吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種吩嗪?1?甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法；包括：對(duì)待篩選的吩嗪?1?甲酰胺高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行培養(yǎng)至PCN產(chǎn)量穩(wěn)定；將獲得的發(fā)酵液與乙醇混合、加入銅離子，得預(yù)處理混合液；將預(yù)處理后的發(fā)酵液置于96孔板，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)365nm下的吸光度；選取吸光值高的吩嗪?1?甲酰胺高產(chǎn)突變菌株，即可。本發(fā)明的高通量篩選辦法可以快速對(duì)多個(gè)突變株的產(chǎn)量高低進(jìn)行大致判斷，可快速淘汰負(fù)突變菌株，選定相對(duì)高產(chǎn)的正突變菌株，縮短初篩時(shí)間，減少工作量，為后續(xù)的發(fā)酵復(fù)篩工作提供有益參考。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
吩嗪-1 -甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及菌株的高通量篩選方法，具體涉及一種吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]吩嗪類(lèi)化合物可作為生物農(nóng)藥使用。目前已經(jīng)應(yīng)用的有申嗪霉素(公開(kāi)號(hào)CN1802927)，其有效成分為吩嗪-1-羧酸(PCA)。吩嗪-1-甲酰胺(Phenazine-1-carboxamide，PCN)，具有措抗植物病原真菌功能，也有發(fā)展為生物農(nóng)藥的潛力，但目前限制其產(chǎn)業(yè)化的主要因素是產(chǎn)量較低。對(duì)于微生物源的小分子產(chǎn)物，提高產(chǎn)量的主要方式是誘變育種和基因工程育種。誘變育種是較為簡(jiǎn)單、快速的方式。高效的初篩手段是限制誘變育種效率的關(guān)鍵因素。
[0003]原有的篩選方法:HT66是由水稻根際分離的合成PCN的菌株，具有產(chǎn)物單一、產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)。張平原(張平原等.高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的綠針假單胞菌的誘變與基因工程育種)和譚劍(譚劍等.ARTP技術(shù)選育吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株及發(fā)酵優(yōu)化)在其誘變育種過(guò)程中，采用目測(cè)菌落表面綠色PCN晶體量的方式進(jìn)行初篩，取得了良好效果。但隨著菌株產(chǎn)量提高，該方法效率下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的隨著突變菌株產(chǎn)量提高，菌落產(chǎn)物都較多，已經(jīng)難以通過(guò)肉眼對(duì)產(chǎn)量高低進(jìn)行大致判斷的不足，提供一種吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法;可以大幅提高篩選效率，大幅增加單批次篩選的菌株數(shù)量，減少工作量，縮短實(shí)驗(yàn)周期。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0006]本發(fā)明涉及一種吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，所述方法包括如下步驟:
[0007]S1、對(duì)待篩選的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行培養(yǎng)至PCN產(chǎn)量穩(wěn)定；
[0008]S2、將步驟SI獲得的發(fā)酵液與乙醇混合、加入銅離子，得預(yù)處理混合液；
[0009]S3、將預(yù)處理后的發(fā)酵液置于微孔板，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)365nm下的吸光度；
[0010]S4、選取吸光值高的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)突變菌株，即可。
[0011]優(yōu)選的，步驟SI中，所述培養(yǎng)采用KB培養(yǎng)基，于20?35°C、150?350rpm的搖床中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng);每L所述KB培養(yǎng)基含胰蛋白胨18?24g，甘油12?18mL，磷酸二氫鉀0.4?0.8g，無(wú)水硫酸鎂0.4?0.8g。
[0012]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)采用KB培養(yǎng)基，于28°C、180rpm的搖床中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng);每L所述KB培養(yǎng)基含胰蛋白胨20.0g，甘油15mL，磷酸二氫鉀0.514g，無(wú)水硫酸鎂0.732g。
[0013]優(yōu)選的，步驟SI中，所述培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基，于20?35°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);所述固體培養(yǎng)基含瓊脂10?16g/L。
[0014]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);所述固體培養(yǎng)基含瓊脂15g/L。
[0015]優(yōu)選的，步驟SI中，所述培養(yǎng)是在方孔深孔板中培養(yǎng)的。這種培養(yǎng)板具有剪切力好、裝液量大、透氣性好(適合于好氧細(xì)菌培養(yǎng))等優(yōu)點(diǎn)。
[0016]優(yōu)選的，步驟SI中，使用微生物篩選系統(tǒng)Qpix進(jìn)行吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)突變菌株菌落的挑選。
[0017]優(yōu)選地，步驟S2中，所述預(yù)處理混合溶液中，銅離子的來(lái)源包括氯化銅。
[0018]優(yōu)選地，所述預(yù)處理混合溶液中，氯化銅的終濃度為50?200mg/L、乙醇的體積百分比含量為20?70%。
[0019]優(yōu)選地，所述氯化銅可以通過(guò)氯化銅溶液加入。
[0020]進(jìn)一步優(yōu)選地，氯化銅溶液的濃度為250mg/L。
[0021 ]特別優(yōu)選地，步驟S2中，混合液中氯化銅的終濃度為100mg/L。
[0022]優(yōu)選的，步驟S3中，所述微孔板為Corning 3635 96孔板。
[0023]Qpix是用于從挑取菌落，用于將稀釋涂布的平板菌落接種至培養(yǎng)板中的這一步驟。通過(guò)將涂布的培養(yǎng)皿和孔板放入機(jī)器，設(shè)置隨機(jī)挑選(機(jī)器可以設(shè)置邊緣形狀、顏色、軸比、直徑及距離等，但由于后續(xù)要篩選，不需設(shè)置)或手動(dòng)挑選，按需要的篩選量設(shè)置挑選菌落的數(shù)量，機(jī)器的挑針會(huì)自動(dòng)將菌落挑至孔板中。
[0024]本發(fā)明中，使用Qpix和Corning3635都是優(yōu)選方案，采用這些方案會(huì)讓篩選過(guò)程更為簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，若不使用，也可以進(jìn)行，并不影響篩選方法的有效性。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0026]I)本發(fā)明的高通量篩選辦法可以代替原有的觀察菌落的方法，應(yīng)用在PCN高產(chǎn)菌株誘變育種的初篩工作上，能夠一次性對(duì)大量誘變單克隆進(jìn)行篩選。
[0027]2)可以快速對(duì)多個(gè)突變株的產(chǎn)量高低進(jìn)行大致判斷，可快速淘汰負(fù)突變菌株，選定相對(duì)高產(chǎn)的正突變菌株，縮短初篩時(shí)間，減少工作量，為后續(xù)的發(fā)酵復(fù)篩工作提供有益參考。
[0028]3)相比傳統(tǒng)的篩選方法，高通量篩選方法具有簡(jiǎn)單易行、迅速高效的特征，可以降低誘變育種的工作量，為獲得高產(chǎn)的突變株提供可靠保障。
【附圖說(shuō)明】
[0029]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0030]圖1為PCN的紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描圖譜；
[0031]圖2為發(fā)酵液與稀釋10倍的發(fā)酵液的全波長(zhǎng)掃描圖譜；
[0032]圖3為乙醇的添加對(duì)稀釋的發(fā)酵液中PCN吸收峰的影響示意圖；
[0033]圖4為銅離子添加對(duì)稀釋的發(fā)酵液中PCN吸收峰的影響示意圖；
[0034]圖5為含PCN的發(fā)酵液在320nm和365nm處附近的吸收值圖譜；
[0035]圖6為各稀釋倍數(shù)下不同銅離子添加量的365nm處的吸收值對(duì)比圖；
[0036]圖7為各稀釋倍數(shù)下不同銅離子添加量的f值對(duì)比圖；
[0037]圖8為HPLC檢測(cè)的PCN產(chǎn)量與365nm吸光度的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0039]實(shí)施例
[0040]本實(shí)施例涉及一種吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，該菌株為綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株HT66;也可以采用其經(jīng)多輪物理和化學(xué)誘變獲得的衍生菌株，如采用亞硝基胍和紫外線誘變處理獲得的誘變高產(chǎn)株P(guān)3(高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的綠針假單胞菌的誘變與基因工程育種，上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，第33卷第2期，2015年4月)，或采用從P3出發(fā)，采用ARTP技術(shù)選育到的突變株P(guān)3-9(ARTP技術(shù)選育吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株及發(fā)酵優(yōu)化，生物技術(shù)通報(bào)，2016.32 (I): 174-179)。
[0041 ]本實(shí)施例的高通量篩選方法的篩選過(guò)程如下:
[0042]1、對(duì)待篩選的突變菌株進(jìn)行培養(yǎng)至PCN產(chǎn)量穩(wěn)定。
[0043]菌株培養(yǎng)采用KB培養(yǎng)基，每L含胰蛋白胨20.0g，甘油15mL，磷酸二氫鉀0.514g，無(wú)水硫酸鎂0.732g，固體培養(yǎng)基含瓊脂15g(312rC高溫滅菌20min。
[0044]菌株培養(yǎng)條件為:固體平板培養(yǎng)于28°C培養(yǎng)箱中，液體發(fā)酵培養(yǎng)于28°C、180rpm的搖床中。發(fā)酵接種的初始OD6qq為0.2。
[0045]2、檢測(cè)指標(biāo)、發(fā)酵液樣品預(yù)處理方案的建立
[0046]2.1波長(zhǎng)檢測(cè)指標(biāo)的篩選
[0047]基于96孔板的微生物產(chǎn)物的高通量篩選多采用紫外吸光法或熒光檢測(cè)法，考慮到PCN熒光較弱，且培養(yǎng)基中其他物質(zhì)也有熒光，熒光法難以實(shí)施。在發(fā)明中，通過(guò)對(duì)PCN的紫夕卜-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描建立篩選波長(zhǎng)檢測(cè)指標(biāo)(365nm)，具體包括:將PCN的標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇中，形成濃度適宜的溶液，并以甲醇作為空白對(duì)照，各取200yL置于紫外透明的96孔板中，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描，以確定PCN的紫外-可見(jiàn)光吸收曲線，并確定適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0048]在紫外-可見(jiàn)光掃描過(guò)程(圖1)中發(fā)現(xiàn)，PCN在365nm處有吸收峰(雖然在250nm附近也有吸收峰，但培養(yǎng)基中其他物質(zhì)也在小波長(zhǎng)下存在吸收，干擾極大，不適合用作PCN篩選的指標(biāo))，且培養(yǎng)基及菌株其他產(chǎn)物在該波長(zhǎng)下沒(méi)有明顯的吸收峰。
[0049]2.2預(yù)處理中，發(fā)酵液稀釋步驟的確定
[0050]在本發(fā)明中，當(dāng)發(fā)酵液中存在較高濃度的PCN時(shí)，單純的發(fā)酵液在365nm處的吸收值已經(jīng)難以分辨產(chǎn)量的細(xì)微差異。另外，雖然發(fā)酵液中PCN濃度大，但培養(yǎng)基本身成分復(fù)雜，加上發(fā)酵液中溶有細(xì)菌的菌體和其他代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)均可能吸收紫外線，這在很大程度上掩蓋了 PCN的吸收峰。直接以發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)背景吸收值直接將產(chǎn)物吸收峰覆蓋，無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，考慮到:第一，由于發(fā)酵液中PCN濃度較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出線性范圍，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行低倍數(shù)的稀釋不會(huì)導(dǎo)致吸收峰的峰高成倍降低;第二，發(fā)酵液稀釋后，發(fā)酵液中低濃度的其他物質(zhì)的吸收值則能夠成倍降低。因此，確定對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋?zhuān)皇悄軌虼蠓コ尘拔罩档挠绊懀悄軌虮M可能少地消弱PCN本身的吸收峰，提高信噪比。
[0051]通過(guò)對(duì)發(fā)酵液與稀釋10倍的發(fā)酵液的全波長(zhǎng)掃描(圖2)比較也發(fā)現(xiàn)，將發(fā)酵液進(jìn)行稀釋?zhuān)山档捅尘拔罩?，使吸收峰顯露，使得檢測(cè)較為準(zhǔn)確。
[0052]2.3預(yù)處理中，有機(jī)溶劑添加步驟的確定
[0053]在本發(fā)明中，將發(fā)酵液進(jìn)行稀釋后仍難以滿足檢測(cè)的要求，需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行其他處理，以滿足檢測(cè)的靈敏度要求。
[0054]由于PCN在水中溶解度低，使得發(fā)酵液中PCN可以晶體形式析出，使紫外吸收值測(cè)量不準(zhǔn)確。為使PCN溶解便于檢測(cè)，本發(fā)明在發(fā)酵液中添加有機(jī)溶劑，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多種有機(jī)溶劑在50%的體積比下都能較好地溶解PCN，且能使PCN吸收峰升高同等程度，且都不會(huì)提高背景吸收峰。乙醇是一種相對(duì)廉價(jià)、容易獲取且無(wú)毒的試劑，故采用之。至于添加的比例，理論上能夠?qū)CN完全溶解，又不影響銅離子溶解即可。50%是較合適的濃度(圖3)。
[0055]2.4預(yù)處理中，銅離子添加步驟的確定
[0056]本發(fā)明中，為了滿足檢測(cè)的靈敏度要求，在稀釋發(fā)酵液和添加有機(jī)溶劑的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加銅離子。含氮的芳香化合物經(jīng)?？膳c金屬離子形成配合物，使光學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化。由圖4可見(jiàn)，在稀釋的發(fā)酵液中添加氯化銅，使其與PCN配合后，可顯著提高PCN吸收峰，且在添加量為100mg/L以?xún)?nèi)，峰高與銅離子添加量呈現(xiàn)正相關(guān)。(也曾使用氯化鐵(III)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但發(fā)現(xiàn)不能提高PCN吸收峰，反而會(huì)使背景吸收值大幅提高。)另外，由圖4還可見(jiàn)，設(shè)置了稀釋的培養(yǎng)基作為對(duì)照，按同樣的添加量加入銅離子，可以發(fā)現(xiàn)銅離子并不會(huì)對(duì)培養(yǎng)基中物質(zhì)的吸收值造成顯著改變。
[0057]2.5、預(yù)處理中，稀釋濃度和銅添加量的確定
[0058]由于不同的發(fā)酵液稀釋度和銅離子添加量均可以導(dǎo)致不同的峰值，因此，需要對(duì)紫外吸收方法的靈敏度進(jìn)行考量，以選擇一個(gè)合適的發(fā)酵液稀釋度和銅離子的添加量。
[0059]從含PCN的發(fā)酵液的吸收?qǐng)D譜(圖5)看，除PCN會(huì)在365nm處存在吸收峰外，在小波長(zhǎng)一側(cè)的320nm處存在一個(gè)吸收谷。當(dāng)發(fā)酵液未經(jīng)稀釋?zhuān)蚝休^高濃度的雜質(zhì)時(shí)，均會(huì)“填平”320nm處的吸收谷。
[0060]因此，本發(fā)明建立Jf = OD365nm/OD32Qnm來(lái)表征峰的明顯程度。當(dāng)f值大于I時(shí)，說(shuō)明吸收曲線明顯呈現(xiàn)峰形;而當(dāng)f值小于I時(shí)，吸收曲線不呈現(xiàn)峰形，f值越大則峰形越顯著，而說(shuō)明該處理方法的靈敏度越高。
[0061]本發(fā)明考慮到對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋會(huì)產(chǎn)生背景吸收值降低和PCN吸收峰降低的雙重效果，氯化銅添加則會(huì)導(dǎo)致PCN吸收峰升高和背景吸收值升高的雙重效果，使用365nm處的絕對(duì)吸收值為第一個(gè)判斷指標(biāo)。另外，為了得到一個(gè)合適的稀釋比例和氯化銅添加量，使得PCN吸收峰值與背景吸收值比相對(duì)最高，以獲得最靈敏的檢測(cè)條件，采用365nm與320nm吸收值的比(f值)來(lái)表征檢測(cè)的靈敏度，作為第二個(gè)判斷指標(biāo)。
[0062]由圖6、7可見(jiàn)，更高的稀釋度除了會(huì)降低PCN絕對(duì)吸收值外，也會(huì)降低f值。故選取10倍稀釋度。并且，較高的氯化銅添加量也不會(huì)提高PCN的絕對(duì)吸收值和f值。可見(jiàn)，在稀釋10倍的發(fā)酵液中添加終濃度為100mg/L的銅離子時(shí)，不論從365nm處峰高還是從f值來(lái)看，檢測(cè)靈敏度均較好。從365nm處的峰高來(lái)看，比稀釋10倍但不添加銅離子的對(duì)照提高62.1%;從f值來(lái)看，較比不稀釋、不添加銅離子的對(duì)照靈敏度提高60.9%。
[0063]以這兩種指標(biāo)考量前述有機(jī)試劑的添加對(duì)檢測(cè)靈敏度的提高效果，以乙醇為例，峰高提高了51.0%，f值提高了48.7%。
[0064]3、取待篩選的突變菌株的發(fā)酵液樣品與氯化銅溶液、乙醇混合，體積比為1:4: 5，氯化銅終濃度為100mg/L，并充分混勻。
[0065]4、將預(yù)處理后的樣品置于96孔板中，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)365nm下的吸光度。(96孔板建議使用Corning 3635，該產(chǎn)品對(duì)紫外線透明，可減少不必要的背景吸收值)
[0066]5、選取吸光值高的菌株。
[0067]具體應(yīng)用實(shí)例如下:
[0068]在一次Co-60射線誘變工作中，對(duì)20株突變株(為P3-9的突變株，即以P3-9為出發(fā)株，經(jīng)過(guò)Co-60 γ射線誘變過(guò)后的突變株)在采用HPLC篩選的同時(shí)，使用本發(fā)明建立的高通量篩選方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，以對(duì)比兩種方法的相關(guān)程度。發(fā)酵液仍采用10倍的稀釋度，稀釋的發(fā)酵液中含有一半體積的乙醇和終濃度為100mg/L的氯化銅。
[0069]由圖8可見(jiàn)，利用本發(fā)明建立的篩選方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行365nm紫外吸光度檢測(cè)的數(shù)值，與HPLC檢測(cè)獲得的PCN濃度有明顯的正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明建立的高通量篩選方法有具有一定的可靠性，可以快速淘汰低產(chǎn)株，選擇高產(chǎn)株進(jìn)行進(jìn)一步產(chǎn)量檢測(cè)。
[0070]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 51、對(duì)待篩選的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行培養(yǎng)至PCN產(chǎn)量穩(wěn)定； 52、將步驟SI獲得的發(fā)酵液與乙醇混合、加入銅離子，得預(yù)處理混合液； 53、將預(yù)處理混合液置于微孔板，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)365nm下的吸光度； 54、選取吸光值高的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)突變菌株，即可。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，步驟SI中，所述培養(yǎng)采用KB培養(yǎng)基，于20?35°C、150?350rpm的搖床中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng);每L所述KB培養(yǎng)基含胰蛋白胨18?24g，甘油12?18mL，磷酸二氫鉀0.4?0.8g，無(wú)水硫酸鎂0.4?0.8g03.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，步驟SI中，所述培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基，于24?30°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);所述固體培養(yǎng)基含瓊脂10?16g/L04.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，所述培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基，于28 0C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);所述固體培養(yǎng)基含瓊脂15g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，步驟SI中，所述培養(yǎng)是在方孔深孔板中培養(yǎng)的。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，步驟SI中，使用微生物篩選系統(tǒng)Qpix進(jìn)行吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)突變菌株菌落的挑選。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，步驟S2中，所述預(yù)處理混合溶液中，銅離子的來(lái)源包括氯化銅。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，所述預(yù)處理混合溶液中，氯化銅的終濃度為50?200mg/L、乙醇的體積百分比含量為20?70%。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的吩嗪-1-甲酰胺高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于，所述預(yù)處理混合溶液中，氯化銅的終濃度為100mg/L。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK106011219SQ201610317090
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】彭華松, 熊欣, 張雪洪, 江耀祖
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)