一種在輔酶q10生產(chǎn)菌株sz中降低或消除副產(chǎn)物d的方法、輔酶q10高產(chǎn)菌株及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種在輔酶Q10生產(chǎn)菌株SZ中降低或消除副產(chǎn)物D的方法，所述方法為在輔酶Q10生產(chǎn)菌株SZ中表達編碼5?脫甲氧基泛醇羥化酶的基因，從而降低或消除所述副產(chǎn)物D的積累，所述生產(chǎn)菌株SZ的分類命名為類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年3月4日，保藏編號為CGMCC NO. 12177。本發(fā)明還公開了一種輔酶Q10高產(chǎn)菌株SF及其應用，所述高產(chǎn)菌株SF的分類命名為類球紅細菌，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年3月4日，保藏編號為CGMCC NO. 12178。該高產(chǎn)菌株SF是在生產(chǎn)菌株SZ中表達編碼5?脫甲氧基泛醇羥化酶的基因而得，應用該高產(chǎn)菌株SF生產(chǎn)輔酶Q10產(chǎn)量達2g/L以上，具有廣闊的應用前景。CGMCC NO. 1217720160304CGMCC NO. 1217820160304
【專利說明】
-種在輔酶Qio生產(chǎn)菌株SZ中降低或消除副產(chǎn)物叫勺方法、輔酶 Qio高產(chǎn)菌株及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及現(xiàn)代生物學技術領域，具體地設及一種在輔酶化0生產(chǎn)菌株SZ中降低或 消除副產(chǎn)物D的方法、輔酶Qio高產(chǎn)菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 輔酶化o(Coen巧me化〇，C〇化0)，化學名稱為：2,3-二甲氧基-5-甲基6-癸異戊締基 苯釀，分子式為Cs訊90化，相對分子量為863，烙點為48-50°C，在室溫下呈澄黃色結晶物，無臭 無味。易溶于氯仿、苯、四氯化碳，溶于丙酬、石油酸及乙酸，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇。 在光照下易分解成微紅色，對溫度和濕度較穩(wěn)定。
[0003] 輔酶化0是一種脂溶性釀類化臺物，最早于1957年被發(fā)現(xiàn)，由于在人體器官中的存 在W及在生理等方面的重要功能，是人體細胞呼吸鏈的組成部分，參與細胞的能量代謝。同 時它也是一種重要的抗氧化劑，保護線粒體膜蛋白W及DNA免受自由基的氧化損傷。長久W 來它被用作營養(yǎng)保健品。同時它被認為可W用來治療帕克森氏病和屯、血管疾病 (Xieberman)A et 曰1(2005)11:8)。
[0004] 目前輔酶化0的生產(chǎn)方法主要有3種:動植物組織提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵 法。=種方法各有優(yōu)缺點，動植物組織提取法由于原料供應周期與來源受產(chǎn)地等問題而制 約了輔酶化0的規(guī)?；a(chǎn)。目前研究較多的化學合成法是半合成法，但該方法生產(chǎn)程序復 雜且產(chǎn)物為順反異構體，不利于人體吸收。發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶化G生長周期短生物活性高，是近 幾年研究的熱點。
[0005] 目前，較成功的大規(guī)模輔酶化0生產(chǎn)都是通過發(fā)酵法實現(xiàn)的。在中國，輔酶化0的工 業(yè)生產(chǎn)是經(jīng)過類球紅細菌發(fā)酵、提取和純化得到的，所用的類球紅細菌是經(jīng)過長期的化學 誘變等傳統(tǒng)育種方法獲得的。在工業(yè)生產(chǎn)中，現(xiàn)有的類球紅細菌菌種在產(chǎn)生大量的輔酶化0 的同時，還產(chǎn)生一定量（占3%左右）的副產(chǎn)物D，而商品化的輔酶化0產(chǎn)品的純度要求在99% W上，因此副產(chǎn)物D必須從最終的輔酶化0產(chǎn)品中除去。然而，在輔酶化0的提取和純化過程 中，因為輔酶Qio和副產(chǎn)物D的物理性質(zhì)很相似，將副產(chǎn)物D和輔酶化0分離開來很難。需要較 高的生產(chǎn)成本來制備純度在99% W上輔酶化0產(chǎn)品。
[0006] 其中，輔酶化0的結構式
[0007]副產(chǎn)物D的結構式關
O
[000引現(xiàn)代生物學技術，如合成生物學，基因工程，蛋白質(zhì)工程，代謝工程等等已被應用 于育種工作來改良微生物來滿足人類的需求，例如（1)提高微生物發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量化eja， K，et al BioTechnologia 92(2011)345-351),(2)除去發(fā)酵產(chǎn)品中的雜質(zhì)，如多拉克下生 產(chǎn)菌中去除副產(chǎn)品CHC-B2(Stuuzman-Engwall et al Metabolic engineering 7(2005) 27-37)，（3)開發(fā)合成新的產(chǎn)品，如在重組的大腸桿菌中生產(chǎn)脂肪醇化S8999686)和生物燃 油化P2157170)等等。
[0009] 對目標微生物菌株建立一套DNA轉(zhuǎn)化技術是對該微生物菌實施現(xiàn)代生物學育種該 微生物的先決條件。在對經(jīng)過傳統(tǒng)育種得來的、用于工業(yè)發(fā)酵的微生物進行現(xiàn)代生物學育 種時，常常遇到的問題之一就是常規(guī)的、針對野生型菌種的DNA轉(zhuǎn)化技術對那些傳統(tǒng)育種 (如化學、福射誘變)獲得的高產(chǎn)菌種沒有效應，因而不能對相應的微生物實施基因工程操 作，例如基因表達、基因鑄除等等。產(chǎn)輔酶化0的類球紅細菌野生型菌株一般可W通過接合和 電擊的方法來進行DNA轉(zhuǎn)化(Piekarski,T.et al BMC Mic;robiology(2009)9:265)，然而在 實踐中從大腸桿菌中提取的DNA用上述兩種方法輔酶化0生產(chǎn)菌株不能獲得任何轉(zhuǎn)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種在輔酶化0生產(chǎn)菌株 SZ中降低或消除副產(chǎn)物D的方法。
[00川為解決W上技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0015] 所述方法為在輔酶化0生廣菌林SZ甲巧店編媽b-脫甲m巷按醉巧化踞的巷因，從而 降低或消除所述副產(chǎn)物D的積累，所述生產(chǎn)菌株SZ的分類命名為類球紅細菌Rhodobacter
[0012] 一種在輔酶化0生產(chǎn)菌株SZ中隆化或消除副I產(chǎn)物D的方巧，丑:中，
[OOK] 所述輔酶Qio的結構式文
[0014] 所述副產(chǎn)物D的結構式； sphaeroides，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏單位地址為 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2016年3月4日，保藏編號為CGMCC NO.12177。
[0016] 進一步地，所述5-脫甲氧基泛醇徑化酶的基因來自大腸桿菌或類球紅細菌。
[0017] 更進一步地，所述5-脫甲氧基泛醇徑化酶的基因經(jīng)過蛋白酶工程改造，含有一個 氨基酸W上的突變。
[0018] 本發(fā)明同時還提供一種輔酶化0高產(chǎn)菌株SF及應用該高產(chǎn)菌株SF生產(chǎn)輔酶化0的方 法。
[0019] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0020] 一種輔酶化日高產(chǎn)菌株SF，所述高產(chǎn)菌株SF的分類命名為類球紅細菌化Odobacter sphaeroides，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏單位地址為 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2016年3月4日，保藏編號為CGMCC NO.12178。
[0021] 本發(fā)明采用的另一技術方案是:一種如上述輔酶化0高產(chǎn)菌株SF的制備方法，所述 制備方法為在所述輔酶化0生產(chǎn)菌株SZ中表達編碼5-脫甲氧基泛醇徑化酶的基因，獲得所述 輔酶化0高產(chǎn)菌株SF。
[0022] 本發(fā)明采用的另一技術方案是:如上述高產(chǎn)菌株SF用于生產(chǎn)輔酶化0的應用。
[0023] 本發(fā)明采用的又一技術方案是:一種輔酶化0的生產(chǎn)方法，所述方法為通過發(fā)酵如 上述高產(chǎn)菌株SF獲得輔酶化0。
[0024] 進一步地，所述方法為:所述高產(chǎn)菌株SF在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，W1~20 %的接種 量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，在28~35 °C下，發(fā)酵培養(yǎng)90h后得到含有輔酶化0的發(fā)酵液。
[0025] 為了進一步提高輔酶化0的產(chǎn)率，對發(fā)酵過程進行優(yōu)化，發(fā)酵24h后，添加0.1~ Immo 1 /L的誘導劑IPTG。優(yōu)選地，誘導劑IPTG的濃度為0.1 -0.5mmo 1 /L。
[00%]更進一步地，所述種子培養(yǎng)基為酵母粉1.0-10.0 g/L，憐酸氨二鐘0.1-2.5g/L，憐 酸二氨鐘0.1-2.5g/L，硫酸儀1.0-5 . Og/L，硫酸亞鐵0.1-lg/L，氯化鋼0-5 . Og/L，硫酸錠 1.5- 3.5g/L，谷氨酸鋼0.5-3 . Og/L，玉米漿干粉0.5-3 . Og/L，葡萄糖5-20g/L，調(diào)節(jié)pH至 6.50- 7.30O
[0027] 更進一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米漿干粉1.0-15g/L，谷氨酸鋼1.0-15g/L，硫酸 錠1.0-15g/L，氯化鋼1-lOg/L，憐酸二氨鐘0.5-6. Og/L，硫酸儀5-60g/L，碳酸巧0-5g/L，葡 萄糖0-40g/L，屯水硫酸亞鐵0-5g/L，氯化巧0-1 .Og/L，硫酸儘0-1 .Og/L，調(diào)節(jié)pH至7.10- 7.20。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一個【具體實施方式】，所述方法為:所述高產(chǎn)菌株SF在種子培養(yǎng)基培 養(yǎng)后，W1~20 %的接種量接種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，在28~35 °C下，發(fā)酵培養(yǎng)96h后得到含有輔 酶化0的發(fā)酵液。
[00巧]進一步地，所述種子培養(yǎng)基為酵母粉1.0-10.Og/L，憐酸氨二鐘0.1-2.5g/L，憐酸 二氨鐘0.1-2.5g/L，硫酸儀1.0-5 . Og/L，硫酸亞鐵0.1-1 g/L，氯化鋼1.5-5 . Og/L，硫酸錠 1.5- 3.5g/L，谷氨酸鋼0.5-3 . Og/L，玉米漿干粉0.5-3 . Og/L，葡萄糖5-20g/L，調(diào)節(jié)pH至 6.50- 7.30O
[0030]進一步地，所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米漿干粉1.0-6. Og/L，谷氨酸鋼1.0-6. Og/L， 硫酸錠1.0-6 . Og/L，氯化鋼1-3.5g/L，憐酸二氨鐘0.5-3. Og/L，硫酸儀5-lOg/L，碳酸巧1- 5g/L，葡萄糖20-40g/L，調(diào)節(jié)抑至7.10-7.20。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的另一個【具體實施方式】，所述方法為:所述高產(chǎn)菌株SF在種子培養(yǎng)基 培養(yǎng)后，W1~20 %的接種量接種種子培養(yǎng)基，再W1~20 %的接種量接種化罐發(fā)酵培養(yǎng)基， 在28~35°C下，發(fā)酵培養(yǎng)90h后得到含有輔酶化0的發(fā)酵液。
[0032] 進一步地，所述種子培養(yǎng)基為酵母粉1.0-10.Og/L，憐酸氨二鐘0.1-2.5g/L，憐酸 二氨鐘0.1-2.5g/L，硫酸儀1.0-5. Og/L，硫酸亞鐵0.1-lg/L，硫酸錠1.5-3.5g/L，谷氨酸鋼 0.5-3. Og/L，玉米漿干粉 0.5-3. Og/L，葡萄糖 5-20g/L，調(diào)節(jié)抑至6.50-7.30。
[0033] 進一步地，所述化罐發(fā)酵培養(yǎng)基基礎料為：玉米漿干粉2-15g/L，谷氨酸鋼2-15g/ L，硫酸錠2-15g/L，氯化鋼1-lOg/L，憐酸二氨鐘1.0-6. Og/L，屯水硫酸亞鐵l-5g/L，屯水硫 酸儀20-60g/L，氯化巧0.1-1. Og/L，硫酸儘0.1-1. Og/L，調(diào)節(jié)pH至7.10-7.20;控制攬拌轉(zhuǎn)速 100-1000巧m，溫度28~35°C，空氣控制3.化-6. OL/min。
[0034] 由于上述技術方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點：
[0035] 本發(fā)明采用在輔酶化0生產(chǎn)菌株SZ中表達編碼5-脫甲氧基泛醇徑化酶的基因，副產(chǎn) 物D得到了顯著地降低，同時生產(chǎn)輔酶Qio的能力增強。
[0036] 本發(fā)明提供的高產(chǎn)菌株SF，其副產(chǎn)物低、產(chǎn)量高且遺傳性狀穩(wěn)定。使用該高產(chǎn)菌株 SF發(fā)酵生產(chǎn)輔酶化0，輔酶化0的產(chǎn)量達到2g/L W上，具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0037] 圖巧輔酶化日和副產(chǎn)物D的HPLC圖譜；
[0038] 圖2為菌株SF和對照菌株SZ在5升發(fā)酵罐中產(chǎn)輔酶化0的效價對比；
[0039] 圖3為菌株SF和對照菌株SZ在5升發(fā)酵罐中副產(chǎn)物D的百分比對比。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0041 ] 實施例1
[0042] 表達質(zhì)粒的構建
[0043] (a) W本實驗室保藏P化 1920_pT:rc(www. synthesisgene. com)及pMG160(Inui ,M, et al AEM 69(2003)725-733)為模板，構建化odobacter S地aeroides表達載體地M03;
[0044] (b) WE.coli W3110為模板，引物加 iF-F和加 iF-R擴增加 iF(Genbank:NC_ 000913.3)片段；W輔酶QlO生產(chǎn)菌株-類球紅細菌SZ的基因組為模板，用引物化iHl-F和 UbiHl-R擴增獲得化1化（66扣曰證:肥_007493，1?39_1492)、用引物化1肥斗和化1肥-巧廣增獲 得化1肥(66油曰證:肥_007493，1?3口_1869)，相應的引物系列如序列表中沈9 10^:1所示；
[0045] (C)構建的表達質(zhì)粒分別為地 M03-UbiF、pBM03-UbiHl、pBM03-Ubi 肥。
[0046] 步驟(a)、（C)均采用EZ fusion方法(Generay GR6086)獲得，類球紅細菌SZ已保藏 在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號，保藏日期為2016年3月4日，保藏編號為CGMCC NO.12177。
[0047] 實施例2
[004引 菌株fstA(I?hodobacter sphaeroides 2.4.1 A rshl)的構建
[0049] (a) W本實驗室保藏pKlSmobSacB為載體，W輔酶Rhodobacter sphaeroides 2.4.1基因組為模板，引物為rshI-5 '-F/R、rshI-3 '-F/R，構建質(zhì)粒地 18mobSacB_rshI;
[00加](b)將地18mobSacB_rshI轉(zhuǎn)化本實驗室保藏E.coli S17-1宿主，獲得E.coli S17- l/pK18mobSacB_rshI；
[0051] (C)將地 18mobSacB_rshI通過接合轉(zhuǎn)移實驗從E.coli S17-1/地 18mobSacB_rshI 轉(zhuǎn)移到類球紅細菌，F(xiàn)st菌中，通過糞晚酬酸+抗性標記篩選，獲得單交換菌株Fst_rshl的接 合子。詳細的接合轉(zhuǎn)移方法見化Ker S^et al Methods Enzymol 423:392-413(2007).
[0052] (d)20%薦糖篩選得到無抗性的雙交換菌株-類球紅細菌FstA。經(jīng)過利用rshI- 5'-F/rshI-3'R引物擴增FstA的基因組得到了預期擴增片段a084bp)，說明rshI敲除成 功。
[0化3] 步驟（C)中Fst為野生型的類球紅細菌I^iodobacter sphaeroides 2.4.1。
[0054] 實施例3
[0化日]Fst A及SZ感受態(tài)的制備
[0056] (a)從保有FstA菌、班菌甘油管中分離取20ul，在LB平板劃線，34°C避光培養(yǎng)過 夜；
[0化7] (b)挑取單菌至4ml LB的試管，34。(：避光活化過夜，至菌體0D《1.0;
[0化引（C)轉(zhuǎn)移（b)中的4ml菌液，接種到含100mL LB培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，34。(：， 220巧m，避光培養(yǎng)4-化；
[0化9] (d)但上述培養(yǎng)液的OD達到0.6，用6000巧m離屯、3min收菌體；
[0060] (e)隨后用無菌水洗涂菌體3次，600化pm離屯、，3min;
[0061] (f)加入0.5-lml的E2制備液到制備的菌體中懸浮菌體，將每SOul菌體分裝到 eppen化of管中，置-80°C備用。
[0062] 步驟(a)中類球紅細菌SZ為輔酶QlO生產(chǎn)菌株，（f)中E2制備液成分為:0.5mol/L山 梨醇，0.5mol/L甘露醇，20g/L甘油。
[0063] 實施例4
[0064] 工程菌SF、SHUS肥的構建
[00化](a)先將pBM03-UbiF、pBM03-UbiHl、pBM03-Ubi肥電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)FstA,涂布抗性 平板，分別獲得工程菌:FstA/pBM03-UbiF、FstA/pBM03-UbiHl、FstA/pBM03-Ubi 肥；
[0066] (b)從（a)得到的 FstA/pBM03-UbiF，F(xiàn)stA/pBM03-UbiHl、FstA/pBM03-UbiH2 提 質(zhì)粒，分別電擊轉(zhuǎn)化SZ感受態(tài)，涂布硫酸卡那霉素抗性平板，獲得基因工程菌52/98103- UbiF、SZ/pBM03-UbiHl、SZ/pBM03-Ubi肥，命名為SF、SHl、S肥，其中，菌株SF已保藏在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，保藏日期為2016年3月4日，保藏編號為CGMCC NO.12178。
[0067] 步驟(a)、（b)中抗性平板配方為:5g/L酵母粉，0.5g/L憐酸氨二鐘，0.5g/L憐酸二 氨鐘，1.5g/L屯水硫酸儀，0.1 g/L屯水硫酸亞鐵，2.5g/L氯化鋼，2.5g/L硫酸錠，Ig/L谷氨酸 鋼，2.5g/L玉米漿干粉，lOg/L葡萄糖，17g/L瓊脂粉，調(diào)節(jié)抑至7.16。添加硫酸卡那霉素至終 濃度 25ng/ml。
[006引 電擊條件：1.8-3kV，5ms。
[0069] 實施例5
[0070] HPLC測定類球紅細菌發(fā)酵液中的輔酶化0和相關的副產(chǎn)物D的方法
[0071 ] 檢測樣品制備:堿皂化法提取，具體工藝為：IOml菌懸液在eOOOrpm下離屯、IOmin， 蒸饋水洗涂2次，在濕菌體中加入ImL丙酬，冰浴條件下超聲波破碎(功率400W，工作4s，休 息5s，工作60次)并移入圓底燒瓶中，加入pH3.0的酸性水2mL，攬拌均勻，90°C下回流化，緩 慢加入10%化OH 3mL混勻，90°C回流比，迅速冷卻，加入5血正己燒提取2次，合并萃取液，去 離子水洗至中性，W無水硫酸鋼脫水至澄清，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再用2mL無水乙醇溶解， 冊LC檢測。
[0072] 高效液相色譜法的參數(shù)：
[0073] 色譜條件:反相C18分析柱，流動相為無水乙醇：甲醇= 35:65(V/V)，紫外檢測器， 檢測波長275nm，流度1.2mL/min，進樣量10化，柱溫50°C。輔酶化0和副產(chǎn)物D的出峰時間分別 為6.163和5.785分鐘，輔酶化0和副產(chǎn)物D的HPLC圖譜如圖1所示。
[0074] 實施例6
[0075] 搖瓶發(fā)酵SZ、S化、S肥發(fā)酵生產(chǎn)輔酶QW比較
[0076] (1)種子培養(yǎng)：
[0077] 種子培養(yǎng)基：酵母粉5g/L，憐酸氨二鐘0.5g/L，憐酸二氨鐘0.5g/L，屯水硫酸儀 1.5g/L，屯水硫酸亞鐵0.1 g/L，氯化鋼2.5g/L，硫酸錠2.5g/L，谷氨酸鋼1 g/L，玉米漿干粉 2.5g/L，葡萄糖lOg/L調(diào)節(jié)抑至7.16。將平板活化的單菌挑至種子培養(yǎng)基，220rpm，34°C培養(yǎng) 2化。
[0078] (2)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子按2%的接種量轉(zhuǎn)接到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中后，置于搖床 中，34°C，220rpm，發(fā)酵12化。分別在發(fā)酵的72,96及12化取樣，將發(fā)酵液離屯、，抽提輔酶化0， 用HPLC測定發(fā)酵液中的輔酶化0產(chǎn)量。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:玉米漿干粉2.Og g/L，谷氨 酸鋼2.5g g/L，硫酸錠3.0g g/L，氯化鋼1.5g g/L，憐酸二氨鐘0.5g g/L，硫酸儀5g/L，碳酸 巧5g/L，葡萄糖20g/L，調(diào)節(jié)抑至7.10-7.20。
[0079] (3) S化、S肥及SF的輔酶化Q的濃度、副產(chǎn)物D的濃度、及對SZ副產(chǎn)物D的比例如表1所 示。發(fā)酵結果顯示在基因工程菌中，5-脫甲氧基泛醇徑化酶基因可W降低副產(chǎn)物D的積累。 表達來自大腸桿菌的Ub i F對降低副產(chǎn)物D的濃度最有效果。在發(fā)酵12化，過表達Ub i H1， Ubi肥和UbiF所產(chǎn)生的副產(chǎn)物D為出發(fā)菌株SZ的36% ,34%和22%。
[0080] 幸1屯巧Tl鐘[9巧鄰'齡T牽擊麻化。齡T冰賠宜Il祥物n齡!冰賠及對SZ副產(chǎn)物D的比例
[0081]
[0082]
[0083] 實施例7
[0084] 搖瓶發(fā)酵SF在不同時間誘導表達生產(chǎn)輔酶化0比較
[0085] 在發(fā)酵24h或4她添加終濃度0.2mmol/L的IPTG，SZ和SF為無誘導的對照菌株，結果 如表2所示，結果表明SF菌株在添加 IPTG、誘導表達UbiF的條件下比不誘導時的輔酶QlO產(chǎn) 量要高，而且在發(fā)酵2地添加 IPTG誘導比在4她是效果要好。在發(fā)酵的12化，對照菌SZ，沒添 加 IPTG誘導的SF，和在發(fā)酵24h，4她添加 IPTG誘導的SF的輔酶化0的產(chǎn)量分別為187.61mg/L， 100.84mg/L，216.20mg/L和148.53mg/L，副產(chǎn)物D的相應產(chǎn)量分別為12.66mg/L，1.77mg/L， 1.78mg/L和0.94mg/L。在發(fā)酵24h添加 IPTG誘導，基因工程菌SF和出發(fā)菌株SZ相比，不僅在 輔酶化0產(chǎn)量上提高了 15.2%，而且副產(chǎn)物D的產(chǎn)量降低了7.2倍。
[0086] 表2為SZ、SF和SF在IPTG不同時間誘導條件下輔酶化0的濃度、副產(chǎn)物D的濃度及對 SZ副產(chǎn)物D的比例比較
[0087]
[0088] 實施例8
[0089] 在化發(fā)酵罐利用基因工程菌株SF發(fā)酵生產(chǎn)輔酶QlO
[0090] 種子培養(yǎng)基培養(yǎng):從平板中選取數(shù)個
[0091] 接種量:500ml
[0092] 種子 ODsoo :7-8
[0093] 發(fā)酵罐:5L(上海保興）
[0094] 裝液量:3L
[0095] 溫度:：M°C
[0096] pH:用氨水調(diào)節(jié)抑為6.5
[0097] 溶氧:前期溶氧不進行控制，后期溶氧控制在0-10%之間
[0098] 轉(zhuǎn)速:300-100化pm，根據(jù)發(fā)酵過程中的溶氧指標進行控制
[0099] 通氣量:0-30h為 3.化/min; 30-90h為4. OL/min
[0100] 補全料:分別于24h、42h、55h補加全料
[0101] 補料:550g/L葡萄糖，接種前補加初糖82mL(約12g/L)，發(fā)酵IOh開始補糖，發(fā)酵過 程糖濃度控制在5-lOg/L
[0102] 補憐：10g/150mL K出P〇4發(fā)酵4h開始補憐，4化全部補完。
[0103] 誘導劑誘導:發(fā)酵2地添加 IPTG進行誘導。
[0104] 種子培養(yǎng)基:配方如表3所示
[0105] 表3為種子培養(yǎng)基的配方組成
[0106]
[0111] 結果如圖2和圖3所示，發(fā)酵過程中，SF產(chǎn)量始終高于對照菌株SZ，且主峰輔酶化0在 副產(chǎn)物D和輔酶化0中的占比亦是SF高于SZ，SF對副產(chǎn)物D消除效果明顯。
[0112] W上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領域技術的人±能夠了解本 發(fā)明的內(nèi)容并加 W實施，并不能W此限制本發(fā)明的保護范圍，且本發(fā)明不限于上述的實施 例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 一種在輔酶Qio生產(chǎn)菌株SZ中降低或消除副產(chǎn)物D的方法，其特征在于:所述方法為在輔酶Q1()生產(chǎn)菌株SZ中表達編碼5-脫甲氧基泛醇羥化酶的基 因，從而降低或消除所述副產(chǎn)物D的積累，所述生產(chǎn)菌株SZ的分類命名為類球紅細菌 (Rhodobacter sphaeroides)，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏日期為2016年3月4日，保藏編號為CGMCC NO.12177。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述5-脫甲氧基泛醇羥化酶的基因來自大 腸桿菌或類球紅細菌。3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:所述5-脫甲氧基泛醇羥化酶的基因經(jīng)過蛋 白酶工程改造，含有一個氨基酸以上的突變。4. 一種輔酶Q1Q高產(chǎn)菌株SF，所述高產(chǎn)菌株SF的分類命名為類球紅細菌，已保藏在中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年3月4日，保藏編號為CGMCC NO.12178。5. -種如權利要求4所述輔酶Q1Q高產(chǎn)菌株SF的制備方法，其特征在于:所述制備方法為 在所述輔酶Qn)生產(chǎn)菌株SZ中表達編碼5-脫甲氧基泛醇羥化酶的基因，獲得所述輔酶Q 10高 產(chǎn)菌株SF。6. 如權利要求4所述的高產(chǎn)菌株SF用于生產(chǎn)輔酶Q1Q的應用。7. -種輔酶Q1Q的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述方法為通過發(fā)酵如權利要求4所述高產(chǎn)菌 株SF獲得輔酶Q 10。8. 根據(jù)權利要求7所述的生產(chǎn)方法，其特征在于：所述高產(chǎn)菌株SF在種子培養(yǎng)基培養(yǎng) 后，以1~20 %的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，在28~35°C下，發(fā)酵培養(yǎng)90h后得到含有輔酶Q10的 發(fā)酵液。9. 根據(jù)權利要求8所述的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基為酵母粉1.0-10.0g/ L，磷酸氫二鉀0. l_2.5g/L，磷酸二氫鉀0. l-2.5g/L，硫酸鎂1.0-5.0g/L，硫酸亞鐵0.1-lg/ L，氯化鈉0-5.0g/L，硫酸銨1.5-3.5g/L，谷氨酸鈉0.5-3.0g/L，玉米衆(zhòng)干粉0.5-3.0g/L，葡 萄糖 5_20g/L，調(diào)節(jié) pH至 6 · 50-7 · 30。10. 根據(jù)權利要求8所述的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米漿干粉1. Οι 5g/L ， 谷氨酸鈉 1.0-15g/L ， 硫酸銨 1.0-15g/L ， 氯化鈉 l-10g/L ， 磷酸二氫鉀 0.5-6. 0g/L ， 硫 酸鎂5_60g/L，碳酸l^jO-Sg/L，葡萄糖0-40g/L，七水硫酸亞鐵〇-5g/L，氯化媽〇-1. Og/L，硫酸 錳 0-1 · Og/L，調(diào)節(jié) pH至7 · 10-7 · 20。
【文檔編號】C12N1/21GK105925519SQ201610296973
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】胡志浩, 王慶軍, 范俊英, 張瑞萍, 韓祎君, 王欣彤, 施明雨, 王緒州
【申請人】蘇州華賽生物工程技術有限公司, 神舟生物科技有限責任公司