專利名稱：巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) DAS啟動子變體的制作方法
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastor is) DAS啟動子變體涉及序列表本申請含有計算機(jī)可讀形式的序列表，所述計算機(jī)可讀形式通過提述并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包含畢赤酵母DAS啟動子變體的分離的多核苷酸，包含可操作地連接 于編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸的所述啟動子變體的DNA構(gòu)建體，包含所述DNA構(gòu)建體的表達(dá) 載體，包含所述DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生目標(biāo)多肽的方法，包含UAS的啟動 子和UAS用于增加轉(zhuǎn)錄的用途。
背景技術(shù)：
真核生物廣泛在產(chǎn)業(yè)上用作宿主細(xì)胞以供產(chǎn)生用于，例如，藥物和工業(yè)應(yīng)用的多 肽。操縱基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的能力給出了提供更高生產(chǎn)得率的基礎(chǔ)。常規(guī)地，基因在真核生物中的最大表達(dá)是通過在染色體中擴(kuò)增表達(dá)盒來實(shí)現(xiàn) 的，所述表達(dá)盒包含可操作地連接于編碼目標(biāo)多肽的基因的單一啟動子，以及擴(kuò)增物 (amplifier)選擇性標(biāo)志物。經(jīng)常需要受控的表達(dá)。在甲基營養(yǎng)型酵母中，長期以來已知某些啟動子依賴于 生長培養(yǎng)基中甲醇的存在以供誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。然而，此通過甲醇誘導(dǎo)需要其他因子的存在，并 未闡明這些因子作用的確切機(jī)理。已知來自酵母的正因子(positive factor)的實(shí)例包 括Mxrlp，其被描述為在巴斯德畢赤酵母中利用甲醇所需的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)子(Lin-Cereghino 等，2006，Mol Cell Biol 26(3) :883-897)。這些甲醇依賴性啟動子的實(shí)例描述于幾種屬于已知為甲基營養(yǎng)型酵母的酵母組 中的酵母細(xì)胞。在這些生物中調(diào)控甲醇代謝中牽涉的酶的表達(dá)的啟動子特別強(qiáng)，且這些啟 動子通常在酵母中用于調(diào)控蛋白質(zhì)的異源表達(dá)。然而，用于培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞的特定碳源 對甲醇代謝啟動子的調(diào)節(jié)具有巨大影響。甲醇和甘油被認(rèn)為是對甲基營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng) 的充分底物，而葡萄糖被認(rèn)為不充分(EP 299108) 0因此，如果能使已知由甲醇代謝啟動子 的表達(dá)對底物的依賴性減少是合意的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了改進(jìn)的畢赤酵母DAS啟動子的變體以供增加目標(biāo)多肽的表達(dá)。在第一個方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包含i)由來自畢赤酵母屬的DAS 啟動子序列或其功能性部分組成的核苷酸序列，其中所述DAS啟動子包含于SEQ ID NO 1 ； 和ii)至少一個其他的UAS，其中所述UAS包含于SEQ ID NO :2。在第二個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多核苷酸序列(修飾的DAS啟動子)的DNA 構(gòu)建體，所述多核苷酸序列可操作地連接于編碼目標(biāo)多肽的結(jié)構(gòu)基因和終止子。在第三個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體，還包含信號肽編 碼區(qū)。在第四個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明表達(dá)載體的畢赤酵母屬宿主細(xì)胞。
在第五個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生目標(biāo)多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。在第六個方面，本發(fā)明涉及包含選自下組的UAS的啟動子i) (a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補(bǔ)鏈雜交；或ii) (a)包含SEQ ID NO 3或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和其中根據(jù)⑴或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多于一個拷貝存在。在第七個方面，本發(fā)明涉及UAS用于增加由啟動子的轉(zhuǎn)錄的用途，其中所述UAS選 自下組i) (a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補(bǔ)鏈雜交；或ii) (a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和其中根據(jù)⑴或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多于一個拷貝存在。附圖簡述

圖1顯示對SEQ ID NO 1所示的DAS啟動子的缺失分析。圖2顯示DAS啟動子變體具有的內(nèi)部缺失的位置，和所采用的引物的編號。圖3顯示本發(fā)明具有多個UAS的DAS啟動子變體。如圖所示從NsiI位點(diǎn)開始并 包括編碼肌醇六磷酸酶N端的區(qū)域的pDAS wt2的DNA序列對應(yīng)于SEQ ID NO :6。圖4顯示所述DAS啟動子在-255位左右具有內(nèi)部缺失的另外的缺失變體。定義
同一性就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如 EMBOSS 禾呈· 1 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等，2000,見上)(優(yōu)選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的 Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970,見上)測定。使用的任選參數(shù)是缺 口開啟罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩 陣。將標(biāo)記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一 性并且是如下計算的(相同的脫氧核糖核苷酸χ100)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))雜交就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo) 記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于所述序列，例如，SEQ IDNO :7;其全長互補(bǔ)鏈；或 其亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-ray film)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在 42°C，在5X SSPE、0. 3% SDS、200y g/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和 低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán) 格性為50%的甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至M小 時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2X SSC、0. 2% SDS優(yōu)選在45°C (非 常低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選在50°C (低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選在55°C (中嚴(yán)格性)，更優(yōu)選在 60°C (中-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選在65°C (高嚴(yán)格性)，并且最優(yōu)選在70°C (非常高嚴(yán)格 性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比 使用*艮據(jù) Bolton 禾P McCarthy 計算法(1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48 :1390)計算的 Tm 低大約 5°C至大約 10°C，在 0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7. 6,6mM EDTA,0. 5% NP-40, IXDenhardt 溶液，ImM 焦磷酸鈉，ImM 磷酸二氫鈉(sodium monobasic phosphate)，0. ImMATP 和 0. 2mg 每 ml 的酵母 RNA 中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的 Southern 印跡 步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至M小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6X SSC加0. 1% SDS中洗滌一次15分鐘，并用6X SSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗 滌兩次，每次15分鐘。亞序列術(shù)語“亞序列”在本文中定義為從SEQ ID NO :1序列5，和/或3，端具 有一個或多個(幾個)核苷酸缺失的核苷酸序列；其中所述亞序列具有啟動子活性(因此 為其功能性部分)。在一個優(yōu)選方面，亞序列包含SEQ ID NO :1的至少755個核苷酸，更優(yōu) 選SEQ ID NO 1的至少555個核苷酸，甚至更優(yōu)選SEQ ID NO 1的至少455個核苷酸，且最 優(yōu)選SEQ ID NO :1的至少355個核苷酸，分別對應(yīng)于SEQ ID NO :1的301-1055、501_1055、 601-1055 和 701-1055 位。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。 在一個優(yōu)選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5% 純，更優(yōu)選至少10 %純，更優(yōu)選至少20 %純，更優(yōu)選至少40 %純，更優(yōu)選至少60 %純，甚至 更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。
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基本上純的多核苷酸術(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制備物， 其不含其它外來的或不期望的核苷酸，并且處于適合于在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使 用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多 6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3 %，甚至更優(yōu)選至多2 %，最優(yōu)選至多 1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上 純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的 多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95% 純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并 且甚至最優(yōu)選至少99. 5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即所述多核苷 酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核 苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已 剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。 起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成 熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自 mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分 子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?not otherwise exist)自 然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段或所述核酸分子是合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表 達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(control sequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明 多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的所有組分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可 以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包 括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少 的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和目的為引入特異 性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列 編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置 于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編 碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連 接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類 型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的 (susceptible)0外源術(shù)語“外源”在本文中意指，根據(jù)本發(fā)明的上游激活序列(UAS)來源于不同 的來源，其中“來源”可指基因或細(xì)胞。因此，舉例而言，UAS通常見于巴斯德畢赤酵母DAS啟動子的啟動子區(qū)，然而，其可根據(jù)本發(fā)明用于不同的，天然地不含所述UAS的啟動子。因 此所述UAS可來源于來自相同細(xì)胞的不同基因，或其可來源于遺傳上不同的細(xì)胞/物種的 功能等同基因。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及多肽由甲醇誘導(dǎo)型啟動子的受控表達(dá)。這些啟動子的實(shí)例已經(jīng)在屬于 已知為甲基營養(yǎng)型酵母的酵母組的幾種酵母細(xì)胞中描述。在本發(fā)明的上下文中，將甲基營 養(yǎng)型酵母定義為能夠利用甲醇作為唯一碳源用于它們的生長的一組酵母。在這些生物中與 甲醇代謝有關(guān)的酶的啟動子是特別強(qiáng)的，并且這些啟動子(甲醇代謝啟動子)通常用于調(diào) 控酵母中蛋白質(zhì)的異源表達(dá)。甲基營養(yǎng)型酵母宿主細(xì)胞的已知成員屬于選自下組的屬畢赤酵母屬(Pichia)、 漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、球擬酵母屬(Torulopsis)。根據(jù)本發(fā) 明，在一個實(shí)施方案中，畢赤酵母屬宿主細(xì)胞可以選自下組巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵 母(Pichia methanolica)、安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、嗜熱甲醇畢赤酵母(Pichia thermomethanolica)。漢遜酵母屬或假絲酵母屬宿主細(xì)胞可以選自下組多形漢遜酵母 (Hansenulapolymorpha)和博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)。先前已經(jīng)分離并在文獻(xiàn)中描述了幾種啟動子，通過向生長培養(yǎng)基中添加甲醇，可 以控制異源多肽由所述啟動子的表達(dá)。這些啟動子包括但不限于例如AOXl啟動子(醇氧 化酶啟動子)、DHAS啟動子(或DAS啟動子)(二羥基丙酮合酶啟動子)、FDH啟動子(或 FMDH啟動子)(甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase)啟動子)、Μ0Χ啟動子(甲醇氧化酶 啟動子)、A0X2啟動子、ZZA1、PE)(5-、PEX8-、PEX14-啟動子。具體地，與本發(fā)明相關(guān)的啟動 子是二羥基丙酮合酶(DAS或DHAQ啟動子通常地，所有上述啟動子都要求存在甲醇用于它們的誘導(dǎo)。這種甲醇誘導(dǎo)要求 存在其他因子(如轉(zhuǎn)錄因子)，然而，這些因子的確切作用機(jī)制尚未闡明。在酵母中，例 如Mxrlp，已經(jīng)被描述為巴斯德畢赤酵母中甲醇利用所需的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)子(Lin-Cereghino 等，2006，Mol Cell Biol 26(3) :883-897)。本發(fā)明的發(fā)明人之前發(fā)現(xiàn)，由來自巴斯德畢赤酵母的Prml基因編碼的單一正因 子的受控表達(dá)，如其它地方(共同未決的申請WO 2008/090211，優(yōu)先權(quán)日2007年1月沈 日)所述，可足以在生長培養(yǎng)基中無需甲醇而誘導(dǎo)由幾種甲醇誘導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄。這已 經(jīng)使用Prml蛋白質(zhì)作為正活化子的模式蛋白(model protein)，和使用AOXl或DAS啟動子 用于報告子多肽(importer polypeptide)的受控表達(dá)而證明。獲得的結(jié)果顯示，僅通過控 制prml基因的表達(dá)，且在生長培養(yǎng)基中不存在甲醇的情況下誘導(dǎo)AOXl或DAS啟動子是可 能的。正調(diào)節(jié)子Prml的作用機(jī)理并未闡明，但一個可能性是所述調(diào)節(jié)子結(jié)合甲醇誘導(dǎo) 型啟動子的啟動子區(qū)，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)在包含來自巴斯德畢赤酵母的DAS啟動子的 DNA序列中鑒定了一個可能包含Prml結(jié)合區(qū)的上述區(qū)域。如其它地方(W02008/090211/PCT/EP2008/050870)所述，可在 1055bp 的片段 (SEQ ID NO 1)上獲得包含來自巴斯德畢赤酵母DAS啟動子的片段。為了測試啟動子活性以供分析經(jīng)修飾的啟動子變體，所述啟動子需要可操作地連接于報道子基因?？墒褂闷浔磉_(dá)可方便地確定的任何基因。合適的報道子基因可為布氏 檸檬酸桿菌(CitrcAacter braakii)肌醇六磷酸酶基因，所述基因經(jīng)密碼子優(yōu)化以供在畢 赤酵母屬中表達(dá)，并與來自釀酒酵母的α因子信號肽在框內(nèi)融合。編碼所述信號肽的核 酸序列還可有利地經(jīng)密碼子優(yōu)化以供畢赤酵母屬表達(dá)。上述報道子基因構(gòu)建體的完整DNA 序列示于SEQ ID NO :4(關(guān)于如何構(gòu)建該報道子基因構(gòu)建體的細(xì)節(jié)，參見共同未決的申請 W02008/090211)。所述α因子信號肽編碼SEQ ID NO :4的1-255位。然后所述報道子基 因可與包含DAS啟動子的片段(SEQ ID NO 1)融合。一種上述構(gòu)建體示于SEQ ID NO :5， 其包含所述啟動子和所述肌醇六磷酸酶基因的起始。信號肽的起始密碼子可見于SEQ ID NO :5 的 1065 位。使用插入合適表達(dá)載體(任何支持在畢赤酵母屬中表達(dá)的載體)的上述構(gòu)建體進(jìn) 行缺失分析。根據(jù)這些分析，如在實(shí)施例中詳細(xì)解釋的，可得出結(jié)論所述1055bp DAS啟動 子片段(SEQ ID NO 1)包含似為上游激活序列(Upstream Activating Sequence, UAS)的 區(qū)域。該UAS序列似包含于IOObp片段(SEQ ID NO 1中的701-800位)。當(dāng)該片段以1、 2或3個拷貝添加至所述1055bp片段的亞序列時，可觀察到啟動子活性的顯著增加。因此 巴斯德畢赤酵母DAS啟動子包含于1055bp片段，而UAS包含于IOObp片段。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包含i)由來自畢赤酵母屬的DAS啟動子序列組成的核苷酸序列，或其功能性亞序列， 其中所述DAS啟動子包含于SEQ ID NO 1 ；和ii)至少一個其他UAS，其中所述UAS包含于SEQ ID NO :2。根據(jù)進(jìn)行的分析可見，在另一個實(shí)施方案中，DAS啟動子包含于對應(yīng)SEQ ID NO=I 的201-1055位的855bp亞序列，特別是包含于對應(yīng)SEQ ID NO 1的301-1055位的755bp 亞序列，更特別是包含于對應(yīng)SEQ ID NO 1的401-1055位的655bp亞序列，更特別是包含 于對應(yīng)SEQ ID NO :1的501-1055位的555bp亞序列，更特別是包含于對應(yīng)SEQ ID N0:1的 601-1055位的455bp亞序列，更特別是包含于對應(yīng)SEQ ID NO 1的701-1055位的!355bp亞 序列。通過分析所述啟動子序列，揭示了另外3個可能的TATA盒，分別在SEQID NO :1的 882、955和1002位。在一個實(shí)施方案中，啟動子至少包含在882位的TATA盒。在另一個實(shí) 施方案中，啟動子至少包含在955位的TATA盒。還在另一個實(shí)施方案中，啟動子至少包含 在1002位的TATA盒。UAS包含于對應(yīng)SEQ ID NO 1的701-800位的IOObp亞序列。然而，所述UAS可 小于lOObp。在所述IOObp亞序列內(nèi)，在SEQ ID NO :1中767-788位的大約20bp似對正常 功能是必需的。因此，在另一個實(shí)施方案中，所述UAS至少包含SEQ ID NO :1中767-788位的亞序 列。添加更多其他的UAS會更增加啟動子活性。添加三個其他的UAS時觀察到最高活 性。因此，在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的啟動子包含至少兩個其他的UAS,特別是至少三 個其他的UAS,更特別是至少四個其他的UAS,且甚至更特別是至少五個其他的UAS0然而，可預(yù)見這些數(shù)字不會無限增加，當(dāng)其他的UAS數(shù)目變得過高時，也會增加正 活化子Prml的表達(dá)，或者可增加Mxrl正活化子的水平。
在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的DAS啟動子包含一個其他的UAS，其位 于SEQ ID N0:1855bp亞序列的上游。因此，一個實(shí)施方案涉及本發(fā)明的分離的多核苷酸， 其中所述啟動子選自下組a)包含SEQ ID NO 7的77_擬8位，特別是77-901位，更特別是77_948位的多核 苷酸，或由SEQ ID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位組成的多核苷 酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位具有至少90%同一性，優(yōu)選至少 95 %，更優(yōu)選至少97 %，甚至更優(yōu)選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高 嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 7的77-擬8位，特別是77-901位，更特別是77-948位或其全長 互補(bǔ)鏈雜交。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)修飾的DAS啟動子包含兩個其他UAS，其位于 SEQ ID N0:1的855bp亞序列的上游。因此，一個實(shí)施方案涉及本發(fā)明的分離的多核苷酸， 其中所述啟動子選自下組a)包含SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位的多 核苷酸，或由SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位組成的多
核苷酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位具有至少90%同一性，優(yōu)選至少 95 %，更優(yōu)選至少97 %，甚至更優(yōu)選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高 嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位或其全長 互補(bǔ)鏈雜交。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)修飾的DAS啟動子包含三個其他UAS，位于 SEQ ID N0:1的855bp亞序列的上游。因此，一個實(shí)施方案涉及本發(fā)明的分離的多核苷酸， 其中所述啟動子選自下組a)包含SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位的 多核苷酸，或由SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位組成 的多核苷酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位具有至少90%同一性，優(yōu)選至 少95 %，更優(yōu)選至少97 %，甚至更優(yōu)選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高 嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位或其全 長互補(bǔ)鏈雜交。所述經(jīng)修飾的本發(fā)明DAS啟動子對在畢赤酵母屬，且例如在多形漢遜酵母和博伊 丁假絲酵母或其他甲基營養(yǎng)型酵母中表達(dá)任何目標(biāo)多肽是有用的。因此，在另一個方面，本 發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸序列(經(jīng)修飾的DAS啟動子)的DNA構(gòu)建體，所述多核苷酸序列可操作地連接于編碼目標(biāo)多肽的結(jié)構(gòu)基因和終止子。所述經(jīng)修飾的本發(fā)明DAS啟動子還可有利地用于任何合適的畢赤酵母屬表達(dá)質(zhì) 粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道如何將所述啟動子克隆入上述構(gòu)建體。因此在另一個實(shí)施方案 中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體，其進(jìn)一步包含信號肽編碼區(qū)。還在另一個方面，本發(fā)明涉及畢赤酵母屬宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的表達(dá)載體。具 體而言所述畢赤酵母屬宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母屬宿主細(xì)胞。在甚至另一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生目標(biāo)多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。在所述產(chǎn)生方法中，正調(diào)節(jié)子Prml會由宿主細(xì)胞產(chǎn)生，因?yàn)閜rml基因?qū)Π退沟庐?赤酵母而言是內(nèi)源的。然而，過量產(chǎn)生Prml可進(jìn)一步增加啟動子活性，特別是當(dāng)UAS以多 拷貝存在時。甚至過表達(dá)Mxrl蛋白可對經(jīng)修飾的DAS啟動子活性具有作用。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生目標(biāo)多肽的方法，其中正調(diào) 節(jié)子Prml在宿主細(xì)胞中的表達(dá)通過調(diào)控Prml的表達(dá)或通過增加Prml編碼基因的拷貝數(shù) 而增加。在又一個實(shí)施方案中，正調(diào)節(jié)子Mxrl的表達(dá)通過調(diào)控Mxrl的表達(dá)或通過增加Mxrl 編碼基因的拷貝數(shù)而增加。在一個其他的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)子Prml和Mxrl兩者的表達(dá)水 平均增加。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，從合適的啟動子組成型表達(dá)正調(diào)節(jié)子。優(yōu)選地，啟動 子不是天然啟動子，意思是調(diào)控正調(diào)節(jié)子表達(dá)的啟動子與通常調(diào)控表達(dá)的啟動子不同。在 本發(fā)明的上下文中，將這些優(yōu)選的啟動子稱為“非天然的”。啟動子可以對宿主生物仍然是 天然的，但是在所研究基因(例如prml基因)的語境中是外源的。在一個具體實(shí)施方案中， 啟動子選自下組GAP啟動子(甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子)、TEF1啟動子(翻譯延長因 子EF-I α啟動子)和PGK啟動子(磷酸甘油酸激酶啟動子)。除了由如上所述的非天然 啟動子調(diào)控的表達(dá)之外，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞通常從存在于染色體上的內(nèi)源基因表達(dá)正 調(diào)節(jié)子。在另一個實(shí)施方案中，可將編碼正調(diào)節(jié)子的基因的內(nèi)源拷貝失活，例如通過缺失失 活，或者控制基因的內(nèi)源拷貝的正常啟動子可以被所選的非天然啟動子代替。在另一個的實(shí)施方案中，正調(diào)節(jié)子的表達(dá)受控于(is controlled from)并非甲醇 誘導(dǎo)型的誘導(dǎo)型啟動子。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的正調(diào)節(jié)子還可為從其他酵母細(xì)胞分離的Prml功能性同 源物。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，一個這樣的候選者可為由來自多形漢遜酵母(同種異 名安格斯畢赤酵母)的mut3基因編碼的Mut3。在本文提供的實(shí)施例中，Prml或Mxrl在巴 斯德畢赤酵母中過量產(chǎn)生。然而可能的是相同的作用可通過在畢赤酵母屬中過量產(chǎn)生Mut3 或在漢遜酵母屬中過量產(chǎn)生Prml或在漢遜酵母屬中過量產(chǎn)生Mut3來獲得。這些未經(jīng)測試。因此，在本發(fā)明另一個實(shí)施方案中，所述正調(diào)節(jié)子是Mut3.存在于宿主細(xì)胞中正調(diào)節(jié)子水平的增加還可簡單地通過在宿主細(xì)胞中存在編碼 所述調(diào)節(jié)子的基因的多重拷貝來提供。本發(fā)明的另一個方面涉及包含于SEQ ID NO :2的UAS，或至少包含SEQ ID NO 3 的 UAS。因此，本發(fā)明涉及選自下組的分離的多核苷酸
(a)包含SEQ ID NO :2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補(bǔ)鏈雜交。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及選自下組的分離的多核苷酸(a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補(bǔ)鏈雜交。根據(jù)本發(fā)明UAS可用于像激活DAS啟動子一樣激活外源啟動子。在此情況下，根 據(jù)本發(fā)明的UAS的一個或多個拷貝與在其天然形式中不含有如本文所解釋的UAS的啟動子 組合。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的UAS的啟動子，其中所述UAS對 所述啟動子是外源的，或其中所述UAS以多于一個拷貝存在。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及UAS用于增加由啟動子的轉(zhuǎn)錄的用途。所述啟 動子可為外源啟動子，在此情況下，其尚未包含UAS的拷貝，或其可為DAS啟動子，在此情況 下，可如上所述添加其他的拷貝。因此，在另一個實(shí)施方案中本發(fā)明涉及包含選自下組的UAS的啟動子i) (a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補(bǔ)鏈雜交；或ii) (a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和其中根據(jù)⑴或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多于一個拷貝存在。在又一個方面，本發(fā)明涉及UAS用于增加由啟動子的轉(zhuǎn)錄的用途，其中所述UAS選 自下組i) (a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補(bǔ)鏈雜交；或ii) (a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同 一性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少 高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和其中根據(jù)(i)或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多于一個拷貝存在。適于上述激活的啟動子可具體而言是由甲醇誘導(dǎo)的啟動子。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域公知方法將細(xì)胞在適于產(chǎn)生多肽的營養(yǎng)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。舉例而言，所述細(xì)胞可通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的 條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分 批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培 養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可 以根據(jù)公布的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到 營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠 從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法 可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzyme assay) 可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng) 培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明產(chǎn)生的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限 于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型 (preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例 如，Protein Purification, J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden 編，VCH Publishers, New York, 1989)。在一個具體實(shí)施方案中，由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽對宿主細(xì)胞是異源的。在另一個 實(shí)施方案中，所述多肽對所述宿主細(xì)胞是同源的。實(shí)施例材料和方法菌株大腸桿菌TOPl(Kinvitorgen)和 Dffialpha(TOYOBO)用于質(zhì)粒構(gòu)建。LB (1 % Tripton (Difco), 0. 5%酵母提取物(Difco)，0. 5% NaCl)在補(bǔ)充相關(guān)抗生素之后用作基礎(chǔ)
培養(yǎng)基。巴斯德畢赤酵母his4突變體，GS115用于表達(dá)測試。巴斯德畢赤酵母C01s702 (Muts)是AOXl基因破壞的畢赤酵母NRRLY-15851菌株，并描述于實(shí)施例5。供其生長所用的培養(yǎng)基如下所述YPD 蛋白胨(Difco)，1%酵母提取物(Difco)，2%葡萄糖)RD 瓊脂；IM 山梨醇，2 % 葡萄糖，1. 34 % 酵母氮基(Yeast nitrogen base) (Difco)，4X10_5(%生物素，0. 005%氨基酸(L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和 L-異亮氨酸),2% Agar Noble (Difco)MD瓊脂；1.34%酵母氮基，4X10_5%生物素，2%葡萄糖巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌株通過電穿孔來轉(zhuǎn)化。新鮮轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞通過下述方法制備。將 宿主菌株接種入IOOml的YPD，并生長至0D660為1. 2 1. 4。細(xì)胞用冰水洗滌兩次(IOOml 和50ml)，并用細(xì)1冰冷的IM山梨醇洗滌。然后將細(xì)胞懸于0. 2ml冰冷的IM山梨醇。將 線性化的(linearized)的質(zhì)粒DNA(1 2 μ g)與80 μ 1新鮮感受態(tài)細(xì)胞混合，并在冰上 儲存5分鐘。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰冷的0. 2cm電穿孔小杯(cuvette)中。轉(zhuǎn)化使用BioRad GenePulser II進(jìn)行。使用的參數(shù)為1500V、25 μ F和200 Ω。在脈沖之后緊接著將細(xì)胞懸 于Iml冰冷的IM山梨醇。將混合物鋪于相關(guān)的選擇平板上。篩詵His4位點(diǎn)整合的菌落PCR用經(jīng)滅菌的牙簽將細(xì)胞挑取到0. 2ml試管中，然后在微波烤爐中烘烤。將經(jīng)干 燥的細(xì)胞懸于50 μ 1滅菌水中，并對其使用Expand High Fidelity Plus (Roche)進(jìn)行 PCR0反應(yīng)混合物為20μ 1，包含2mM dNTP，每種引物10 μ M，1單位Expand High Fidelity Plus(Roche)，IX Expand High Fidelity Plus 緩沖液(Roche)以及 1 μ 1 如上所述的細(xì)胞 懸液。PCR 引物為引物 139 :5，-ctgctctagccagtttgctg-3，(SEQ ID NO :10)(在基因組中 His4 標(biāo)志物上游)和 S98 :5，-gccgcccagtcctgctcgct-3，(SEQ ID NO :11)(在表達(dá)載體中 His4標(biāo)志物和AOX終止子之間)。PCR程序如下所示
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其包含i)由來自畢赤酵母屬(Pichia)的DAS啟動子序列或其功能性部分組成的核苷酸序列， 其中所述DAS啟動子包含于SEQ ID NO 1 ；和ii)至少一個其他的UAS，其中所述UAS包含于SEQID NO :2。
2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述UAS至少包含示于SEQIDNO 3的序列。
3.權(quán)利要求1或2的分離的多核苷酸，其中所述DAS啟動子包含于SEQIDNO :1中的 501-1055 位。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離的多核苷酸，其中所述DAS啟動子包含于SEQID NO 1 中的 601-1055 位。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離的多核苷酸，包含至少兩個其他UAS0
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的分離的多核苷酸，包含至少三個其他UAS0
7.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述啟動子選自下組a)包含SEQID NO 7的77-828位，特別是77-901位，更特別是77-948位的多核苷酸， 或由SEQ ID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位組成的多核苷酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位具有至少90 %同一性，優(yōu)選至少95 %， 更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格 條件下與SEQ ID NO 7的77-8 位，特別是77-901位，更特別是77-948位或其全長互補(bǔ) 鏈雜交。
8.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述啟動子選自下組a)包含SEQID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位的多核苷 酸，或由SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位組成的多核苷 酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位具有至少90%同一性，優(yōu)選至少 95 %，更優(yōu)選至少97 %，甚至更優(yōu)選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格 條件下與SEQ ID NO 8的60-920位，特別是60-993位，更特別是60-1040位或其全長互補(bǔ) 鏈雜交。
9.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述啟動子選自下組a)包含SEQID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位的多核 苷酸，或由SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位組成的多 核苷酸；b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位具有至少90%同一性，優(yōu)選至少 95 %，更優(yōu)選至少97 %，甚至更優(yōu)選至少99 %同一性；c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格 條件下與SEQ ID NO 9的48-1015位，特別是48-1088位，更特別是48-1135位或其全長互補(bǔ)鏈雜交。
10.一種DNA構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列可操作地連接于編碼目標(biāo)多肽的結(jié)構(gòu)基因和終止子。
11.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求10的DNA構(gòu)建體，進(jìn)一步包含信號肽編碼區(qū)。
12.畢赤酵母屬宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求10的表達(dá)載體。
13.—種產(chǎn)生目標(biāo)多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。
14.權(quán)利要求13的方法，其中通過調(diào)控Prml的表達(dá)或通過增加編碼Prml的基因的拷 貝數(shù)而增加正調(diào)節(jié)子Prml的表達(dá)。
15.權(quán)利要求13的方法，其中通過調(diào)控Mxrl的表達(dá)或通過增加編碼Mxrl的基因的拷 貝數(shù)而增加正調(diào)節(jié)子Mxrl的表達(dá)。
16.權(quán)利要求13的方法，其中通過調(diào)控Prml和Mxrl的表達(dá)或通過增加各自基因的拷 貝數(shù)而同時增加正調(diào)節(jié)子Prml和Mxrl的表達(dá)。
17.一種啟動子，其包含選自下組的UAS:i)(a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 2具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同一 性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴(yán) 格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補(bǔ)鏈雜交；或ii)(a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 3具有至少90 %同一性，優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少97 %，甚至更優(yōu)選至少99 %同一 性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴(yán) 格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和其中根據(jù)(i)或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多于一個拷貝存在。
18.UAS在增加由啟動子的轉(zhuǎn)錄中的用途，其中所述UAS選自下組i)(a)包含SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO 2組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQID NO 2具有至少90%同一性，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，甚至更優(yōu)選至少99%同一 性；或(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴(yán) 格條件下與SEQ ID NO 2或其全長互補(bǔ)鏈雜交；或ii)(a)包含SEQ ID NO :3，或由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸；或(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 3具有至少90 %同一性，優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少97 %，甚至更優(yōu)選至少99 %同一 性；或(C)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高嚴(yán) 格條件下與SEQ ID NO 3或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和其中根據(jù)(i)或(ii)的UAS對所述啟動子是外源的，或以多于一個拷貝存在。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述啟動子由甲醇誘導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離多核苷酸形式的啟動子變體，包括i)由來自畢赤酵母的DAS啟動子序列組成的核苷酸序列或其功能性部分，其中所述DAS啟動子包含于SEQ ID NO1；和ii)至少一種其他UAS，其中所述UAS包含于SEQID NO2。
文檔編號C12N15/81GK102105589SQ200980126957
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者堤紀(jì)子, 高木忍 申請人:諾維信公司