專利名稱：一種生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株及生產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株及生產(chǎn) 工藝。
背景技術：
β-甘露聚糖酶(β-mannanase ;endo_l, 4_ β-D-mannanmannohydrolase ； EC3. 2. 1.78，簡稱甘露聚糖酶)是水解1，4-β-D-蚍喃甘露糖主鏈的內(nèi)切水解酶，屬于半 纖維素酶類，作用底物主要是半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚 糖。甘露聚糖酶廣泛存在于自然界中，在一些低等動物，如海洋軟體動物腸道分泌液 中，某些豆類植物萌發(fā)的種子中，以及天南星科植物魔芋萌發(fā)的球莖中都發(fā)現(xiàn)了酶活性的 存在。而對于微生物，更是產(chǎn)生甘露聚糖酶的主要來源。已報道的如細菌中的芽抱桿菌、假 單胞菌、弧菌，真菌里的曲霉、木霉、酵母，放線菌中的鏈霉菌等都是產(chǎn)甘露聚糖酶的常見類 群。大量研究資料表明，除在個別微生物體內(nèi)以結(jié)構(gòu)酶形式存在外，甘露聚糖酶一般 以胞外誘導酶的形式存在于生物體中。對于大部分產(chǎn)甘露聚糖酶的微生物，在培養(yǎng)基中添 加少量的甘露聚糖或甘露寡糖，如魔芋粉、角豆膠或其水解物等，就能極大提高產(chǎn)酶水平。 魔芋屬于天南星科，多年生草本植物，是由葡萄糖和甘露糖以2 3摩爾分子比例相結(jié)合起 來的多糖類物質(zhì)。魔芋精粉中含有40-70%的葡甘聚糖，由于其來源廣泛價格便宜，是目前 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶生產(chǎn)中使用最為廣泛的碳源。國內(nèi)外對于甘露聚糖酶及其產(chǎn)生菌的研究開始于上世紀70年代末。Rihei Takahashi等報道了通過平板透明圈篩選法從土壤中尋找甘露聚糖酶微生物的試驗方法。 1988年Akino T首次報道由嗜堿性微生物-嗜堿芽抱桿菌(Bacillus alcalophilus)AM001 來生產(chǎn)甘露聚糖酶，該酶有三個組分的胞外酶。楊文博等對產(chǎn)甘露聚糖酶的地衣芽抱桿菌 的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明以魔芋粉為碳源的發(fā)酵產(chǎn)酶效果最好。Charles W等提 出了一種新的培養(yǎng)基配方進行對產(chǎn)半纖維素酶的微生物篩選，并篩選到了有較高甘露聚糖 酶產(chǎn)酶活性的菌株。Julio Xandro H等對木聚糖酶及甘露聚糖酶產(chǎn)生菌，環(huán)狀芽抱桿菌 (Bacillus circulans)BL53的固體培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。柴萍萍等對產(chǎn)甘露聚糖酶的枯草 芽抱桿菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并最終得到SDS-PAGE電泳所確認的電泳純酶。在甘露聚糖酶基礎研究取得重要成果的同時，它的應用研究也進入一個高潮，現(xiàn) 已在食品、醫(yī)藥、造紙、紡織印染、石油開采及生物研究技術等多方面得到廣泛應用。在造紙工業(yè)中，甘露聚糖酶和β -木聚糖酶等半纖維素酶類協(xié)同使用，處理紙漿， 能明顯改善紙質(zhì)；用于紡織印染方面，能有效地去除產(chǎn)品上粘附的多余染料，降低了能耗和 對環(huán)境的污染。甘露聚糖酶是油井石油壓裂液的優(yōu)良生物破膠劑，具有效率高、成本低、適 用范圍廣、對地層傷害小等特點。此外，甘露聚糖酶作為一種工具酶類，在糖工程、糖結(jié)構(gòu)分 析、植物基因工程等生物基礎研究中有著重要的用途。甘露聚糖酶水解甘露多糖，獲得的甘露寡糖有很好的生物調(diào)節(jié)功能，能有效降低人體膽固醇水平，減輕便秘、降低血糖、促進腸 道中雙歧桿菌的生長，是良好的食品添加劑，國外現(xiàn)已廣泛用于保健食品中。植物是自然界主要的可再生有機資源，半纖維素占植物干重的35 %，在自然界中 僅次于纖維素。近年來，隨著甘露寡糖在飼料業(yè)中的需求越來越大，如何高效的獲得甘露寡 糖日益受到科研工作者的關注，而甘露寡糖的制備與甘露聚糖酶的酶活及其作用條件 有著密切的關系。國內(nèi)外研究主要集中于液體發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶，液體發(fā)酵方式生產(chǎn)成本高，限制 了其在工業(yè)上的應用。如國內(nèi)的屈野、馬建華、崔福綿等及國外的Mendoz^Khanongnuch等 都是研究液體發(fā)酵條件下產(chǎn)甘露聚糖酶，產(chǎn)酶水平最高達336. 3U/mL。國內(nèi)僅有朱劼報道的 黑曲霉產(chǎn)酸性甘露聚糖酶及鄔敏辰報道的宇佐美曲酶產(chǎn)飼用復合酶。其次，篩選出來的菌 株所產(chǎn)甘露聚糖酶活低，且需要底物誘導發(fā)酵工藝復雜，成本高，產(chǎn)率低等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，利用該菌株生產(chǎn)β-甘露聚糖酶 生產(chǎn)工藝簡單，提取成本低廉。一種用于生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) Bacillus subtilis-hzbzbc，保藏位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO. 4358，保藏日期為2010 年11月22日。該菌株為革蘭氏陽性菌，具有莢膜，能在20 60°C溫度范圍內(nèi)生長，最適生長溫 度為37 50°C，生長pH是5 11，最適生長pH為7 8。能水解淀粉，能耐7 %的NaCl 生長，硝酸鹽還原、過氧化氫酶測定、V. P實驗、檸檬酸鹽及丙酸鹽利用、亞硝酸鹽還原、明膠 液化、甲基紅實驗、酪素水解結(jié)果為陽性，硫化氫實驗、吲哚實驗結(jié)果為陰性。本發(fā)明還提供了一種利用上述菌株生產(chǎn)甘露聚糖酶的方法，包括將菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 50°C下培養(yǎng)M 48小時，分離得到β -甘 露聚糖酶。發(fā)酵培養(yǎng)基可以選用如下配方魔芋精粉15. 0 25g/L，酵母膏5. 0 10g/L、 Κ2ΗΡ045· 0 8g/L、MgCl2. · 6H20 0· 1 0. 5g/L、NaN035. 0 8g/L。本發(fā)明菌株生產(chǎn)的β-甘露聚糖酶酶活力較高，最佳PH值為2.5，最佳溫度為 500C，并具有較好的pH值和溫度穩(wěn)定性，同時該酶對金屬離子和螯合劑的穩(wěn)定也較好。


圖1為本發(fā)明菌株生產(chǎn)的β-甘露聚糖酶活性隨Wi值變化曲線以及Wi值穩(wěn)定性 曲線；圖2為本發(fā)明菌株生產(chǎn)的β -甘露聚糖酶活性隨溫度變化曲線以及溫度穩(wěn)定性曲 線.
一入 ，圖3為發(fā)明菌株生產(chǎn)的甘露聚糖酶反應動力學曲線圖。
具體實施例方式實施例1菌株分離純化1、培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基(g/L)魔芋精粉20，KH2PO4O. 5，pH自然；分離培養(yǎng)基(g/L)魔芋精粉5. 0，酵母膏2. 0，蛋白胨10，KH2PO4O. 1，MgSO4 · 6H20 0. 12，瓊脂 20. 0, pH 自然；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)魔芋精粉20. 0，酵母膏 5. 0，NaN035. 0，MgSO4 · 6Η200· 2， Κ2ΗΡ045. 0, pH 自然；2、菌株的分離采集魔芋種植地中的土樣經(jīng)無菌水稀釋靜置，取適量上清液接種于富集培養(yǎng)基 中，37°C搖床培養(yǎng)36小時，取搖瓶中粘度下降最明顯的培養(yǎng)液1. OmL，按常規(guī)方法梯度稀釋 后，涂布在分離培養(yǎng)基平板上，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24小時，在分離平板中滴 加濃度為的剛果紅溶液適量，挑取有淡黃色透明圈的菌落，進一步劃線分離純化。將分 離到的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中于37°C，120r/min，搖瓶培養(yǎng)24h，最終分離篩選到分解利 用魔芋精粉能力最強、產(chǎn)甘露聚糖酶活最高的菌株。實施例2菌株的初步鑒定根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及《微生物學實驗手冊》對其進行形態(tài)特征、培 養(yǎng)特征，生理生化測定等方面的初步鑒定。菌株為革蘭氏陽性芽孢桿菌，具有莢膜。能在20 60°C溫度范圍內(nèi)生長，最適生 長溫度為37 50°C，生長pH是5 11，最適生長pH為7 8。能水解淀粉，能耐7%的NaCl 生長，硝酸鹽還原、過氧化氫酶測定、V. P實驗、檸檬酸鹽及丙酸鹽利用、亞硝酸鹽還原、明膠 液化、甲基紅實驗、酪素水解結(jié)果為陽性，硫化氫實驗、吲哚實驗結(jié)果為陰性。該菌株經(jīng)鑒定 命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Bacillus subtilis-hzbzbc。保藏位于北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保 藏編號為CGMCC NO. 4358，保藏日期為2010年11月22日。實施例3發(fā)酵生產(chǎn)β -甘露聚糖酶將菌株接種到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時，制得種子液，將種子液接入裝有30ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置于回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中進行好氧發(fā)酵，轉(zhuǎn)速200r/ min，37°C發(fā)酵24小時，發(fā)酵液離心lOOOr/min離心10分鐘，取上清液，即為β -甘露聚糖 酶粗酶液，4°C保存。種子培養(yǎng)基(g/L):氯化鈉10，蛋白胨10，酵母膏5，瓊脂20。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)魔芋精粉20. O、酵母膏 5. O、K2HP045. Og, MgCl2. · 6Η20 0. 2、 NaN035. 0，ρΗ5· 5。實施例4最適pH值和pH穩(wěn)定性分析酶活力測試方法(DNS法)用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩(0. 05mol/ LNa2HPO4. 12H20-0. 025mol/L檸檬酸)沖溶液配制質(zhì)量分數(shù)0. 5%的角豆膠溶液，取兩只 20ml的試管A、B，往兩只試管內(nèi)加入0. 9ml的角豆膠溶液，預熱5min后，往A管中加入0. Iml 經(jīng)適當稀釋的β -甘露聚糖酶粗酶液，反應10分鐘后，往Α、Β管中加入2. Oml的DNS試齊IJ， B管中補加0. Iml上述稀釋的酶液(經(jīng)沸水浴IOmin)，沸水保溫5min。冷卻后各加入5ml蒸餾水，測量MOnm處的吸光值。一個β-甘露聚糖酶活力單位為Imin降解角豆膠生成 1 μ mol相當于D-甘露糖的還原糖的酶量。最佳pH值測試利用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制pH值分別為2. 5,3. 5,4. 5、 5. 5,6. 5,7. 5,8. 0的角豆膠蛋白溶液，以這些角豆膠蛋白溶液作為底物溶液，以最高酶活力 為100 %，測量β -甘露聚糖酶粗酶液在不同PH值下的相對酶活力，具體檢測結(jié)果如圖1所 示，最適PH值為2. 5。pH值穩(wěn)定性測試用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制PH值分別為2. 5,3. 5,4. 5、 5. 5,6. 5,7. 5,8. 0的β -甘露聚糖酶溶液，在60°C下水浴保溫30min，測量酶溶液在50°C、pH 2. 5的條件下的相對酶活力，具體如圖1所示，可見本發(fā)明β -甘露聚糖酶pH值穩(wěn)定性較好。實施例5最適溫度和溫度穩(wěn)定性分析用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液配制質(zhì)量分數(shù)0. 5%的角豆膠溶液，溶液pH值 2. 5，測量 β-甘露聚糖酶在 20°c、30°c、40°c、50°c、55°c、60°c、70°c、80°c、90°c 下的相對 酶活力，結(jié)果如圖2所示，最適反應溫度為50°C。用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制pH值分別為2. 5的β -甘露聚糖酶溶液，在不 同溫度(20°c、30°c、40°c、50°c、60°c、70°c、80°c )下水浴加熱30min，放入冰水中冷卻，測 定β-甘露聚糖酶在50°C、pH 2. 5的條件下的相對酶活力，結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明β-甘 露聚糖酶具有較好的溫度穩(wěn)定性。實施例6酶動力學參數(shù)測定用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2. 5)配制成不同濃度(l-20mg/mL)的甘露聚 糖溶液并以此為底物，測量β -甘露聚糖酶在50°C下的酶活力，繪制如圖3所示米氏方程 (V = -KmXV/[S]+Vmax)雙倒數(shù)曲線，計算 Km值為 0. 91mg/mL、Vmax 值為 909. 09U/mg。表明 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的β-甘露聚糖酶具有較高的酶活力。實施例7金屬離子和螯合劑(EDTA)對酶活力的影響利用磷酸氫二鈉-檸檬酸鹽緩沖液(pH 2. 5)配制ImM的不同化合物(MgCl2、 FeCl2, MnSO4, ZnCl2, CaCl2, NaCl, EDTA)溶液，將β -甘露聚糖酶與上述溶液混合并60°C下 水浴30min，以未經(jīng)金屬離子和螯合劑處理的β -甘露聚糖酶液作為空白對照，測量各經(jīng)處 理酶液的相對酶活力，結(jié)果如下表所示，該酶具有較高的金屬離子穩(wěn)定性。
權利要求
1.一種生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，其特征在于命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Bacillus subtilis-hzbzbc，保藏編號為 CGMCCN0. 4358。
2.一種利用權利要求1所述的菌株生產(chǎn)甘露聚糖酶的方法，包括將菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在37 50°C下培養(yǎng)M 48小時，分離得到β -甘露聚 糖酶。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為魔芋精粉 15. 0 25g/L，酵母膏 5. 0 10g/L、Κ2ΗΡ045· 0 8g/L、MgCl2 · 6H20 0. 1 0. 5g/L、NaN035. 0 8g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株及生產(chǎn)工藝，該菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)bacillus subtilis-hzbzbc，保藏位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO.4358，保藏日期為2010年11月22日。本發(fā)明菌株生產(chǎn)的β-甘露聚糖酶酶活力較高，最佳pH值為2.5，最佳溫度為50℃，并具有較好的pH值和溫度穩(wěn)定性，同時該酶對金屬離子和螯合劑的穩(wěn)定也較好。
文檔編號C12N1/21GK102146354SQ201010601999
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者胡偉卿, 胡佳佳, 胡向東 申請人:杭州貝姿生物技術有限公司