一種微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1,5-戊二胺的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1,5?戊二胺的方法。該方法包括：配種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖補料培養(yǎng)液、甘油補料培養(yǎng)液、乳糖誘導(dǎo)液以及賴氨酸溶液；對發(fā)酵罐，步驟1中的培養(yǎng)基以及三角瓶滅菌，其中步驟1中發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖單獨滅菌；取三角燒瓶接入種子培養(yǎng)基，分別接入產(chǎn)丁二酸菌和產(chǎn)賴氨酸脫羧酶菌培養(yǎng)后作為發(fā)酵菌種；向裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中通入無菌空氣或純O2，接入產(chǎn)丁二酸菌和產(chǎn)賴氨酸脫羧酶菌作為出發(fā)菌株，并加入葡萄糖補料培養(yǎng)液、甘油補料培養(yǎng)液和乳糖誘導(dǎo)液，控制菌體比生長速率發(fā)酵；厭氧轉(zhuǎn)化階段，控制葡萄糖濃度和pH即得產(chǎn)物1,5?戊二胺的方法。本發(fā)明方法簡單易行，節(jié)約成本。
【專利說明】
-種微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及1,5-戊二胺發(fā)酵和生物催化領(lǐng)域，具體設(shè)及一種微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn) 1,5-戊二胺的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 1,5-戊二胺（1,5-pentanediamine )，又名尸胺（Cadaverine)、1,5-二氨基戊燒、 五亞甲基二胺或尸毒素，是生物胺類(包括腐胺、精胺、亞精胺和尸胺等）中的一種，是生物 體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，為蛋白質(zhì)腐敗時賴氨酸在脫簇酶作用下發(fā)生脫簇 反應(yīng)時生成的產(chǎn)物。在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)上，1,5-戊二胺可用于 調(diào)控植物衰老過程、促進(jìn)雌雄蕊的發(fā)育，改善植物果實發(fā)育，提高果實產(chǎn)量;醫(yī)學(xué)上，亦可W 作為一種有效治療頻疾的藥物成份;工業(yè)上是一種極為重要的化工原料，與己二酸、班巧酸 和癸二酸等二元酸聚合可分別形成新型材料聚酷胺5.6、聚酷胺5.4和聚酷胺5.10。
[0004] 隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，大氣污染和全球變暖的趨勢日益惡化。世界上每年消耗大量 石化資源來源的聚酷胺，戊二胺作為聚酷胺的重要組成單體，生物法合成戊二胺具有經(jīng)濟(jì) 學(xué)和生態(tài)學(xué)雙重意義，生物法合成戊二胺的基因工程菌主要有谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿 菌。目前生物法合成1,5-戊二胺主要有兩種方式:發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化法。發(fā)酵法原料來源廣 泛且可再生，成本低，產(chǎn)量也較高，污染也較小，但其調(diào)控過程比較復(fù)雜；生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)量 高，成本低，過程簡單，有利于下游提取操作。但其要實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，需要獲得大量菌體， 運就需要有合適的培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)。而微生物聯(lián)合培養(yǎng)則是聯(lián)合培養(yǎng)一株一葡萄糖 為唯一碳源的高產(chǎn)下二酸大腸桿菌和一株W甘油為唯一碳源產(chǎn)高活性賴氨酸脫簇酶的大 腸桿菌，將發(fā)酵和轉(zhuǎn)化有機結(jié)合在一起來進(jìn)行，該方法不僅節(jié)約發(fā)酵成本，而且省略了收集 菌體運一步驟。并且該方法可W直接得到下二酸戊二胺鹽，可用于聚酷胺5.4合成。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1,5-戊二 胺的方法，簡化生產(chǎn)方法，降低生產(chǎn)成本。
[0007] -種微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1,5-戊二胺的方法，包括W下步驟： 步驟1，配種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖補料培養(yǎng)液、甘油補料培養(yǎng)液、乳糖誘導(dǎo)液 W及轉(zhuǎn)化用賴氨酸溶液； 步驟2，對發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基，葡萄糖補料培養(yǎng)液，甘油補料培養(yǎng)液，乳糖 誘導(dǎo)液，賴氨酸溶液W及Ξ角瓶進(jìn)行滅菌處理，其中發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖單獨滅菌后再 于其他成分合并； 步驟3,取兩個滅菌后的Ξ角燒瓶，接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，分別接入產(chǎn)下二酸菌和 產(chǎn)賴氨酸脫簇酶菌搖床培養(yǎng)后作為發(fā)酵菌種； 步驟4，將滅過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，通入無菌空氣或純化，再按照接種量總 體積比為10%向發(fā)酵罐中接入發(fā)酵菌種，向發(fā)酵罐中加入葡萄糖補料培養(yǎng)液、甘油補料培養(yǎng) 液和乳糖誘導(dǎo)液，發(fā)酵過程中控制菌體比生長速率，溫度，抑和溶氧； 步驟5，當(dāng)菌體干重達(dá)到15-20g/L，停止通無菌空氣或純化，轉(zhuǎn)入?yún)捬蹀D(zhuǎn)化過程，在此過 程中添加葡萄糖補料培養(yǎng)液控制葡萄糖濃度在l-4g/L之間，用賴氨酸溶液來控制pH在6.5- 7.5之間，發(fā)酵24小時得產(chǎn)物1,5-戊二胺。
[0008] 作為優(yōu)選的是，步驟1中發(fā)酵培養(yǎng)基的中葡萄糖與甘油的總含碳濃度為25-50g/ L。
[0009] 作為優(yōu)選的是，發(fā)酵菌種中產(chǎn)下二酸菌與產(chǎn)賴氨酸脫簇酶菌的接種體積比為15: (1-3)。
[0010] 作為優(yōu)選的是，步驟4中通入無菌空氣或純化的量為0.03-0.0化/(min . L)，葡萄 糖補料培養(yǎng)液和甘油補料培養(yǎng)液補加按照設(shè)定比生長速率在0.04-0.0化之間進(jìn)行指數(shù)流 加，乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)液流加速率為20-50mL/h。
[0011] 作為優(yōu)選的是，步驟4中，溫度控制在32-37°C，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在25%- 35〇/〇。
[0012] 作為優(yōu)選的是，步驟4中pH通過體積比為50%的氨水來調(diào)節(jié)。
[0013] 作為優(yōu)選的是，步驟5中控制葡萄糖濃度在l-4g/L。
[0014] 有益效果 本發(fā)明方法使得1，5-戊二胺的生產(chǎn)方法變得更加簡單，與全細(xì)胞轉(zhuǎn)化相比不僅省去了 收集菌體的步驟，而且有效的省去了轉(zhuǎn)化過程中酸的添加。轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的二氧化碳也 得到了充分的利用，運從很大程度上節(jié)約了生產(chǎn)成本。
[0015]
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明微生物聯(lián)合培養(yǎng)產(chǎn)物MS分析結(jié)果，其中峰1為單丹酷尸胺； 圖2為微生物聯(lián)合培養(yǎng)產(chǎn)物MS分析結(jié)果，其中峰2為雙丹酷尸胺。
[0017]
【具體實施方式】 [001引實施例1 一種微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法，包括W下步驟： 步驟1，配種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖補料培養(yǎng)液、甘油補料培養(yǎng)液、乳糖誘導(dǎo)液、 賴氨酸溶液，配方如下： 種子培養(yǎng)基：蛋白腺1%，酵母粉0.5%，NaCl 0.8%，氨節(jié)青霉素0.01%，氯霉素0.01%， 抑 7.0。
[0019]發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):3.0 g citric acid, 3.0 g 化出P04.7也0，8.00 g K也P〇4， 0.20 邑 NH4CI，0.75 邑（NH4)2S04，0.84 邑 Na肥〇3, l.OOgMgSCk. 7也0，10.0 mg CaCl2.2也0,0.28mg FeS〇4.7也0,20mg/L硫胺素（過濾除菌），2mg/L生 物素(過濾除菌），微量元素混合液0.1%，30g/L葡萄糖(分消），2g/L甘油(分消），氨節(jié)青霉 素0.01%，氯霉素0.01%。
[0020] 微量元素混合液(M):(NH4)6M〇7〇24 3xl〇-9 M，出B03 4xl〇-7 M，CoCl2.6出0 3xl〇-s M， CuS〇4.5出0 1x10-8M，MnCl2.4出0 8x10-8 M，ZnS04.7出0 1x10-8 Μ。
[0021] 葡萄糖補料培養(yǎng)液:600g/L葡萄糖溶液，滅菌條件為115 °C，10 min。
[0022] 甘油補料培養(yǎng)液:230g/L甘油溶液。滅菌條件為115 °C，10 min。
[0023] 乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)液:120g/L乳糖溶液。滅菌條件為115 °C，10 min。
[0024] 賴氨酸溶液:400g/L賴氨酸溶液。
[0025] 步驟2，對發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基，葡萄糖補料培養(yǎng)基，甘油補料培養(yǎng)基， 乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，賴氨酸溶液W及500mlS角瓶在12rC下滅菌15min備用，其中發(fā)酵培養(yǎng)基 中的葡萄糖單獨滅菌后再于其他成分合并； 步驟3,取滅菌后的Ξ角燒瓶，接入50ml種子培養(yǎng)基，分別接入產(chǎn)下二酸菌與產(chǎn)賴氨酸 脫簇酶菌株，搖床37 °C轉(zhuǎn)速為20化pm下培養(yǎng)8小時； 步驟4,將發(fā)酵培養(yǎng)基接入滅過菌的發(fā)酵罐中，通入無菌空氣，通氣量為0.07L/(min· L)，再按照接種量與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10%向發(fā)酵罐中接入發(fā)酵菌種，其中產(chǎn)下二酸菌 與產(chǎn)賴氨酸脫簇酶菌株比例為15:1，使菌體生長并消耗發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基 中的初始碳源消耗完后按照發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖與甘油比例補加葡萄糖補料培養(yǎng)液和甘 油補料培養(yǎng)液，過程中控制菌體比生長速率為〇.〇71Γ?，同時W30ml/h的速率添加乳糖誘導(dǎo) 培養(yǎng)液； 步驟5，待菌體干重達(dá)到15g/L時停止通入空氣，在此之前發(fā)酵過程抑控制為6.8，溫度 為37 Γ。停止通空氣后，改通C〇2,同時停止流加甘油補料培養(yǎng)液和乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)流 加葡萄糖補料培養(yǎng)液，在運個過程中控制糖濃度在l-2g/L之間，并用賴氨酸溶液代替氨水 來控制pH為6.8，溫度控制為37°C，24小時后測定戊二胺產(chǎn)量。
[00%] 1,5-戊二胺含量用丹橫酷氯衍生化后，冊LC-MS分析。衍生步驟如下：移取100 ul 離屯、后的轉(zhuǎn)化液到5 ml離屯、管中，依次加入2 Μ化0田容液200 μ1，飽和NaHC03溶液300 μ1 ，1〇 g/1的1,7-二氨基庚燒溶液（內(nèi)標(biāo)）100 μ1及10 g/1的丹橫酷氯溶液1 ml?；靹蚝笾糜?40 °C水浴中避光反應(yīng)45 min,而后加入25%的氨水100山，混勻后室溫避光靜置30 min。反 應(yīng)結(jié)束后，用乙臘定容至5 ml。
[0027] HPLC-MS分析使用電噴霧離子質(zhì)譜，色譜柱為Prevail C18反向柱(250 mm X 4.6 mm X 5皿）dHPLC條件為:流動相A:100%乙臘，流動相B:0.1 Μ乙酸錠溶液，采用梯度洗 脫，條件如下:初始:50% A; 19 min:90% A; 20-30 min:50% A;流速：1.0 ml/min;柱溫:40± 1 進(jìn)樣量:10 μ1。檢測使用紫外檢測器，檢測波長254 nm。
[0028] 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS分析（如圖1、圖2所示），峰1分子量為335(336-1=335)，峰2分 子量為568巧69-1=568)，分別于單丹酷尸胺和雙丹酷尸胺的分子量吻合。
[0029] 實施例2 步驟1至步驟3同實施例1。
[0030] 步驟4,將發(fā)酵培養(yǎng)基接入滅過菌的發(fā)酵罐中，并加入按15:1配比的葡萄糖和甘油 溶液通入無菌空氣，通氣量為0.〇7L/(min · L)，再按照接種量與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10% 向發(fā)酵罐中接入發(fā)酵菌種，其中產(chǎn)下二酸菌與產(chǎn)賴氨酸脫簇酶菌株比例為15:1，使菌體生 長并消耗發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基中的初始碳源消耗完后按照發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄 糖與甘油比例補加葡萄糖補料培養(yǎng)液和甘油補料培養(yǎng)液，過程中控制菌體比生長速率為 0.071Γ?，同時W30ml A的速率添加乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)液； 步驟5，待菌體干重達(dá)到15g/L時停止通入空氣，在此之前發(fā)酵過程抑控制為6.8，溫度 為37°C。停止通氣后，此步驟不通入C〇2,下二酸生產(chǎn)所需固定的C〇2由賴氨酸脫簇提供，同時 停止流加甘油補料培養(yǎng)液和乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)流加葡萄糖補料培養(yǎng)液，在運個過程中 控制糖濃度在l-2g/L之間，并用賴氨酸溶液代替氨水來控制抑為6.8，溫度控制為37°(：。24 小時后測定戊二胺產(chǎn)量。測量方法同實施例1。
[0031] 實施例3 步驟1-步驟3同實施例1，其中發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為25g/L，甘油濃度為5g/L。
[0032] 步驟4,將發(fā)酵培養(yǎng)基接入滅過菌的發(fā)酵罐中，并加入按5:1配比的葡萄糖和甘油 溶液通入無菌空氣，通氣量為0.〇7L/(min · L)，再按照接種量與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10% 向發(fā)酵罐中接入發(fā)酵菌種，其中產(chǎn)下二酸菌與產(chǎn)賴氨酸脫簇酶菌株比例為5:1，使菌體生長 并消耗發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基中的初始碳源消耗完后按照發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖 與甘油比例補加葡萄糖補料培養(yǎng)液和甘油補料培養(yǎng)液，過程中控制菌體比生長速率為 0.071Γ?，同時W25ml A的速率添加乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)液； 步驟5，待菌體干重達(dá)到20g/L時停止通入空氣，在此之前發(fā)酵過程抑控制為6.8，溫度 為37 Γ。停止通空氣后，改通C〇2,同時停止流加甘油補料培養(yǎng)液和乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)流 加葡萄糖補料培養(yǎng)液，在運個過程中控制糖濃度在l-2g/L之間，并用賴氨酸溶液代替氨水 來控制pH為6.8，溫度控制為37°C。24小時后測定戊二胺產(chǎn)量。測量方法同實施例1。
[0033] 對比例 W上述產(chǎn)賴氨酸脫簇酶菌株進(jìn)行發(fā)酵，并在后期投入底物賴氨酸用下二酸進(jìn)行pH調(diào) 控，其他反應(yīng)條件同實施例1，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中戊二胺最高濃度達(dá)到50.62g/L。
[0034] 本發(fā)明方法產(chǎn)1，5-戊二胺的產(chǎn)量記錄于下表中。
[0035] 從上述數(shù)據(jù)可W看出，本發(fā)明產(chǎn)1,5-戊二胺量大，制備過程簡單，適合產(chǎn)業(yè)化。
【主權(quán)項】
1. 一種微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1，配種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖補料培養(yǎng)液、甘油補料培養(yǎng)液、乳糖誘導(dǎo)液 以及賴氨酸溶液； 步驟2，對發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基，葡萄糖補料培養(yǎng)液，甘油補料培養(yǎng)液，乳糖 誘導(dǎo)液，賴氨酸溶液以及三角瓶進(jìn)行滅菌處理，其中發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖單獨滅菌后再 于其他成分合并； 步驟3，取兩個滅菌后的三角燒瓶，接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，分別接入產(chǎn)丁二酸菌和 產(chǎn)賴氨酸脫羧酶菌搖床培養(yǎng)后作為發(fā)酵菌種； 步驟4,將滅過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，通入無菌空氣或純02,再按照接種量總體 積比為10%向發(fā)酵罐中接入發(fā)酵菌種，向發(fā)酵罐中加入葡萄糖補料培養(yǎng)液、甘油補料培養(yǎng)液 和乳糖誘導(dǎo)液，發(fā)酵過程中控制菌體比生長速率，溫度，pH和溶氧； 步驟5，當(dāng)菌體干重達(dá)到15-20g/L，停止通無菌空氣或純〇2，轉(zhuǎn)入?yún)捬蹀D(zhuǎn)化過程，在此過 程中添加葡萄糖補料培養(yǎng)液控制葡萄糖濃度，用賴氨酸溶液來控制pH，發(fā)酵24小時得產(chǎn)物 1，5-戊二胺。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法，其特征在于：步驟1中 發(fā)酵培養(yǎng)基的中葡萄糖與甘油的總含碳濃度為25-50g/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法，其特征在于:步驟4中， 發(fā)酵菌種中產(chǎn)丁二酸菌與產(chǎn)賴氨酸脫羧酶菌的接種體積比為15: (1-3)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法，其特征在于:步驟4中， 通入無菌空氣或純〇2的量為0.03-0.08lV(min · L)，葡萄糖補料培養(yǎng)液和甘油補料培養(yǎng)液 補加按照設(shè)定比生長速率在〇. 04-0.081Γ1之間進(jìn)行指數(shù)流加，乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)液流加速率為 20-50mL/h〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法，其特征在于:步驟4中， 溫度控制在32-37°(：4田空制在6.5-7.5，溶氧控制在25%-35%。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法，其特征在于：步驟4中 發(fā)酵過程中pH通過體積比為50%的氨水來調(diào)節(jié)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述微生物聯(lián)合培養(yǎng)生產(chǎn)1，5-戊二胺的方法，其特征在于：步驟5中 控制葡萄糖濃度在l_4g/L。
【文檔編號】C12P39/00GK106011216SQ201610609543
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月28日
【發(fā)明人】陳可泉, 齊雁斌, 馬偉超, 曹偉佳, 曹遜, 歐陽平凱
【申請人】南京工業(yè)大學(xué)