專利名稱：耐氨性的l(+)－產(chǎn)乳酸菌及生產(chǎn)l(+)－乳酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及屬于根霉菌屬的、具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌及使用該菌種生產(chǎn)L(+)-乳酸的方法，更詳細的說是涉及用亞硝基胍使作為母株的根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)變異得到的具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌，也就是說，涉及根霉MK96-1156本身及用它們在有氧的條件下以氨氣作為中和劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，從而高收率地制備L(+)-乳酸的方法。
乳酸可以作為食品添加劑用于酒類、清涼飲料、咸菜、醬油、面包、啤酒等的制備中，此外，在皮革、纖維、塑料等工業(yè)中也被利用，是一種有用的化合物。
目前，用發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，一般是將屬于裂殖菌類的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)等被稱作乳酸菌類的菌在無氧的條件下培養(yǎng)，進行乳酸發(fā)酵。乳酸菌的培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基是以糖、淀粉等作為主原料，并向其中添加作為副原料的酵母提取物等營養(yǎng)源。利用這些乳酸桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)等菌進行的乳酸發(fā)酵具有過程簡單，且乳酸收率高的優(yōu)點，但是一般來說，因為酵母提取物等副原料的價格高，所以得到的L(+)-乳酸的價格也就高。另外，由于這些菌的大小均為1μm以下，與培養(yǎng)基的分離比較困難，培養(yǎng)處理的操作性差。
另一方面，也有使用根霉菌屬類的絲狀菌在含有碳酸鈣的培養(yǎng)液中通過有氧培養(yǎng)生產(chǎn)乳酸的方法。從糖得到乳酸的收率在70-80％，由于葡萄糖等單糖能夠作為碳源，而且培養(yǎng)基的成份除糖以外只要求少量的無機鹽，所以發(fā)酵后培養(yǎng)基中的雜質(zhì)比較少。例如，Kristofikova等(L.Kristofikova，M.Rosenberg，，A.Valnove，J.Sajbidor及M.Certik Folia Microbiol，36(5)，451-455(1991))以葡萄糖作為碳源，由無根根霉CCM8109(Rhizopusarrhizus CCM8109)生產(chǎn)79克/升乳酸。
另外，也有使用米根霉NRRL395(Rhizopus oryzae NRRL395)菌體生產(chǎn)乳酸的方法。例如，Yang等(C.W.Yang，，Zhongjing Lu及Geroge T.Tsaso；ApplidBiochemistry and Biotechology vol.51/52 p57-71，1995)描述的方法是在有氧的條件下，用添加了碳酸鈣的培養(yǎng)液培養(yǎng)該菌體，得到收率為78％的乳酸。
另外，上述根霉菌屬的菌體容易形成聚集體(粒狀沉淀)，由于能夠簡單的與培養(yǎng)基分離，所以容易從發(fā)酵后的培養(yǎng)基中分離純化乳酸和該粒狀沉淀。利用了這種粒狀沉淀的優(yōu)點的方法，有使用米根霉NRRL395(Rhizopus oryzaeNRRL395)，在以木糖作為碳源的培養(yǎng)液中使之形成菌體粒狀沉淀，用該粒狀沉淀由葡萄糖生產(chǎn)乳酸的方法。例如，Soccol等(C.R.Soccol，B.Marin，M..Raimbault；Appl Microbiol Biotechnol 41，286-290(1991))在有氧的條件下，在含有中和劑碳酸鈣的培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌體粒狀沉淀，得到收率約為75％的乳酸。采用這種方法，在含有碳酸鈣的培養(yǎng)液中培養(yǎng)該粒狀沉淀，通過每次消耗完作為碳源的葡萄糖后再在新的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，可以連續(xù)的生產(chǎn)乳酸。
這樣，在有氧的條件下培養(yǎng)根霉菌屬的菌株，以葡萄糖和淀粉為原料生產(chǎn)L(+)-乳酸時，與使用乳酸菌的場合相比，具有多種優(yōu)點。
但是，在有氧的條件下培養(yǎng)根霉菌，產(chǎn)生乳酸的收率一般比較低，而且發(fā)酵大多需要7-10天，生產(chǎn)乳酸的時間長。因此，與使用乳酸菌在無氧條件下的發(fā)酵比較，缺乏工業(yè)實用性。
另外，雖然上述Soccol等也報告了再次使用根霉菌的連續(xù)培養(yǎng)，但是使用該菌株時，3次以后乳酸的產(chǎn)量大大降低，為了防止這種事情的發(fā)生，就必須向培養(yǎng)液中添加尿素作為氮源。
另外，一般的采用產(chǎn)乳酸菌生產(chǎn)L(+)乳酸的方法中，為了抑制產(chǎn)生的L(+)-乳酸阻礙產(chǎn)物的產(chǎn)生，而且為了中和培養(yǎng)液的酸度，必須使用碳酸鈣及氫氧化鈉作為中和劑中和L(+)-乳酸。以高收率得到乳酸時，目前已知的用根霉菌屬進行乳酸發(fā)酵所使用的中和劑幾乎都是碳酸鈣，為了從生成的乳酸鈣中分離純化乳酸，除了使用添加硫酸分離硫酸鈣沉淀的方法以外沒有其它方法，由于生成大量副產(chǎn)物硫酸鈣，在工業(yè)上也是一個問題。某些時候使用氨氣作為中和劑得到乳酸銨時，由于氨氣阻礙了菌體的活性，所以很容易在收率及生產(chǎn)性方面出現(xiàn)不理想的情況。而且，上述Soccol等指出，不使用碳酸鈣等作為生成的酸的中和劑，而是用聚4-乙烯吡咯烷酮(PVP)樹脂吸附分離L(+)-乳酸，由于細胞收到損傷而存在產(chǎn)量降低的問題。
另外，可以由含有多糖的糖類在菌體內(nèi)各種酶的作用下產(chǎn)生乳酸，如果使用的菌株本身營養(yǎng)要求復雜，就必須在培養(yǎng)液中加入各種成份，這樣從培養(yǎng)液中分離產(chǎn)乳酸菌產(chǎn)生的乳酸就比較困難，不容易制備收率好、純度高的乳酸。另外，由于培養(yǎng)條件生成了副產(chǎn)物，為了乳酸純化階段的操作簡便，就必須選擇副產(chǎn)物生成少的培養(yǎng)條件。另一方面，為了高效率的使用菌體，優(yōu)選再次使用產(chǎn)乳酸菌，但是一般如果再次使用菌株則難以完全滿足其營養(yǎng)要求，生成乳酸能力低下的場合比較多。因此，必須選擇再次使用性強的菌株。
本發(fā)明鑒于上述課題，提供了一種使用亞硝基胍使根霉MK96(Rhizopussp.MK96)變異得到具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌。
另外，還提供一種根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)的菌株。
另外，還提供一種在有氧條件下培養(yǎng)上述菌株生產(chǎn)L(+)-乳酸的方法。
另外，還提供一種根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)。
本發(fā)明中，只要是屬于根霉菌屬、具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌，就可以使用。屬于根霉菌屬的、具有乳酸發(fā)酵能力的微生物，例如可以舉出無根根霉(Rhizopus arrhizus)、德列馬根霉(Rhizopus delemar)、爪哇根霉(Rhizopusjavanic)、變黑色根霉(Rhizopus nigricans)、米根霉(Rhizopus oryzae)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)等，其中優(yōu)選米根霉(Rhizopus oryzae)或無根根霉(Rhizopus arrhizus)，L(+)-乳酸生成的能力高。這是因為這些屬于根霉菌屬、具有乳酸發(fā)酵能力的菌類能夠呈顆粒狀、塊狀培養(yǎng)。
本發(fā)明中使用的L(+)-產(chǎn)乳酸菌，還必須具有耐氨性。作為這樣的菌株，有本發(fā)明者們采用下述方法使從土壤中新分離出的母株根霉MK96(Rhizopussp.MK96)突變得到的變異株根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)。也就是說，本發(fā)明者為了解決上述問題，以得到具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌為目的，從自然界新分離出可以生成L(+)-乳酸的根霉菌屬的菌體，經(jīng)變異處理使之具有耐氨性，從而得到具有較高L(+)-乳酸生成能力的菌株。因此，即使使用氨氣作為中和劑的時候，也能夠產(chǎn)生L(+)-乳酸，并且不會導致收率降低。
(1)母株的第1次篩選從水田土壤中取樣品1g，用5ml滅菌蒸餾水使之懸濁，調(diào)制成樣品原液。將其適當稀釋得到的最終稀釋液用康拉迪氏(コンラ-ジ)棒分別取0.1ml涂在如表1所示的含有L(+)-乳酸的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基的分離用瓊脂培養(yǎng)基上。接種后在24℃的恒溫槽中培養(yǎng)，從第三天開始，用鉑絲取出發(fā)展起來的菌落，移植到具有表1所示組成的斜面瓊脂培養(yǎng)基上。土壤樣品取1次約有50株，土壤樣品取100次合計約分離出3500株推測是真菌的菌株。這些真菌中，從斜面瓊脂培養(yǎng)基中，選擇800株認為形態(tài)接近根霉菌屬的菌作為1次篩選通過菌株。另外，表1所示的各種瓊脂培養(yǎng)基的組成是用1升蒸餾水中的g數(shù)來表示的。表1
>(2)采用試管振蕩培養(yǎng)進行第2次篩選將前述斜面瓊脂培養(yǎng)基上的孢子取1鉑絲，接種到10ml表2所示的前培養(yǎng)基上，在試管振蕩培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)2天。將1ml這種前培養(yǎng)基接種到裝有10ml表2所示的生產(chǎn)培養(yǎng)基的試管中，采用與前培養(yǎng)同樣的方法振蕩培養(yǎng)1天。然后，添加碳酸鈣1g，進一步振蕩培養(yǎng)2天。將培養(yǎng)上清液用バ-カ-サマ-ソン法比色定量L(+)-乳酸。對于所有1次通過的菌株800株，調(diào)查其L(+)-乳酸蓄積量，發(fā)現(xiàn)從靜岡縣藤枝市附近水田采集的土壤樣本得到的菌株在其中具有最高的L(+)-乳酸蓄積量，將此菌株命名為根霉MK96(Rhizopussp.MK96)。
表2
>(3)根霉MK96的菌學特征下面敘述本菌的菌學性質(zhì)。
(a)形態(tài)特征；用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基在24℃下培養(yǎng)得到的根霉MK96菌株的形態(tài)學特征有以下幾點①孢子(sporangium)有中隔；②只形成孢子囊、呈球形；③孢子囊柄(sporangiophore)呈蒼白色；④有假根(Rhizoid)和匍匐絲(stolon)；⑤孢子囊柄由假根的基部開始生長；⑥孢子囊和菌絲層都很發(fā)達。
(b)生理學特征；使用表3所示的蔡氏(Czapek)培養(yǎng)基，研究培養(yǎng)本菌時培養(yǎng)溫度及初始pH的影響。結果如表4-7所示。
表3
表4(b-1)增殖溫度
表5(b-2)增殖pH(增殖溫度30℃)
表6(b-3)各種碳水化合物與是否增殖
表7(b-4)各種碳水化合物與是否增殖
(4)鑒定從以上形態(tài)學及生理學的特征，進行本菌(根霉MK96)的菌學鑒定試驗。依照Zycha等的分類標準(Zycha.H.，Siepmann and G.limmemannMucorales，lehre(1969))，由于本菌的孢子囊形態(tài)為球形或扁球形、由多孢子組成、有中隔，本菌明顯應該是毛霉(Mukoraceae)(毛霉)科的接合菌。另外，依照Hesseltine(Hesseltine)及Ellis(Ellis)等提出的毛霉(Mukoraceae)目的檢索，由于本菌的孢子囊具備骨突，孢子囊柄生有菌絲、伴有假根、而且菌絲的假根形成部分直立，所以本菌應該屬于根霉菌屬(Rhizopus)(根霉屬)。
根霉菌屬現(xiàn)在報告有15種，但是依照Inui等(Inui T.，Takeda Y.andIizuka H.，Taxonomical studies on geus Rhizopus，The Journal of Generaland Applied Microbiology，11，1-121(1965))提出的檢索表，和被認為與本菌近緣的Rhizopus oryzae Went and Prinsen-Geerlings對比，同時進行本菌的詳細鑒定。
從形態(tài)學特征及在蔡氏培養(yǎng)基中的生理學特征等判斷，本菌株是與Rhizopus oryzae Went and Prinsen-Geerlings非常近緣的菌株。但是，如表8所示，與米根霉(Rhizopus oryzae)的標準培養(yǎng)物比較，L(+)-乳酸的生成量高出近4倍。從這個結果可以看出本菌株是新型菌株，命名為根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)菌株。根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)作為下述有用的變異菌株根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)的母株是有用的。另外，該菌株于1998年7月7日被保存在日本國通產(chǎn)省工業(yè)技術院微生物工業(yè)技術研究所，保存號為FERM P-16876，將該保存轉(zhuǎn)換為基于布達佩斯條約的保存，保存在同一地點，保存號為FERM BP-6776。
表8
(5)通過對根霉MK96的突變處理，從而誘導具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌亞硝基胍(NTG)變異；將上述根霉MK96菌株在具有如表1所示組成的斜面瓊脂培養(yǎng)基上、24℃下培養(yǎng)10天。在斜面上添加5ml滅菌水，很好的取下孢子后，使孢子懸濁液通過用紗布包裹的棉層，將除去孢子編的液體離心分離，只收集孢子。將這些孢子放在Tris蘋果酸鹽懸濁液中懸濁，添加NTG達到1mg/ml后，在24℃下振蕩孢子懸濁液2.5小時、150分鐘。然后，向離心分離得到的孢子中添加5ml滅菌水，再次進行離心分離。進行2次這種操作，完全將孢子洗干凈后，涂在按照L(+)-乳酸銨的濃度梯度為0～100g/l制成的瓊脂培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿)上在24℃條件下培養(yǎng)3天(濃度梯度平板培養(yǎng)法，Science，116，46-48(1952))。接著，把在L(+)-乳酸銨鹽濃度比較高的部分繁殖發(fā)育起來的菌落取出，在24℃下培養(yǎng)10天。
(6)L(+)-產(chǎn)乳酸菌的選擇將1鉑絲的上述(5)得到的變異菌株接種到含有10ml表2所示生產(chǎn)培養(yǎng)基的試管中，35℃下在試管振蕩培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)1天后，添加滅菌的碳酸鈣1g，再培養(yǎng)2天。采用バ-カ-ェマ-ソン法比色定量培養(yǎng)上清液中的L(+)-乳酸。在所有菌株中選擇燒瓶培養(yǎng)后L(+)-乳酸的生成量比較高的菌株10株，在后述實施例1所示的發(fā)酵缸中用氨氣中和的方法比較培養(yǎng)，將其中L(+)-乳酸生成量最高的菌株作為根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)。該菌株于1998年7月7日被保存在日本國通產(chǎn)省工業(yè)技術院微生物工業(yè)技術研究所，保存號為FERM P-16877，將該保存轉(zhuǎn)換為基于布達佩斯條約的保存，保存在同一地點，保存號為FERM BP-6777。
(7)L(+)-乳酸的生產(chǎn)方法通過有氧培養(yǎng)使本發(fā)明所使用的具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌產(chǎn)生L(+)-乳酸。本發(fā)明可以使用分離得到的根霉MK96-1156菌株的孢子或菌絲，接種到含有營養(yǎng)源的培養(yǎng)基上，在有氧的條件下使其增殖，從而產(chǎn)生L(+)-乳酸。
本發(fā)明分離培育出具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌，在有氧的條件下，把它們分批、半分批或連續(xù)的在通氣攪拌型或氣泡塔型生物反應器中培養(yǎng)，進一步，通過伴隨著菌體再次利用的反復分批培養(yǎng)，能夠得到高收率的L(+)-乳酸、而且產(chǎn)生高效率化。以下說明L(+)-乳酸的制備方法。
作為具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌的營養(yǎng)源，通?？梢允褂玫娜鐭N類、氮源、無機物等能夠同化的營養(yǎng)源。例如作為碳源可以舉出玉米淀粉、玉米粗粉、淀粉、糊精、麥芽糖、葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜等，能夠單獨或作為混合物使用。作為氮源可以舉出硫酸銨、硝酸鈉、大豆粉、玉米漿、谷膠粗粉、肉提取物、脂肉骨粉、酵母提取物、干燥酵母、棉籽粉、胨、小麥胚芽、魚粉、肉末、脫脂米糠、脫脂肉骨粉、麥芽提取物、玉米谷膠粗粉等無機或有機氮源，能夠單獨或作為混合物使用。作為無機鹽可以舉出碳酸鈣、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、溴化鈉、硼酸鈉或磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸鎂等各種無機鹽，能夠單獨或作為混合物使用。另外，相應必要的添加微量的鐵、錳、鋅、鈷、鉬酸等重金屬。另外，只要是生產(chǎn)L(+)-乳酸的物質(zhì)即可，可以使用任何一種營養(yǎng)源，也可以使用任何一種眾所周知的真菌培養(yǎng)材料。還有，為了消除加熱滅菌及培養(yǎng)過程中的發(fā)泡現(xiàn)象，也可以添加大豆油、亞麻籽油等植物油、十八烷醇等高級醇類、各種硅氧烷等的消泡劑。如上所述的營養(yǎng)源的配比沒有特別的限制，可以在很寬的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)使用條件通過簡單的小規(guī)模試驗很容易的決定最適宜營養(yǎng)源及配比。
另外，為了使營養(yǎng)培養(yǎng)基在培養(yǎng)前滅菌后的pH在5-7左右，優(yōu)選使用氫氧化鈉、氨水或氨氣調(diào)節(jié)pH值。
另外，對于本發(fā)明中屬于根霉菌屬、具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌孢子的植菌方法沒有特定的限制，通?？梢允褂脤⑸鲜鲦咦釉谝韵乱后w中懸濁，把該懸濁液直接接種到發(fā)酵用液體培養(yǎng)基上的殖菌的方法。
作為上述孢子的懸濁方法，例如可以使用在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，向形成該孢子的根霉菌屬中具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌的菌體中添加液體后混合攪拌的方法。另外，作為上述液體通常使用的是無菌水，也可以使用添加了少量(例如對全部液體占0.01重量％的程度)在生化學領域可以使用的物質(zhì)，例如吐溫80等吐溫類表面活性劑、Triton X系列等Triton表面活性劑、?；撍嚼娲嫉鹊臒o菌水。依照這種操作可以有效的在無菌水中分散孢子，從而能夠得到均勻的懸濁液。
用該營養(yǎng)培養(yǎng)基對本菌株的培養(yǎng)，原則上可以按照由一般的真菌制備L(+)-乳酸時通常所使用的液體培養(yǎng)來進行。液體培養(yǎng)的場合可以使用靜置培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)等的任何一種。本發(fā)明中特別優(yōu)選振蕩培養(yǎng)、深部通氣攪拌培養(yǎng)。在培養(yǎng)時，優(yōu)選有氧培養(yǎng)、氧氣或純氧的導入量優(yōu)選0.05-3.0vvm，更優(yōu)選0.2-1.0vvm。對于滿足這種條件的培養(yǎng)裝置，沒有特定限制，但是優(yōu)選一邊通入空氣或純氧或兩者混合氣體，一邊用攪拌型反應器或氣泡塔型反應器中的任何一種進行培養(yǎng)。特別是氣泡塔型反應器具有菌絲不能纏繞在攪拌葉片上、從而可以防止菌絲本身破損的優(yōu)點。
而且，培養(yǎng)操作可以通過空氣或氧氣的導入連續(xù)的、每次在新的培養(yǎng)液中分批的，或通過供給新的培養(yǎng)液半分批的進行培養(yǎng)。而且，分批進行時可以再次使用菌體。
對于培養(yǎng)溫度并沒有特別的限定，只要實質(zhì)上不阻礙本菌株增殖，可以生產(chǎn)L(+)-乳酸即可，但是一般在20-40℃，優(yōu)選35-40℃的范圍內(nèi)的溫度。
另外，培養(yǎng)時間最好根據(jù)葡萄糖等碳水化合物源的消耗及生產(chǎn)L(+)-乳酸的時間、反應器的種類等綜合判斷。特別是本發(fā)明的根霉MK96-1156，由于產(chǎn)生L(+)-乳酸的活性強，例如采用分批式的場合可以在20-100小時，優(yōu)選20-80小時，更優(yōu)選30-50小時內(nèi)完全得到L(+)-乳酸。另一方面，在該L(+)-乳酸菌中由于連續(xù)使用導致產(chǎn)生L(+)-乳酸的活性降低的菌株較少，因而也可以分批式、半分批式的再次使用或者連續(xù)的使用。連續(xù)使用的場合，可以隨時的考察該菌株生產(chǎn)L(+)-乳酸的活性，調(diào)整適宜的培養(yǎng)時間。
另外，培養(yǎng)基的pH優(yōu)選4-8，更優(yōu)選5-7。是因為在這個范圍中的生產(chǎn)情況良好。為了達到這個目的，優(yōu)選在給培養(yǎng)基滅菌前添加碳酸鈣或在培養(yǎng)過程中用pH傳感器或pH控制器添加氫氧化鈉水溶液或氨水或氨氣等，自動地維持適宜的pH值。特別是，本發(fā)明中優(yōu)選通過導入氨水或氨氣來調(diào)節(jié)pH值。理由是以下幾點。
也就是說，大規(guī)模進行生產(chǎn)的場合，在L(+)-乳酸發(fā)酵中一般使用碳酸鈣，但是，大多數(shù)時候在從培養(yǎng)液中分離純化游離的L(+)-乳酸時，會帶來非常大的困難。碳酸鈣作為中和劑使用時，由于生成的L(+)-乳酸轉(zhuǎn)變成L(+)-乳酸鈣的形式，在生產(chǎn)游離的L(+)-乳酸時，就必須添加硫酸，使之生成難溶的硫酸鈣，從而得以分離。因此，為了處理大量生產(chǎn)時生成的大量硫酸鈣，就必須要求大量的勞力和經(jīng)費。
另一方面，對于使用氨水或氨氣作為中和劑時，生成的L(+)-乳酸成為銨鹽的形式。該L(+)-乳酸銨鹽采用雙向電透析生成游離L(+)-乳酸的同時，可以回收同時產(chǎn)生的氨，從而在發(fā)酵中再次使用。另外，添加丁醇等醇類，直接使L(+)-乳酸氨酯化，也可以在得到L(+)-乳酸酯的同時回收氨，從而在發(fā)酵中再次使用。而且，也可以添加計算量的硫酸，使之生成作為肥料有用的硫酸銨，采用萃取等方法分離L(+)-乳酸，對氨的處理具有多樣性。
一般氨對微生物的增殖具有阻礙作用，氨的濃度如果達到一定限度以上，幾乎能夠阻礙增殖的進行。但是，本發(fā)明中使用的屬于根霉菌屬的產(chǎn)乳酸菌，是具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌，即使是在氨存在下，也能夠發(fā)揮優(yōu)秀的生產(chǎn)L(+)-乳酸的能力。因此，這種處理可以高收率的生產(chǎn)L(+)-乳酸同時易于進行包括處理生成的鹽、分離純化L(+)-乳酸等在內(nèi)的后處理。
按照本發(fā)明，可以提供一種具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌。使用該菌株，通過在有氧的條件下培養(yǎng)，能夠高收率的生產(chǎn)L(+)-乳酸。另外，通過在培養(yǎng)基中添加氨，能夠除去中和劑或產(chǎn)物帶來的阻礙作用，而且使用氨不會造成L(+)-乳酸生產(chǎn)能力降低、可以高收率的生產(chǎn)L(+)-乳酸。由于前培養(yǎng)進行1次即可，該菌株的反復分批發(fā)酵可以縮短生產(chǎn)時間，而且收率較高。
由于按照上述L(+)-乳酸的制備方法可以比較廉價地得到L(+)-乳酸，因此可以作為食品添加劑用于酒類、清涼飲料、咸菜、醬油、面包、啤酒等的制備，另外也可以在工業(yè)中如皮革、纖維、塑料等的制備中廣泛利用。
以下，結合實施例說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不局限于此。另外，“％”表示“重量％”。
實施例1L(+)-乳酸的分批發(fā)酵生產(chǎn)(通氣攪拌型反應器)在表1所示的斜面瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)根霉MK96-1156，然后收集孢子。接種到裝有如表9所示的前培養(yǎng)基100ml的500ml三角燒瓶中，使孢子濃度為106個/ml。在30℃下使用旋轉(zhuǎn)震動器(旋轉(zhuǎn)數(shù)170rpm、旋轉(zhuǎn)半徑2cm)將其培養(yǎng)15分鐘。
然后，在裝有表9所示的生產(chǎn)培養(yǎng)基1.5升的2.5升發(fā)酵缸(丸菱バイオェンジ(株)，東京)中添加前述前培養(yǎng)液，使之成為培養(yǎng)基量的10％(v/v)。在轉(zhuǎn)速為300rpm、通氣量為0.5vvm、培養(yǎng)溫度為35℃的條件下將其通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后，為了維持pH值為5.5，通過pH控制器添加10％的氨水。發(fā)酵過程如表10所示。
從接種前培養(yǎng)液后24小時開始，糖的消耗活躍起來，與此同時開始產(chǎn)生L(+)-乳酸。72小時后葡萄糖完全消失，生產(chǎn)出76克/升(結束時培養(yǎng)基的量為1.64升)的L(+)-乳酸。這時L(+)-乳酸的生產(chǎn)量為25g/升/日，以加入的葡萄糖為基準，L(+)-乳酸的產(chǎn)率超過69.2％。對于通過氨中和生產(chǎn)L(+)-乳酸，這是非常高的收率。表9<
>表10<
>比較例1使用作為根霉MK96-1156菌母株的根霉MK96菌株，在與實施例1相同的培養(yǎng)條件下，使用發(fā)酵缸進行培養(yǎng)。其結果如表11所示。
從表11可以看出，根霉MK96菌株即使在培養(yǎng)開始72小時后，L(+)-乳酸的蓄積量也只是根霉MK96-1156的50％以下，只蓄積了30g/升、最終液量為1.54升的L(+)-乳酸。以加入的葡萄糖為基準計算出的產(chǎn)率，在72小時后為25.7％。從該比較例也可以看出，根霉MK96-1156作為L(+)-乳酸的生成菌是非常優(yōu)秀的。
表11
比較例2除使用米根霉NRRL395代替根霉MK96-1156以外，在與實施例1相同的條件下進行操作。147小時后的最終液量為1.50升，收率是44.2％。結果如表12所示。
從表12可以看出，如果與以前的米根霉NRRL395菌株比較，本根霉MK96-1156菌株是生產(chǎn)L(+)-乳酸收率極高的乳酸生產(chǎn)菌。
表12
實施例2；L(+)-乳酸在氣泡塔型反應器中的分批生產(chǎn)在表1所示組成的斜面瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)根霉MK96-1156，然后收集孢子。接種到裝有表9所示的前培養(yǎng)基100ml的500ml三角燒瓶中，使孢子濃度為106個/ml。在30℃下使用旋轉(zhuǎn)震動器(轉(zhuǎn)速170rpm、旋轉(zhuǎn)半徑2cm)將其培養(yǎng)15分鐘。
然后，向裝有表9所示的生產(chǎn)培養(yǎng)基1.5升的2.5升氣泡塔型反應器中添加前述前培養(yǎng)液，使之成為培養(yǎng)基量的10％(v/v)。在通氣量為1.0vvm、培養(yǎng)溫度為35℃的條件下，只通氣進行培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后，為了維持pH值為5.5，通過pH控制器添加10％的氨水。培養(yǎng)過程如表13所示。
從表13可以看出，與實施例1所示的通氣攪拌型反應器比較，L(+)-乳酸的生產(chǎn)速度快，50小時后蓄積了81g/升(結束時培養(yǎng)基量為1.72升)，相對加入的葡萄糖其產(chǎn)率為77.4％。從發(fā)酵槽的制造成本、運行成本及規(guī)模擴大化的容易程度等方面綜合考慮，優(yōu)選氣泡塔型反應器。
表13
實施例3L(+)-乳酸的反復分批發(fā)酵生產(chǎn)(氣泡塔型反應器)采用與實施例2相同的方法，使用100升的大型氣泡塔型反應器進行反復分批培養(yǎng)。第1次加入的生產(chǎn)培養(yǎng)基的量為65升。另外，使用28％的氨水調(diào)整pH值。如表14所示，確認培養(yǎng)開始后第2天作為碳源的葡萄糖完全消失之后，停止通氣，使生成的菌絲塊沉淀于反應器的底部。然后取出上清液，得到含有菌絲塊的沉淀部分約10升。加入剛剛滅菌后的生產(chǎn)培養(yǎng)基，使總量達到65升，再次進行通氣開始培養(yǎng)。這種反復分批培養(yǎng)包括最初一次在內(nèi)共反復9次。
從表14可以看出，在1次分批培養(yǎng)中所必需的天數(shù)隨次數(shù)的增加而變短從第2次到第6次1.5天后結束培養(yǎng)，第7次以后為2天后結束培養(yǎng)。在15.5天后結束，共進行了9次反復分批培養(yǎng)。在通常的分批培養(yǎng)中，由于發(fā)酵需要2.5天，反應器的洗滌再需要0.5天，在15.5天內(nèi)只能進行5次分批培養(yǎng)。與此相比，本發(fā)明的根霉MK96-1156即使9次反復分批培養(yǎng)仍具有優(yōu)良的生產(chǎn)性，與這種已知的方法相比具有大約1.5倍的乳酸生產(chǎn)性，收率非常高。另外，在該反復分批培養(yǎng)中，由于前培養(yǎng)只進行最初的一次即可，與以前分批培養(yǎng)中每次都必須調(diào)制前培養(yǎng)液相比，可以大幅度降低勞動成本。表4
表4(續(xù))
實施例4使用氣泡塔型反應器分批生產(chǎn)L(+)-乳酸作為生產(chǎn)培養(yǎng)基，除在實施例2所使用的組成中加入了玉米粗粉1g/升之外，采用完全相同的操作，使用氣泡塔型反應器進行發(fā)酵。36小時后的最終液量為1.65升，收率為81.6％。結果如表15所示。生產(chǎn)速度得到了大幅度的改善，同時也可以得到較高的產(chǎn)率。表1權利要求
1.使用亞硝基胍使根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)變異得到的具有耐氨性的L(+)-產(chǎn)乳酸菌。
2.根霉MK96-1156(Rhizopus sp.MK96-1156)菌株。
3.L(+)-乳酸的生產(chǎn)方法，是在有氧條件下培養(yǎng)權利要求1或2所述的菌株。
4.如權利要求3所述的L(+)-乳酸的生產(chǎn)方法，其特征在于通過加入氨來調(diào)整培養(yǎng)液的pH。
5.如權利要求4所述的L(+)-乳酸的生產(chǎn)方法，其特征在于上述有氧培養(yǎng)可以通過空氣或氧氣的導入連續(xù)的、每次在新的培養(yǎng)液中分批的，或通過供給新的培養(yǎng)液半分批的進行培養(yǎng)。
6.如權利要求5所述的L(+)-乳酸的生產(chǎn)方法，其特征在于上述有氧培養(yǎng)為分批式的場合，不進行前培養(yǎng)，再次使用菌體進行分批式的培養(yǎng)。
7.如權利要求6所述的L(+)-乳酸的生產(chǎn)方法，其特征在于上述有氧培養(yǎng)是采用通氣攪拌型生物反應器或氣泡塔型生物反應器進行的。
8.根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)。
全文摘要
提供一種新的屬于根霉菌屬、具有耐氨性的L(+)－產(chǎn)乳酸菌,以及使用其高收率地制備L(+)－乳酸的方法。優(yōu)選使用用亞硝基胍使根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)變異得到的具有耐氨性的L(+)—產(chǎn)乳酸菌,特別是根霉MK96—1156(Rhizopus sp.MK96－1156)菌株?？梢酝ㄟ^在有氧條件下培養(yǎng)上述菌株生產(chǎn)L(+)－乳酸,優(yōu)選通過加入氨調(diào)整培養(yǎng)液的pH值。
文檔編號C12R1/845GK1254016SQ9911926
公開日2000年5月24日 申請日期1999年7月24日 優(yōu)先權日1998年7月24日
發(fā)明者岡部滿康 申請人:株式會社武藏野化學研究所