，而且常具有生青氣和地方性雜氣，吸味粗糙，刺激性大，尤其是低次煙還有苦、辣、澀等缺點。經(jīng)過發(fā)酵處理可以不同程度地克服新煙和低次煙的不良品質(zhì)因素，減少或消除新煙帶有的青色，使葉色轉(zhuǎn)深，減少青雜氣和土雜氣，使香氣顯露，煙味醇和，減少刺激性和異味，使吸味和順，增加煙葉的彈性，增強煙葉的燃燒性并降低其吸濕能力。煙草醇化或者發(fā)酵方法一般分為人工醇化和自然醇化。人工醇化速度快，但醇化效果差；自然醇化是將煙葉按一定要求堆放在儲備庫內(nèi)，在一定濕度(有時還需控制溫度)條件下進行的醇化，醇化時間為I 一 3年。自然醇化雖然效果較好，但也存在一些不足，如:1)因煙葉富含營養(yǎng)物質(zhì)以及長期與外部環(huán)境密切接觸，煙葉很容易生蟲。2)在春夏秋冬四季變化過程中，因為溫度、濕度變化大，煙葉很容易產(chǎn)生霉變。3)因煙葉長期與過量空氣接觸，煙葉顏色很容易變褐、變深，所以自然醇化時間不能過長，一般不能超過三年。
[0004]19世紀80年代小什列晉格提出了微生物作用假說，認為煙葉發(fā)酵最初作用的是微生物，后續(xù)過程才是在無機催化劑作用下進行的。由于微生物種類繁多、繁殖速度快、代謝能力強及微生物酶的種類多，所以能高效率催化各種類型的生物化學(xué)反應(yīng)。在發(fā)酵開始階段，細菌數(shù)目大量增加，當煙堆溫度升高，氧氣缺少時，細菌數(shù)目逐漸減少。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，在正常發(fā)酵條件下，細菌增加，真菌減少，如果發(fā)酵條件控制不當，溫、濕度過高或缺氧，導(dǎo)致厭氧微生物數(shù)量增加，發(fā)酵后煙葉將產(chǎn)生異味。未發(fā)酵或人工發(fā)酵的烤煙葉面存在大量微生物群落，煙葉發(fā)酵過程中微生物的種類和數(shù)量總體呈下降趨勢，說明煙葉表面的微生物在煙葉發(fā)酵中起著重要的作用，從而影響煙葉的香氣和品質(zhì)。
[0005]無論是自然發(fā)酵還是人工發(fā)酵，整個煙葉發(fā)酵過程中，微生物的作用是不可忽略的。微生物對煙葉發(fā)酵品質(zhì)的提高主要通過微生物自身在生長代謝過程中以煙葉中的有機成分作為基質(zhì)，把糖類分解為醇類、酯類及其它芳香物質(zhì)，使煙葉的香味物質(zhì)得以充分表現(xiàn)，把蛋白質(zhì)降解為氨基酸等小分子物質(zhì)，把淀粉降解為水溶性糖，把果膠、木質(zhì)素、纖維素、酚類等降解為低分子量物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，再經(jīng)過煙草梅拉德反應(yīng)，使煙葉色澤、吸味和香氣得到充分改善。
[0006]煙草發(fā)酵酶制劑是專門用于改善煙氣品質(zhì)與特性的煙草添加劑，在葉組配方達到充足的煙氣濃度和強度后，使用該產(chǎn)品能夠改善煙氣氣溶膠性質(zhì)，使煙氣粒相變細，從而達到煙氣細膩、圓潤的效果。隨著市售酶制劑種類的日益增多，產(chǎn)品質(zhì)量也參差不齊，市場上時有低劣酶制劑出現(xiàn)，因此酶制劑的活力測定就起到了非常重要的作用。其中常用的測定淀粉酶活力的方法有四類，一是測定底物淀粉的消耗量，有粘度法、濁度法和淀粉-碘顯色法等；二為生糖法，測定產(chǎn)物葡萄糖的生成量；三為色原底物分解法，四是酶偶聯(lián)法。其中淀粉-碘顯色法測淀粉酶活力操作簡便迅速、實用。其原理是淀粉經(jīng)α-淀粉酶催化水解，生成產(chǎn)物為葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物淀粉濃度已知且過量的條件下，反應(yīng)后加入碘液與末被催化水解的淀粉結(jié)合成藍色復(fù)合物。其藍色的深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的空白管比較成比例，從而計算出淀粉量，推算淀粉酶活力。
[0007]煙草經(jīng)發(fā)酵劑處理后，需要進行淀粉及蛋白含量測定，以初步確定發(fā)酵液是否對煙草的醇化產(chǎn)生了作用。常用的淀粉含量測定方法有碘顯色法、費林試劑法、苯酚法和高氯酸提取法。其中碘顯色法采用對煙草粉末直接煮沸然后測定其濾液，方法比較簡單，但由于單純的加熱會破壞煙葉細胞壁使淀粉外露的效果不理想，從而測定的值比較小且誤差較大。費林試劑法、苯酚法是間接測定淀粉生產(chǎn)產(chǎn)物還原性糖類的含量，由于耗時、耗試劑且誤差大不予采取。高氯酸提取法以其能大量提取淀粉而被選做首選方法。
[0008]因此，研究和改進新的煙草薄片中淀粉降解技術(shù)，對卷煙企業(yè)提高卷煙品質(zhì)、節(jié)約生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟效益具有廣泛而現(xiàn)實的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明目的在于提供一種由枯草芽孢桿菌與淀粉酶、纖維素酶和糖化酶混合制成的菌酶聯(lián)合制劑及其在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一株枯草芽孢桿菌菌株xp,其分類命名為subti I is.xp,該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為=CCTCC No:M 2011452，保藏日期:2011年12月9日，保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(武漢大學(xué))。
[0011]一種利用上述枯草芽孢桿菌菌株XP制成的菌酶聯(lián)合制劑，其由下述步驟制得:
O斜面培養(yǎng):將菌株XP用LB液體培養(yǎng)基進行懸`浮，然后用接種環(huán)挑取菌液于20 -
40°C斜面培養(yǎng)2 - 14h ；
2)種子培養(yǎng):將步驟I)培養(yǎng)獲得的菌，在無菌條件下用接種環(huán)挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基于30 - 38°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl值為1.0 — 5.0，獲得種子液；3)將種子液與淀粉酶、纖維素酶和糖化酶按體積比1:1:1:1混勻后即得。
[0012]具體的，所述淀粉酶、纖維素酶和糖化酶的酶活濃度分別為6 - 9 U/ml、700 — 900U/ml 和 50 — 150 U/ml。
[0013]所述利用枯草芽孢桿菌菌株xp制成的菌酶聯(lián)合制劑在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用。
[0014]所述的菌酶聯(lián)合制劑在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用，具體為:將該菌酶聯(lián)合制劑在溫度28 - 32°C、濕度55 - 65%條件下均勻噴灑于煙草薄片表面或施加造紙法薄片的水溶性浸提液中。
[0015]本發(fā)明所用菌株xp經(jīng)16srDNA鑒定為高產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌。選用的淀粉酶、纖維素酶和糖化酶為普通市售產(chǎn)品。菌和酶的作用是共同將煙草細胞壁物質(zhì)初步部分降解，使酶與煙草細胞內(nèi)物質(zhì)充分接觸，達到將影響煙草吸食品質(zhì)的淀粉類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖、醇及其他小分子物質(zhì)的目的，以短時間、高效率和低成本提高煙草吸食品質(zhì)。
[0016]和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果:經(jīng)過菌酶聯(lián)合制劑處理過的煙草，評吸得分總分增加了 1.17分，使薄片等級明顯提高。使得在30天內(nèi)煙草薄片中淀粉降解水平達到原本陳化I 一 2年效果。
[0017]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為基于微生物菌株XP 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；
圖2為本發(fā)明菌酶聯(lián)合制劑噴灑培養(yǎng)時間對煙草薄片中淀粉含量的影響。
【具體實施方式】
[0018](一)枯草芽孢桿菌 {Bacillussubti I is、菌株xp的篩選:
由于煙草中的淀粉70%為支鏈淀粉，本申請以可溶性支鏈淀粉為底物，制作成瓊脂平板。在30°C、24hr的條件下使用煙田土壤水溶液進行涂板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)物經(jīng)過4°C的低溫處理24 - 72hr后，菌落周圍的培養(yǎng)基顏色變深，透明，在淀粉瓊脂培養(yǎng)基的白色背景中，能直接分離不受雜菌污染的菌株。根據(jù)淀粉酶的活力和透明圈直徑的關(guān)系測定不同菌株產(chǎn)生的淀粉酶的活力。在pH值4.0 — 6.0的瓊脂平板上進行篩選培養(yǎng)，即可得到耐酸性菌株xp。
[0019](二)枯草芽孢桿菌{Bacillus subti I is、菌株xp的鑒定:
篩選得到的菌株XP為革蘭氏陽性菌，該菌為棒桿狀，長有芽孢，外有莢膜，長約1.2Mffl，寬約0.4Mm。委托中國典型培養(yǎng)物保藏中心對其進行生理生化特性鑒定，結(jié)果見表1和表2，其16S rRNA基因序列比對結(jié)果見表3，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹數(shù)據(jù)見附圖1。
【權(quán)利要求】
1.一種含枯草芽孢桿菌菌株XP的菌酶聯(lián)合制劑，其特征在于，由下述步驟制得: 1)斜面培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌菌株XP用LB液體培養(yǎng)基進行懸浮，然后用接種環(huán)挑取菌液于20 - 40°C斜面培養(yǎng)2 - 14h ;所述的枯草芽孢桿菌菌株xp分類命名為Bacillussubti I is.xp，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為:CCTCC No:M 2011452 ； 2)種子培養(yǎng):將步驟I)培養(yǎng)獲得的菌，在無菌條件下用接種環(huán)挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基于30 - 38°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl值為1.0 — 5.0，獲得種子液； 3)將種子液與淀粉酶、纖維素酶和糖化酶按體積比1:1:1:1混勻后即得。
2.如權(quán)利要求1所述含枯草芽孢桿菌菌株xp的菌酶聯(lián)合制劑，其特征在于，所述淀粉酶、纖維素酶和糖化酶的酶活濃度分別為6 — 9 U/ml、700 — 900 U/ml和50 — 150 U/ml。
3.權(quán)利要求1所述的菌酶聯(lián)合制劑在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的菌酶聯(lián)合制劑在加速煙草薄片中淀粉降解方面的應(yīng)用，其特征在于，將該菌酶聯(lián)合制劑在溫度28 - 32°C、濕度55 - 65%條件下均勻噴灑于煙草薄片表面或施加于造紙法薄片的水溶性浸提液中`。
【文檔編號】C12N9/42GK103756946SQ201410047775
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】馬宇平, 周浩, 王墨染, 宋金勇, 彭玉富, 唐鴻志 申請人:河南中煙工業(yè)有限責任公司