專利名稱：：突變aox1啟動(dòng)子的制作方法突變A0X1啟動(dòng)子本發(fā)明涉及突變巴斯德畢赤酵母A0X1啟動(dòng)子。釀酒酵母(Xcewvis/"e)作為真核模式生物和產(chǎn)生體系一直以來(lái)在科學(xué)和生物技術(shù)使用上占據(jù)重要地位(并且目前仍然占據(jù)重要地位)。上世紀(jì)另一種酵母獲得了很大的關(guān)注裂殖酵母(fissionyeast)粟酒裂殖酵母(5^izo^cc/zaramyc^;om&)。由于其只依靠裂殖的繁殖特性，粟酒裂殖酵母作為模式生物獲得了極大的關(guān)注，并且時(shí)至今日在分子遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方面，它連同釀酒酵母一起是最徹底研究的酵母菌種。在目前已知的超過700種不同的酵母菌種里，上述兩種酵母僅能夠?yàn)榧夹g(shù)和科學(xué)應(yīng)用提供有限的感興趣的特性。自二十世紀(jì)七十年代或八十年代以來(lái)，將越來(lái)越多具有突出特性的酵母菌種研究用于生物技術(shù)和研究。這些所謂的非常規(guī)酵母(non-conventionalyeast;NCY)或非酵母屬酵母(non-(Sacc/zara加ycasyeast)(在這種情況下術(shù)語(yǔ)酵母屬包括酵母粟酒裂殖酵母)的開發(fā)出于幾種理由它們擁有醫(yī)學(xué)重要性如白念珠菌(Caw&(5ba/6/cara)或技術(shù)相關(guān)性(technologicalrelevance)如具有在特殊底物(例如n-烷烴、乳糖)上的生長(zhǎng)能力的Kwrowz'a/z)o/"z'ca和乳酸克魯維酵母(幻Mjveram7ces/acfe)。例如大量地研究最普遍的人真菌病原體白念珠菌以揭示涉及病理的毒力因子的本質(zhì)，因此白念珠菌成為致病酵母的模式生物。另一組良好建立的NCY是曱基營(yíng)養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母(/7a打se"w/a/o(vmor;/^)(Pz'c^a,其在重組蛋白產(chǎn)生和過氧化物酶體生物發(fā)生的研究方面優(yōu)于釀酒酵母。這些僅是仍然具有技術(shù)或?qū)W術(shù)吸引力的非常^L酵母中最突出的成員。到目前為止幾個(gè)其它的菌種也是特別感興趣的，而這個(gè)組將在今后幾年迅速地成長(zhǎng)。糖，自然界中種類最豐富的分子，為所有已知的酵母利用。盡管種與種之間的底物接受度(acceptance)存在巨大差異(參見表1),葡糖-6-磷酸或果糖-6-磷酸到丙酮酸的轉(zhuǎn)化是它們新陳代謝中共同的主題?？傊糜谔墙徒馔緩降拿冈O(shè)備在不同的酵母之間存在巨大的變化。雖然釀酒酵母中大多數(shù)酶是，至少是部分地已知并表征的，而在NCY中僅描述了少數(shù)酶。在一些酵母中糖酵解所需的一些功能通過幾種基因/酶介導(dǎo)，特別是那些在新陳代謝控制或調(diào)節(jié)中扮演額外角色和/或處于分支點(diǎn)的基因/酶，如葡糖激酶/己糖激酶、磷酸果糖激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶。通常，差別調(diào)節(jié)的同工酶說明在變化的環(huán)境先決條件下的不同的功能。一些編碼糖酵解酶的基因是組成性和高表達(dá)的，例如釀酒酵母PGKI(磷酸甘油酸激酶)或巴斯德畢赤酵母GL4P基因(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)，而其它酶是嚴(yán)格調(diào)節(jié)的如釀酒酵母的五jVO/(烯醇化酶)基因。表1:選擇的引起生物技術(shù)方面興趣的具有葡萄糖和果糖以外相關(guān)商業(yè)底物的酵母<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>新陳代謝中丙酮酸的命運(yùn)在酵母種類和培養(yǎng)條件之間變化顯著。在釀酒酵母和其它所謂的Crabtree陽(yáng)性酵母中，葡萄糖和相關(guān)的糖抑制呼吸作用。這導(dǎo)致丙酮酸通過丙酮酸脫羧酶轉(zhuǎn)化成乙醇和C02,甚至在高氧含量下，其也稱為發(fā)酵。在多數(shù)NCY所屬的Crabtree陰性酵母中，丙酮酸到乙醇的轉(zhuǎn)化僅在缺氧條件下發(fā)生。在有氧條件下，丙酮酸通過丙酮酸脫氫酶和三羧酸(TCA)循環(huán)氧化成C02。TCA循環(huán)對(duì)于細(xì)胞代謝是特別感興趣的，由于它是將糖氧化為C02的唯一途徑。氧化成C02導(dǎo)致NADH的產(chǎn)生，將其用作能量產(chǎn)生(energyproduction)。此外TCA循環(huán)中間體是用于生物合成目的的代謝物的主要來(lái)源。由于中間體的去除，必須補(bǔ)充TCA循環(huán)以保持它的運(yùn)行。酵母中主要的添補(bǔ)反應(yīng)是丙酮酸羧化酶和乙醛酸循環(huán)。前者是生長(zhǎng)于銨作為單獨(dú)氮源上時(shí)的主要途徑，而后者是生長(zhǎng)于少于3個(gè)碳原子的碳源上時(shí)所需的。相對(duì)于這種突出的興趣，關(guān)于NCY中涉及TCA循環(huán)的基因和酶幾乎一無(wú)所知。由分解代謝反應(yīng)產(chǎn)生的NADH,在細(xì)胞溶膠或線粒體中，必需再氧化成NAD+以保持所述反應(yīng)進(jìn)行。在Crabtree陰性酵母(例如巴斯德畢赤酵母)中，在有氧條件下，NADH主要通過呼吸鏈再氧化。在Crabtree陽(yáng)性酵母，如釀酒酵母中的情況有顯著的不同，其中呼吸作用和發(fā)酵共存。在有氧條件生長(zhǎng)于葡萄糖上時(shí)，呼吸作用由葡萄糖阻抑而出現(xiàn)發(fā)酵。在這些條件下NAD+通過乙醇(NADH通過糖酵解產(chǎn)生)或甘油的形成再生。酵母中的呼吸作用不同于每本生物化學(xué)教科書中描述的這種途徑的動(dòng)物范例。首先，一些酵母，如釀酒酵母和乳酸克魯維酵母,缺乏呼吸鏈的復(fù)合物I。在這些酵母中進(jìn)行NAD+再生不用由外部或內(nèi)部NADH脫氫酶泵送質(zhì)子通過線粒體內(nèi)膜。第二個(gè)主要的不同存在于Crabtree陰性酵母、真菌和植物中，是與細(xì)胞色素鏈的復(fù)合物III和IV平行的可選擇的呼吸作用途徑?？蛇x擇的呼吸作用由所謂的可選擇的氧化酶介導(dǎo)，該氧化酶直接從泛醌池(pool)轉(zhuǎn)移電子至氧氣，而不將質(zhì)子泵送通過線粒體內(nèi)膜。用于生物合成目的的NADPH在戊糖磷酸途徑(PPP)的氧化部分中產(chǎn)生。由這種途徑提供的其它非常重要的代謝物是核糖-5-磷酸和赤蘚糖-4-磷酸，分別用于核酸和核苷酸輔因子的合成和用于芳族氨基酸的合成。有關(guān)非常規(guī)酵母中涉及PPP的基因和它們相應(yīng)的酶的信息中仍存在許多差距。少數(shù)酶從產(chǎn)朊念珠菌(Cfl"AWaM"7&)、粟酒裂殖酵母和乳酸克魯維酵母中分離。組成的和動(dòng)力學(xué)的表征揭示了這些酶之間的幾種不同。由于信息的缺乏，這些酵母中對(duì)于PPP的影響無(wú)法評(píng)估，然而已經(jīng)說明的是例如糖酵解缺陷的乳酸克魯維酵母的磷酸葡萄異構(gòu)酶突變體能夠在葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，與釀酒酵母相反。這個(gè)觀察指出乳酸克魯維酵母中戊糖磷酸途徑的容量足夠在作為碳源的葡萄糖上的生長(zhǎng)。在曱基營(yíng)養(yǎng)酵母中，可存在額外的轉(zhuǎn)酮醇酶(二羥丙酮合酶)。這種酶定位于過氧化物酶體中，并且通過帶有二羥丙酮和甘油醛-3-磷酸形成的與木酮糖-5-磷酸的縮合將甲醛的同化作用賦予細(xì)胞代謝。酵母作為單細(xì)胞真核生物提供吸引人的用于重組蛋白產(chǎn)生的表達(dá)體系。它們結(jié)合了細(xì)菌的正面特點(diǎn)(pros),如充分開發(fā)的遺傳操作技術(shù)，簡(jiǎn)單、安全并且因此廉價(jià)的(大規(guī)模)培養(yǎng)技術(shù)，和作為主要益處的真核表達(dá)體系，即真核蛋白加工。由于上述原因，釀酒酵母多年以來(lái)在該領(lǐng)域占據(jù)重要地位，導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)(例如胰島素、HBsAg、HSA)在這種生物體中產(chǎn)生。由于高糖基化作用、壁膜間隙中分泌蛋白的保持、質(zhì)粒不穩(wěn)定性和低產(chǎn)物收率，釀酒酵母表現(xiàn)出一些局限性。為了克服這種個(gè)別生物體的局限性，開發(fā)了小組的非常規(guī)酵母作為宿主細(xì)胞用于異源基因表達(dá)。其中，使用了乳酸克魯維酵母、K/^o/^/ca和曱基營(yíng)養(yǎng)酵母博伊丁氏念珠菌(Om力^76oWm'z')、多形漢遜酵母和巴斯德畢赤酵母，但僅最后2個(gè)菌種獲得了突出的商業(yè)興趣。粟酒裂殖酵母展現(xiàn)一些接近高等真核生物的特征，使這種酵母成為用于異源蛋白產(chǎn)生的非常有吸引力的宿主(l)轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制與高等真核生物的更相似，(2)—些哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子在粟酒裂殖酵母發(fā)揮功能，(3)RNA剪接的能力，突出顯示在剪接體成分與哺乳動(dòng)物的相似性方面，(4)能夠識(shí)別哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保持信號(hào)(retentionsignal)KDEL,(5)糖蛋白中半乳糖殘基的存在和(6)—些其它翻譯后修飾如蛋白質(zhì)的乙?；彤愇於┗噍^于酵母細(xì)胞以更類似于哺乳動(dòng)物的方式進(jìn)行?？紤]到粟酒裂殖酵母如在結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)中可靠的異源蛋白產(chǎn)生和高產(chǎn)量的應(yīng)用，幾種上述的特征可能在不遠(yuǎn)的將來(lái)增加其在重組蛋白產(chǎn)生中的重要性。所有微生物擁有機(jī)制以使它們的新陳代謝適應(yīng)環(huán)境中可用養(yǎng)分的最優(yōu)利用。對(duì)這些環(huán)境約束因素快速而精確的適應(yīng)是所有生物體中控制生長(zhǎng)和其它生理參數(shù)的主要因素。對(duì)于酵母，正如對(duì)于多數(shù)微生物一樣，葡萄糖是優(yōu)選的碳源和能量來(lái)源。因此意料之中的是，大體上，但不排除其它可能，自然界中最豐富的單糖葡萄糖是細(xì)胞的主要信使，通過調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄控制水平的基因表達(dá)影響這些生物體生長(zhǎng)和發(fā)育?；蚪M轉(zhuǎn)錄分析揭示了可觀數(shù)量的基因由環(huán)境決定的葡萄糖水平調(diào)節(jié).。在葡萄糖利用中具有已知代謝功錄如低親和性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶的基因以及編碼核糖體蛋白的基因由葡萄糖誘導(dǎo)。另一方面，葡萄糖阻抑一大組基因，包括涉及可選擇的碳源利用、糖異生、乙醛酸循環(huán)、過氧化物酶體功能和呼吸作用的基因。呼吸作用阻抑(Crabtree效應(yīng))僅在少數(shù)酵母菌種(發(fā)酵酵母，Cmbtree陽(yáng)性)如釀酒酵母內(nèi)發(fā)生，而在多數(shù)酵母種內(nèi)葡萄糖不阻抑呼吸作用(Crabtree陰性)。盡管經(jīng)過過去20年對(duì)于葡萄糖阻抑的方法(主要基于酵母釀酒酵母)獲得了廣泛的認(rèn)識(shí)，但是沒有完全了解其真實(shí)機(jī)制，特別是葡萄糖感應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)的上游部分。然而，為了獲得對(duì)本發(fā)明工作更好的理解，以下筒要描述釀酒酵母的碳分解代謝物阻抑的少數(shù)主要參與物。SA^7基因編碼能夠在酵母細(xì)胞高分子量復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的Ser/Thr蛋白激酶。57VF7基因由復(fù)合物內(nèi)部的構(gòu)象改變來(lái)調(diào)節(jié)，所述改變由Snflp調(diào)節(jié)亞基的磷酸化引起。迄今為止鑒定了磷酸化并且因此活化Snflp的3個(gè)上游激酶(Paklp、Elmlp和Tos3p)。其活性對(duì)于去阻抑多種葡萄糖阻抑的基因絕對(duì)是必需的。因此意料之中的是，Snflp或同源物(homologue)在真核生物中普遍是保守的。鋅指蛋白Miglp能夠結(jié)合至多種葡萄糖阻抑的基因的啟動(dòng)子區(qū)。其最有可能通過募集通用阻抑物復(fù)合物Ssn6(Cyc8)-Tuplp來(lái)發(fā)揮作用。Miglp的功能由蛋白激酶Snfl控制，至今沒有關(guān)于直接磷酸化的清楚證據(jù)。Miglp以非磷酸化形式定位于細(xì)胞核中。葡萄糖減少引起Miglp的磷酸化，接著易位至細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)向細(xì)胞添加葡萄糖時(shí)，Miglp迅速地退回細(xì)胞核并且阻抑轉(zhuǎn)錄。Adrlp也屬于鋅指蛋白家族，并且發(fā)現(xiàn)Adrlp是過氧化物酶體蛋白的正效應(yīng)物，而^Z)7T2基因編碼葡萄糖阻抑的醇脫氫酶II。葡萄糖通過依賴環(huán)AMP(cAMP)的蛋白激酶在高cAMP水平下調(diào)^Z)/W的表達(dá)。主要調(diào)節(jié)效應(yīng)出現(xiàn)在mRNA翻譯水平，但同樣觀察到對(duì)轉(zhuǎn)錄和mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)效應(yīng)，這依賴于所分析的釀酒酵母菌抹。對(duì)于很多基因，包括許多涉及呼吸代謝的基因，轉(zhuǎn)錄由Hap2/3/4/5復(fù)合物在非發(fā)酵性(non-fermentable)碳源上活化。對(duì)于少數(shù)涉及呼吸作用的基因如CTC7(編碼異-l-細(xì)胞色素c)和C(9X6(細(xì)胞色素c氧化酶亞基VI)，已經(jīng)確定Snfl是在葡萄糖上生長(zhǎng)之后去阻抑所必需的。當(dāng)葡萄糖存在時(shí)阻抑ZW尸4的轉(zhuǎn)錄，雖然如此無(wú)法證明去阻抑中直接涉及Hap4p或Snflp。Gcrlp是糖酵解基因(例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的主要轉(zhuǎn)錄激活蛋白。Gcrlp連同普遍性轉(zhuǎn)錄因子Raplp是糖酵解基因表達(dá)有關(guān)轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)的主要項(xiàng)目(principleitem),并且對(duì)于高水平轉(zhuǎn)錄絕對(duì)是必要的。野生型和生長(zhǎng)于不同碳源上的釀酒酵母gcW突變體的基因組表達(dá)圖式揭示了53個(gè)開讀框(ORF)，包括糖酵解的基因，如依賴Gcrlp的基因。此處對(duì)一些轉(zhuǎn)錄因子以及Snflp和Miglp途徑的描述應(yīng)給出對(duì)葡萄糖阻抑網(wǎng)絡(luò)中一些參與者的簡(jiǎn)略概述。應(yīng)該注意存在用于葡萄糖阻抑的Snflp途徑之外的更多調(diào)節(jié)循環(huán)。盡管在過去的20年中對(duì)葡萄糖的感應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)獲得了廣泛的認(rèn)識(shí)，主要的問題仍遺留未解葡萄糖信號(hào)的性質(zhì)是什么，以及已知的信號(hào)傳導(dǎo)途徑如何調(diào)節(jié)和整合。有限數(shù)目的酵母種能夠在作為唯一碳源和能量來(lái)源的曱醇上生長(zhǎng)。它們屬于以下四個(gè)屬之一畢赤酵母屬(乃'c/n'a)、漢遜酵母屬(i^raemz/a)、念珠菌屬(Ca"(^fo)和球擬酵母屬(7bnJo;^力，并且共有普遍性曱醇利用途徑，所述普遍性曱醇利用途徑在去阻抑或用甲醇誘導(dǎo)之后表達(dá)(參見1.3.1)。由于這種途徑的起始反應(yīng)在過氧化物酶體內(nèi)區(qū)室化(compartmentalise)，也同樣誘導(dǎo)這些細(xì)胞器。由于過氧化物酶體的強(qiáng)誘導(dǎo)，酵母博伊丁氏念珠菌、i^c/H'aM^/z朋o"ca、巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母頻繁地用于細(xì)胞生物學(xué)中來(lái)研究過氧化物酶體生物發(fā)生和功能。如上所述曱基營(yíng)養(yǎng)酵母共享共同的曱醇利用途徑。第一步是將曱醇氧化成為甲醛和過氧化氫，由醇氧化酶催化(AOX，EC1.1.3.13)。將有毒的11202通過過氧化氬酶的作用分解為氧氣和水。.兩種酶均匯集在過氧化物酶體中。曱醛通過兩個(gè)連續(xù)的脫氬酶反應(yīng)來(lái)氧化或通過與木酮糖-5-磷酸(Xu5P)的縮合在細(xì)胞代謝中同化。通過依賴谷胱甘肽(GSH)的曱醛脫氫酶和甲酸脫氬酶，將曱醛氧化成曱酸并且進(jìn)一步氧化成二氧化碳，所述曱醛脫氬酶和甲酸脫氫酶均位于細(xì)胞溶膠中。將產(chǎn)生在這兩種反應(yīng)中的NADH用于產(chǎn)生在曱醇上生長(zhǎng)的能量?？s合反應(yīng)發(fā)生在過氧化物酶體內(nèi)，并且由上述轉(zhuǎn)酮醇酶二羥丙酮合酶催化。所得的C3化合物二羥丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(GAP)在細(xì)胞溶膠中進(jìn)一步代謝。在DHA的磷酸化之后，果糖-l,6-二磷酸(FBP)通過二羥丙酮磷酸(DHAP)和GAP的醛縮酶反應(yīng)形成。將FBP通過磷酸酶轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸，并且將木酮糖-5-磷酸(Xu5P)在戊糖磷酸途徑中再生。所產(chǎn)生GAP的三分之一進(jìn)入用于細(xì)胞成分合成的糖異生途徑。曱醇利用途徑的關(guān)鍵酶醇氧化酶和甲酸脫氫酶在用曱醇誘導(dǎo)之后以非常高的水平產(chǎn)生。醇氧化酶能夠占可溶蛋白質(zhì)總量的超過30%,二羥丙酮合酶曱酸脫氫酶多至20%。同樣被誘導(dǎo)的過氧化物酶體能夠占細(xì)胞容積的約80%。開發(fā)幾種甲醇利用基因的啟動(dòng)子序列用于重組蛋白產(chǎn)生。其中，這些強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是廣泛使用巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母作為蛋白質(zhì)產(chǎn)生的宿主的主要原因。在多形漢遜酵母和博伊丁氏念珠菌中，一種基因編碼醇氧化酶MOT(甲醇氧化酶，多形漢遜酵母)和^9D7(醇氧化酶，博伊丁氏念珠菌)。兩種基因存在于兩個(gè)畢赤酵母屬的菌種巴斯德畢赤酵母04On和^ao)和PM"/2a"o"ca和爿t/G2，醇利用基因，或MOD7和MOD2)中，并且Aoxlp和Auglp是主要的醇氧化酶。編碼區(qū)的比較揭示了曱基營(yíng)養(yǎng)酵母之間在氨基酸水平73-85%的相似性[1]。巴斯德畢赤酵母^aY7和JOY2的ORF(開讀框)之間的同源性在核苷酸和氨基酸序列水平分別是92%和97%[2，3]。醇氧化酶是八聚體黃素蛋白，每個(gè)亞基含有一個(gè)非共價(jià)結(jié)合FAD或修飾的類似物(mFAD)。AOX翻譯發(fā)生在游離核糖體上，接著在翻譯后輸入到過氧化物酶體中。易位入過氧化物酶體由其C末端盡頭的PTS1(l型過氧化物酶體靶向信號(hào))序列靶向。Aox寡聚體僅在輸入過氧化物酶體基質(zhì)后形成。在博伊丁氏念珠菌和巴斯德畢赤酵母中，無(wú)法在細(xì)胞溶膠中發(fā)現(xiàn)Aox寡聚體，二羥丙酮合酶與之相反，在易位到過氧化物酶體基質(zhì)之前，二羥丙酮合酶在細(xì)胞溶膠中形成二聚體。不僅巴斯德畢赤酵母的醇氧化酶1的啟動(dòng)子序列是感興趣的，還由于廣泛的底物范圍(短到中長(zhǎng)度鏈的不飽和以及飽和伯醇)和在各種反應(yīng)條件下的高穩(wěn)定性，酶也是生物技術(shù)上感興趣的。所有醇氧化酶的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，并且最可能在轉(zhuǎn)錄起始階段。盡管JO\7和JOO受到相似的調(diào)節(jié)(在甘油或葡萄糖上檢測(cè)不到mRNA,在碳饑俄期(carbonstarvationphase)可4全測(cè)到mRNA,在曱醇上大量的mRNA)，但它們的5-側(cè)翼區(qū)不共有顯著的同源性[2,4]。每個(gè)AOX基因座在相對(duì)于初級(jí)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置-43呈現(xiàn)推定的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(TATAAA;戈德堡-霍格內(nèi)斯(Goldberg-Hogness)或TATA框)。兩種巴斯德畢赤酵母AOXmRNA前導(dǎo)序列均非常富含A殘基，并且通常對(duì)于酵母是長(zhǎng)的(對(duì)于AOX1為115核苷酸(nt)和對(duì)于AOX2為160nt)。ATG起始密碼子周圍的翻譯起始區(qū)(Kozak序列爿QA7:CGAAACGATGGCT，GAGAAAAATGGCC)與之前描述的釀酒酵母和高等真核生物的共有序列一致。巴斯德畢赤酵母和PAfeAa"o//ca中第二醇氧化酶基因的生理學(xué)作用仍不清楚。在這些菌抹中爿OY7或爿C/G/的破壞引起嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷(所謂的曱醇利用緩慢(methanolutilizationslow;MutS)表型)，而aox2和aug2菌抹展現(xiàn)出相當(dāng)于野生型菌林的生長(zhǎng)速率。在^^^/^20//中觀察到9種多形式的醇氧化酶，表現(xiàn)出2種基因產(chǎn)物Auglp和Aug2p的隨機(jī)寡聚化。^f/G7和^t/G2受到區(qū)別性的調(diào)節(jié)在碳饑餓和低曱醇濃度僅能檢測(cè)到Auglp,而隨著曱醇濃度的增加，Aug2p對(duì)Auglp的比率增加。隨著Aug2p含量的提高向八聚體的轉(zhuǎn)變是由于^t/G2表達(dá)的增加，所述表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。Auglp和Aug2p的兩種同型八聚體(homooctamer)對(duì)曱醇的Km值分別是大約0.56和5.6mM。連同破壞AUG1引起在低曱醇濃度生長(zhǎng)缺陷的發(fā)現(xiàn)[5]，這些結(jié)果說明當(dāng)在高曱醇濃度生長(zhǎng)時(shí)，」^/(^對(duì)于戶#"/20"0//￡^是有利條件。在巴斯德畢赤酵母中，既沒有進(jìn)一步詳細(xì)地分析JO￥2基因的作用，也沒有找出對(duì)于保有(possessing)第二醇氧化酶基因的有利條件。由于實(shí)驗(yàn)室條件僅代表自由生活的微生物所面對(duì)的條件非常小的部分，在自然界中應(yīng)該存在爿OO基因?qū)τ诎退沟庐叧嘟湍妇哂羞x擇的重要性的情況。博伊丁氏念珠菌JOZ)J和多形漢遜酵母MQZ的表達(dá)在生長(zhǎng)于作為唯一碳源的葡萄糖或乙醇上時(shí)被嚴(yán)格地阻抑，在甘油上時(shí)去阻抑，并且在甲醇上強(qiáng)烈地誘導(dǎo)。當(dāng)葡萄糖和甲醇存在于培養(yǎng)基中時(shí)，也阻抑這兩種酶的表達(dá)。如果甘油存在，曱醇能夠誘導(dǎo)基因表達(dá)。在碳饑餓時(shí)去阻抑JOD7和的轉(zhuǎn)錄而當(dāng)乙醇存在時(shí)被阻抑[6-9]。兩種截然不同的調(diào)節(jié)機(jī)制負(fù)責(zé)乙醇或葡萄糖對(duì)曱醇利用代謝的阻抑[IO，ll]。巴斯德畢赤酵母中的情況顯著不同當(dāng)葡萄糖、乙醇或甘油存在于培養(yǎng)基(以非生長(zhǎng)限制(non-growthlimiting)的濃度)中時(shí)阻抑^OY7。碳饑餓時(shí)的去阻抑和曱醇的誘導(dǎo)與JOZ)7和MO^相似。爿0\7表達(dá)去阻抑的碳源是例如山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖和丙氨酸[12]。從甲醇到阻抑碳源如葡萄糖或乙醇的轉(zhuǎn)換之后，在適應(yīng)新碳源期間過氧化物酶體在幾小時(shí)內(nèi)降解。當(dāng)適應(yīng)葡萄糖或乙醇時(shí)，酵母泡中的蛋白水解降解再次遵循兩種截然不同的機(jī)制，分別稱為小自噬或大自噬。如上所述，甲基營(yíng)養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母廣泛地用于重組蛋白的產(chǎn)生。到目前為止，多于500種蛋白質(zhì)已在巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生。少數(shù)特征推動(dòng)了它們的發(fā)展，所述特征帶給它們?cè)谥亟M表達(dá)宿主之中的優(yōu)勢(shì)l)它們共有酵母在遺傳操作和培養(yǎng)技術(shù)(實(shí)驗(yàn)室的和大規(guī)模的)方面的普遍優(yōu)勢(shì)；2)生長(zhǎng)至極高細(xì)胞密度的能力；和3)重組蛋白(分泌的或胞內(nèi)的)的高水平產(chǎn)生。將編碼曱醇利用途徑反應(yīng)的基因的強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子開發(fā)用于重組蛋白產(chǎn)生。最廣泛使用的分別是巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母的醇氧化酶基因爿aw和MO^的啟動(dòng)子區(qū)。但也將曱醇利用途徑基因的其它啟動(dòng)子區(qū)用以驅(qū)動(dòng)重組蛋白產(chǎn)生多形漢遜酵母和博伊丁氏念珠菌中的FMD(曱酸脫氬酶)和(二羥丙酮合酶)啟動(dòng)子，以及巴斯德畢赤酵母中的FZX)7(甲醛脫氫酶)啟動(dòng)子。后者在曱胺作為唯一氮源及葡萄糖作為碳源時(shí)也能夠誘導(dǎo)。用于外源基因組成性表達(dá)的啟動(dòng)子也是可用的巴斯德畢赤酵母中的GAP(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動(dòng)子元件和多形漢遜酵母中的戶M47(編碼質(zhì)膜H十-腺苷三磷酸酶)啟動(dòng)子。為巴斯德畢赤酵母(例如7//W)和多形漢遜酵母(例如丄五t/2和WL43)開發(fā)了幾種營(yíng)養(yǎng)缺陷型的宿主菌抹/標(biāo)記基因組合。顯性選擇標(biāo)記也是可用的(例如ZeocinTM、G418抗性)?；蛘系綍趸鶢I(yíng)養(yǎng)酵母中主要(如果非排外)通過同源整合完成。攜帶ARS(自主復(fù)制序列)區(qū)的載體也是可用的，但是如果將選擇壓力釋放，它們通常十分不穩(wěn)定，這導(dǎo)致它們有限的技術(shù)應(yīng)用。在巴斯德畢赤酵母中，將外源基因位點(diǎn)特異整合至JOX7或/7/W基因座。其它可能的整合位點(diǎn)是例如GAP基因座(用于GAP表達(dá))或任何其它選擇標(biāo)記基因座(例如^D五7、C/7L43、^<^/和丄￡^/2)。在多形漢遜酵母中表達(dá)盒以頭尾排列隨機(jī)整合，導(dǎo)致具有高拷貝數(shù)(多至100)的有絲分裂穩(wěn)定的整合體。然而，高拷貝數(shù)通常不產(chǎn)生高水平表達(dá)。具有強(qiáng)烈影響的額外因素是整合盒的結(jié)構(gòu)、待表達(dá)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)以及整合位點(diǎn)。特別是整合盒結(jié)構(gòu)對(duì)于基因劑量的效果具有強(qiáng)烈的影響。如何最優(yōu)化表達(dá)盒和基因劑量的進(jìn)一步討論在[13，14]中給出。甲基營(yíng)養(yǎng)酵母屬于Crabtree陰性酵母組，因此當(dāng)生長(zhǎng)于有氧條件下時(shí)，乙醇產(chǎn)生在非常低的水平發(fā)生。由于這個(gè)事實(shí)，這些酵母能夠在發(fā)酵罐培養(yǎng)(fermenterculture)中生長(zhǎng)至非常高的細(xì)胞密度得到高產(chǎn)物產(chǎn)率。當(dāng)生物反應(yīng)器中的曱醇濃度在生長(zhǎng)限制范圍(growth-limitingsphere)時(shí)，能夠?qū)(M7驅(qū)動(dòng)蛋白的產(chǎn)生進(jìn)一步增加3-5倍。在標(biāo)準(zhǔn)條件下巴斯德畢赤酵母僅分泌少量?jī)?nèi)源蛋白的事實(shí)使每種分泌的重組蛋白都在培養(yǎng)基中最豐富。分泌能夠作為下游純化方法中重要的第一步。對(duì)于蛋白質(zhì)分泌，釀酒酵母MFal(交配因子a)前原前導(dǎo)序列(preproleadersequence)和源自酸性磷酸酶(尸/fO)的序列廣泛用于巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母中。在一些情況下，使用具有天然分泌信號(hào)的植物、真菌和哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)獲得充分的分泌。如上所述，酵母能夠進(jìn)行翻譯后修飾如二硫鍵形成、信號(hào)序列加工(例如MFal的前原前導(dǎo)序列)、脂質(zhì)添加以及N-和O-連接的糖基化。雖然在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生由多種糖組成的非常復(fù)雜的N-和O-連接的寡糖結(jié)構(gòu)(例如N-乙酰氨基葡糖、半乳糖和唾液酸)，但是多數(shù)酵母產(chǎn)生缺乏一些糖本體(sugarentity)如半乳糖或唾液酸的高甘露糖型結(jié)構(gòu)。這些非哺乳動(dòng)物結(jié)構(gòu)能夠?qū)е轮委煈?yīng)用上嚴(yán)重的問題，主要由于它們的高潛在免疫原性。與釀酒酵母相反，在多形漢遜酵母和巴斯德畢赤酵母中，超甘露糖化(hypermannosylation)較少，并且無(wú)超免疫原性的末端a-l,3-連接的甘露糖并入N-連接寡糖。為了克服免疫原性的問題(和一些其它問題如在血流中的低穩(wěn)定性)，已經(jīng)開始努力將源自酵母的寡糖結(jié)構(gòu)人源化，如最近的文獻(xiàn)揭示的，特別是在巴斯德畢赤酵母中。迄今為止，絕大多數(shù)研究問題和商業(yè)方法依賴于公知的酵母釀酒酵母。由于對(duì)非常規(guī)酵母日益增長(zhǎng)的認(rèn)識(shí)，和大規(guī)模發(fā)酵和糖基化問題方面明顯的優(yōu)勢(shì)，多形漢遜酵母和巴斯德畢赤酵母迅速成為優(yōu)選的酵母。工業(yè)上實(shí)施的幾種生產(chǎn)方法強(qiáng)調(diào)了所述事實(shí)。在WO02/081650中，公開對(duì)^QA7啟動(dòng)子區(qū)的鑒定，其可以用于突變型^aw啟動(dòng)子的構(gòu)建。因?yàn)槠渲泄_的爿aw啟動(dòng)子缺失的序列區(qū)非常長(zhǎng)，能夠觀察到截然不同的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列的累積效果而非單一效果。然而，這種方法將無(wú)法開發(fā)強(qiáng)烈增強(qiáng)的啟動(dòng)子。特別當(dāng)通過缺失或復(fù)制原始啟動(dòng)子的部分構(gòu)建具有增強(qiáng)特性的新啟動(dòng)子時(shí)，需要準(zhǔn)確的關(guān)于調(diào)節(jié)序列范圍的知識(shí)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有增強(qiáng)性質(zhì)的改進(jìn)的^aw啟動(dòng)子，以促進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)生中的下游加工，從而增加時(shí)空產(chǎn)率(time-space-yield)并且?guī)椭嵘a(chǎn)物質(zhì)量。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供載體或宿主菌林中的強(qiáng)JOZ7啟動(dòng)子，所述載體或宿主菌株部分或全部將遭遇葡萄糖阻抑。優(yōu)勢(shì)是具有在高葡萄糖濃度存在下驅(qū)動(dòng)強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供^OX啟動(dòng)子，所述」OA7啟動(dòng)子允許使用減少量的曱醇或不用曱醇來(lái)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這種啟動(dòng)子將在工業(yè)生產(chǎn)方法上具有重要的影響。由于安全問題使用曱醇作為誘導(dǎo)物的生產(chǎn)植物需要特殊設(shè)備。這與巴斯德畢赤酵母應(yīng)用于多種較低特殊性的生產(chǎn)植物中矛盾。另外，曱醇存在下的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性能夠阻礙基于曱醇的蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)。這對(duì)于生產(chǎn)強(qiáng)力的工業(yè)蛋白質(zhì)較不關(guān)鍵，但是對(duì)于例如分泌的治療蛋白卻成為主要問題。這種啟動(dòng)子的構(gòu)建需要野生型巴斯德畢赤酵母啟動(dòng)子的具體部分(例如調(diào)節(jié)元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))的知識(shí)，當(dāng)將所述^QA7啟動(dòng)子以某種方式突變時(shí)，顯示對(duì)表達(dá)行為的影響。所以本發(fā)明的一個(gè)目的是鑒定這些部分并且因此提供創(chuàng)造具有增強(qiáng)特征的爿QA7啟動(dòng)子的方法。因此本發(fā)明涉及野生型巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1040Y7)啟動(dòng)子(SEQIDNo.l)的突變巴斯德畢赤酵母JOZ/啟動(dòng)子，包含選自下組的至少一種突變a)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS),b)SeqIDNo.1的核苦酸170至235(-784至-719)、核苷酸170至191(-784至-763)、核苷酸192至213(-762至-741)、核苷酸192至210(-762至-744)、核苷酸207至209(-747至-745)、核苷酸214至235(-740至-719)、核苷酸304至350(-650至-604)、核香酸364至393(-590至-561)、核苷酸434至508(-520至一446)、核香酸509至551(-445至-403)、核苦酸552至560(-402至-394)、核苦酸585至617(-369至-337)、核苷酸621至660(-333至-294)、核苷酸625至683(-329至-271)、核苷酸736至741(-218至-213)、核苷酸737至738(-217至畫216)、核苷酸726至755(-228至-199)、核苷酸784至800(-170至-154)或核香酸823至861(-131至-93),和它們的組合。全部的描述中括號(hào)內(nèi)的(負(fù))數(shù)反映啟動(dòng)子相對(duì)于翻譯起始密碼子(例如ATG)的相應(yīng)位置。例如，包含NxGACTATGNy的核酸序列中"ATG"的"A"對(duì)應(yīng)于位置+1，而"ATG"的"A"之前的"T"相對(duì)于位置-1。根據(jù)本發(fā)明，突變^QA7啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和/或以上所述范圍的核酸序列之一中包含至少一種突變。已證明啟動(dòng)子的這些區(qū)域特別適合于修飾所述啟動(dòng)子從而改變其特征。當(dāng)然也可以引入上述突變的組合以增強(qiáng)JOW啟動(dòng)子的特性(例如選自a)的兩種TFBS突變，一種選自a)的TFBS突變和一種選自b)的突變，一種選自a)的突變和兩種選自b)的突變)。例如，TFBS的突變可以和SeqIDNo.1的核苷酸737至738(-217至-216)和/或核苷酸207至209(-747至-745)內(nèi)的突變結(jié)合。巴斯德畢赤酵母中在^ttY7啟動(dòng)子控制下的蛋白質(zhì)表達(dá)一般通過添加曱醇來(lái)誘導(dǎo)并且由培養(yǎng)基中葡萄糖的存在來(lái)抑制。為了增強(qiáng)或減少所述培養(yǎng)基添加劑對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，啟動(dòng)子優(yōu)選在上述啟動(dòng)子區(qū)突變。突變^aw啟動(dòng)子產(chǎn)生感興趣的蛋白的有效性(e伍cacy)依賴于整合到宿主染色體上載體的量(即拷貝)改變。特別地證實(shí)了多拷貝菌林展現(xiàn)出增強(qiáng)的啟動(dòng)子效果。由于畢赤酵母屬菌株的抗生素抗性依賴于整合到所述宿主染色體中抗生素抗性盒(引入到宿主的載體優(yōu)選包含抗生素抗性盒，以使宿主能夠在包含抗生素作為選擇標(biāo)記的培養(yǎng)基上沖生長(zhǎng))的數(shù)目，多拷貝菌抹可以通過在選擇性瓊脂平板上施用增加的抗生素濃度(范圍在10jig/ml至10mg/ml內(nèi)，優(yōu)選50}xg/ml至1000pg/ml;依賴于所用抗生素；例如，遺傳霉素0.1至10mg/ml，優(yōu)選0.2至5mg/ml,特別是0.25至4mg/ml，zeocin:10至5000jag/ml,優(yōu)選50至3000ng/ml,特別是100至2000pg/ml)以增加選擇壓力(例如[14];Scorer,C.A.etal.(1994)Bio/Technology12:181-184)。然而，發(fā)現(xiàn)含有抗生素抗性盒多重性的細(xì)胞生長(zhǎng)不僅僅依賴于抗生素的濃度，而且還依賴于時(shí)間。因此，相較于單拷貝菌抹，在含有相同濃度抗生素的培養(yǎng)基上多拷貝菌株能夠在較短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)成可檢測(cè)的菌落。這種特性使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在單拷貝菌抹開始生長(zhǎng)之前檢測(cè)和分離多拷貝菌抹。例如，含有一個(gè)單拷貝抗生素抗性盒的菌抹在72小時(shí)于瓊脂平板上生長(zhǎng)成可檢測(cè)的菌林，而含有多于一個(gè)拷貝所述盒的相同的菌抹在24至48小時(shí)生長(zhǎng)成相同的大小。特別是攜帶具有突變的爿OW啟動(dòng)子的多拷貝菌抹顯示出令人驚訝的增強(qiáng)的表達(dá)率(expressionrate),所述突變?cè)诤丝嗨?94至723(-260至-231)內(nèi)和核香酸737至738(-217至-216)內(nèi)。為了增加宿主在曱醇存在下的蛋白質(zhì)表達(dá)效率，優(yōu)選將」aW啟動(dòng)子(SEQIDNo.l)的核香酸170至235(-784至-719)突變。假設(shè)帶有突變爿aY7啟動(dòng)子的質(zhì)粒僅整合到宿主染色體/基因組中一次(單拷貝突變)，在這個(gè)區(qū)域的突變將蛋白質(zhì)表達(dá)增加至野生型』OY7啟動(dòng)子的120至130%。然而，在所有其它上述區(qū)域內(nèi)的突變減少或不影響曱醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的功效。與此相反，在野生型爿ao啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)的突變(如上所列)一依賴于所述突變一在去阻抑條件下導(dǎo)致增加和減少的蛋白質(zhì)表達(dá)(例如參見表13，實(shí)施例1)。然而，含有多于一個(gè)拷貝的突變啟動(dòng)子的重組菌抹導(dǎo)致在去阻抑和曱醇誘導(dǎo)條件下具有增強(qiáng)活性的菌林(多拷貝菌抹，例如參見圖7,實(shí)施例2)。具體而言，在去阻抑條件下和/或在甲醇誘導(dǎo)下，含有以下突變的多拷貝菌抹相較于在野生型JOA7啟動(dòng)子控制下的蛋白質(zhì)表達(dá)顯示增加的表達(dá)所述突變?cè)赟EQIDNo.1的核苷酸694和723內(nèi)(d6),在SEQIDNo.1的核苷酸694和723(-260和-231)內(nèi)(d6)，在SEQIDNo.1的核苷酸694和723(-260和-231)和核香酸304和350(-650和-604)內(nèi)(d2d6);在TFBS內(nèi)，特別是在Rapl、Gcrl、QA-1F、Hsf—1、Adrl、Hsf_2、MatlMC、abaA和Hap2345內(nèi)。在去阻抑條件下，這些多拷貝菌抹中的一些顯示出相較于野生型啟動(dòng)子控制下的表達(dá)增加大約10倍的蛋白質(zhì)表達(dá)。曱醇作為誘導(dǎo)物存在下使用根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子時(shí)，表達(dá)效率增強(qiáng)多于5倍。因此，這些突變，特別是當(dāng)以多拷貝形式存在于宿主中時(shí)是蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)選使用的。兩種或兩種以上上述突變的組合可以進(jìn)一步增強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)度(參見例如圖7,實(shí)施例2)。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可以用實(shí)驗(yàn)方法鑒定(例如通過遷移率變動(dòng)(mobilityshift)或足跡分析(footprintanalysis))或通過與已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的序列比較(例如通過計(jì)算機(jī)分析，[15])。影響所述啟動(dòng)子強(qiáng)度和特征的啟動(dòng)子區(qū)的知識(shí)可用以設(shè)計(jì)具有截然不同性質(zhì)的啟動(dòng)子(在去阻抑條件下的高蛋白質(zhì)表達(dá)和/或在曱醇存在下的高蛋白質(zhì)表達(dá))。此外如果將這些突變啟動(dòng)子一倍或多倍地整合到宿主的基因組中，這些性質(zhì)可能增強(qiáng)或改變(例如參見實(shí)施例i至3)。然而，在一些情況下，應(yīng)該降低而不是增加啟動(dòng)子活性。特別是共表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白如激酶、磷酸化酶和輔助蛋白例如蛋白伴侶、蛋白質(zhì)二石克鍵異構(gòu)酶、順反異構(gòu)酶、折疊酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和蛋白酶，在許多情況下必需低于主要產(chǎn)物，所述調(diào)節(jié)蛋白可能在野生型啟動(dòng)子或根據(jù)本發(fā)明的增強(qiáng)啟動(dòng)子下由細(xì)胞產(chǎn)生。特別地，證實(shí)了兩種不同產(chǎn)物(例如輔助蛋白和主要產(chǎn)物)的組合表達(dá)分別在活性增加的啟動(dòng)子和活性減少的」QA7啟動(dòng)子(與野生型活性比較)的控制下是有利的，因?yàn)橹饕痛渭?jí)產(chǎn)物的表達(dá)率相差甚至比使用野生型^QA7啟動(dòng)子更多。優(yōu)選通過缺失激活子結(jié)合位點(diǎn)例如HSF或HAP或通過將阻抑物結(jié)合位點(diǎn)插入到野生型啟動(dòng)子中來(lái)獲得減少的表達(dá)。因此，使用具有減少的活性的爿OW啟動(dòng)子防止細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)機(jī)構(gòu)(proteinexpressionmachinery)的過載，其結(jié)果將是主要產(chǎn)物的產(chǎn)量減少。例如，BessettePH等(PNASUSA(1999)96:13703-13708)可顯示可以通過硫氧還蛋白的共表達(dá)來(lái)顯著增加活性多肽的表達(dá)。才艮據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，啟動(dòng)子還包含SeqIDNo.1的核苷酸694至723(-260至-231)和/或核香酸729至763(-225至-191)內(nèi)的突變。影響這些核苷酸范圍的突變與上述突變的結(jié)合導(dǎo)致更加增強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。例如，在去阻抑和誘導(dǎo)條件下，與相同條件下野生型啟動(dòng)子控制的表達(dá)相比，實(shí)施SeqIDNo.1的核普酸694至723(-260至-231)和核苷酸737至738(-217至-216)的雙突變導(dǎo)致啟動(dòng)子顯示較高的表達(dá)水平。當(dāng)將包含啟動(dòng)子的核酸以多于一個(gè)拷貝引入細(xì)胞時(shí)(產(chǎn)生多拷貝克隆)，可增強(qiáng)這種雙突變的效果。突變優(yōu)選是缺失、取代、插入、倒位和/或倍增(multiplication)。為了改變巴斯德畢赤酵母野生型J(9」n啟動(dòng)子的特性，幾種突變類型是可能的?？梢詫鲜鰠^(qū)域(轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)、SeqIDNo.l的核苷酸170至235(-784至-719)、170至191(-784至-763)、192至213(-762至-741)、192至210(-762至-744)、207至209(-747至-745)、214至235(-740至畫719)、304至350(-650至-604)、364至393(-5卯至-561)、434至508(-520至_446)、509至551(-445至-403)、552至560(-402至-394)、585至617(-369至扁337)、621至660(-333至-294)、625至683(-329至-271)、694至723(-260至-231)、729至763(-225至畫191)、736至741(-218至-213)、737至738(-217至畫216)、726至755(-228至-199)、784至800(-170至-154)或823至861(-131至-93))的啟動(dòng)子延伸(stretch)部分或全部缺失、部分或全部用其它核苷酸或核酸序列取代、通過插入單核苷酸或核酸序列破壞、部分或全部倒位或倍增。所有這些突變導(dǎo)致啟動(dòng)子活性的改變，因?yàn)樗鐾蛔冇绊懡Y(jié)構(gòu)特征和/或例如轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別/結(jié)合部分。然而，這些改變可能導(dǎo)致啟動(dòng)子相較于野生型啟動(dòng)子增加或減少的活性。眾所周知在現(xiàn)有技術(shù)中倍增/重復(fù)特定核酸延伸可能增加啟動(dòng)子活性。許多真核啟動(dòng)子特別是酵母啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，涉及結(jié)合在啟動(dòng)子內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄因子之間的多種相互作用。多種位點(diǎn)對(duì)于甚至最小的順式作用元件的功能是必需的。在酵母細(xì)胞中，上游激活子序列(UAS)對(duì)于轉(zhuǎn)錄是必需的。它們以任一方向并在相對(duì)于TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可變的距離上起作用，但是與高等真核生物中的增強(qiáng)子相反，它們必需在這些h出元件(basaldement)的下游。UAS是幾種轉(zhuǎn)錄激活子的靶物。酵母細(xì)胞中多數(shù)阻抑現(xiàn)象得自轉(zhuǎn)錄因子的失活和缺失。然而，也能夠鑒定一些負(fù)調(diào)節(jié)位點(diǎn)(上游阻抑序列(URS))?；诎退沟庐叧嘟湍竈ao啟動(dòng)子的缺失分析，發(fā)現(xiàn)三種調(diào)節(jié)區(qū)，兩種負(fù)作用區(qū)(URS1和URS2)和一種正作用結(jié)構(gòu)域(UAS)[3]。對(duì)于多形漢遜酵母MOZ啟動(dòng)子，還描述了兩種上游激活序列(UAS1和UAS2)和一種阻抑物結(jié)合位點(diǎn)(URS1)[8]。相應(yīng)序列還能夠在^aY7啟動(dòng)子上鑒定(核苷酸585至614(-369至-340)和725至756(-229至-198),其顯示與爿OX2UAS的相似性[3],以及核苷酸622至656(-332至-298)[8])。這些核酸延伸的倍增(2、3、4、5、6或7倍的UAS)可能導(dǎo)致具有增強(qiáng)強(qiáng)度的啟動(dòng)子，產(chǎn)生更加有力的蛋白表達(dá)。因此構(gòu)建包含多uas的啟動(dòng)子，優(yōu)選包含與爿ao和mo%uas相似的上述序列區(qū)，或其它多序列延伸(例如上述范圍的核酸序列)也落入本發(fā)明的范圍，并且認(rèn)為是優(yōu)選的實(shí)施方案。激活序列通常在啟動(dòng)子的幾百石咸基對(duì)之內(nèi)。例如，多數(shù)激活序列在增強(qiáng)的啟動(dòng)子的大約200至400堿基對(duì)之內(nèi)。啟動(dòng)子的更上游通常含有另外的增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域才支術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition),J.SambrookandD.Russell,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress)引入AOX1啟動(dòng)子的至少一種突變。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)選自下組Hapl、Hsf、Hap234、abaA、Stre、Rapl、Adrl、MatlMC、Gcrl和QA陽(yáng)IF。這些TFBS的至少一種的突變導(dǎo)致具有不同的特征的突變啟動(dòng)子(參見實(shí)施例2)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)Hapl包含SeqIDNo.1的核苷酸54(-900)至58(-896)，Hsf包含SeqIDNo.1的核苷酸142(-812)至149(-805)和517(-437)至524(-430)，Hap234包含S叫IDNo.1的核苷酸196(-758)至200(-754)、206(-748)至210(國(guó)744)和668(-286)至672(-282),abaA包含SeqIDNo.1的核苦酸219(-735)至224(-730),Stre包含SeqIDNo.1的核苷酸281(-673)至285(-669)，Rapl包含SeqIDNo.1的核香酸335(-619)至339(-615),Adrl包含SeqIDNo.1的核苦酸371(-583)至377(-577)，MatlMC包含SeqIDNo.l的核苷酸683(-271)至687(-267)，Gcrl包含SeqIDNo.l的核苷酸702(-252)至706(-248)和QA-1F包含SeqIDNo.1的核苦酸747(-207)至761(-193)。這些TFBS可以用實(shí)驗(yàn)方法或通過使用計(jì)算機(jī)程序的輔助與其它啟動(dòng)子(例如真核生物的啟動(dòng)子)已知TFBS的比較來(lái)鑒定(例如參見實(shí)施例1)。表2提供突變JOY7啟動(dòng)子對(duì)表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的影響的總結(jié)(與野生型活性相比)。表2:野生型^aW啟動(dòng)子突變體對(duì)表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>相較于野生型爿aw啟動(dòng)子的表達(dá)率-減少，+增加本發(fā)明另一個(gè)方面涉及核酸分子，所述核酸分子包含根據(jù)本發(fā)明的突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶i(joxo啟動(dòng)子和編碼蛋白質(zhì)、肽的核酸或功能性核酸，其中啟動(dòng)子和所述核酸可操作地連接在一起。突變JOX/啟動(dòng)子能夠連接至編碼蛋白質(zhì)(例如酶)、肽(例如激素)或功能性核酸(例如siRNA)的基因。將所得核酸片段引入生物體中時(shí)，所述生物體優(yōu)選酵母，特別巴斯德畢赤酵母菌株，所述核酸片段可用于表達(dá)例如蛋白質(zhì)。所述核酸分子的構(gòu)建對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，并且能夠使用標(biāo)準(zhǔn)分子生4勿學(xué)方、法(仿J^口MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition),J.SambrookandD.Russell,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress;manual"PichiaExpressionKit",InvitrogenCorp.)進(jìn)行。"可操作地連接，，指將第一序列置于足夠接近第二序列的位置，從而使第一序列能夠?qū)Φ诙蛄谢蛟诘诙蛄锌刂葡碌膮^(qū)域施加影響。例如，可將啟動(dòng)子可操作地與基因連接從而使基因在啟動(dòng)子控制下表達(dá)，其通常連接至基因的5'。通常核心啟動(dòng)子將在自翻譯起始位點(diǎn)的幾百堿基對(duì)之內(nèi)。大約30bp下游通常存在下游啟動(dòng)子元件。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及載體，所述載體包含^f艮據(jù)本發(fā)明的突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶i(^aw)啟動(dòng)子或如上所述的核酸分子。為了將突變啟動(dòng)子引入到宿主中，將所述啟動(dòng)子任選地與編碼蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的核酸可操作地連接，所述宿主優(yōu)選是甲基營(yíng)養(yǎng)酵母菌株(例如巴斯德畢赤酵母菌抹)，所述啟動(dòng)子必須在載體中提供，其可能用于轉(zhuǎn)化所述宿主。例如，所述載體可以是酵母附加體質(zhì)粒(YEp)、酵母整合型質(zhì)粒(YIp)或酵母人工染色體。這種載體通常包含用于載體在大腸桿菌中繁殖的復(fù)制起點(diǎn)(如果需要在微生物宿主中擴(kuò)增)和選擇標(biāo)記、用于重組蛋白在酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子以及用于酵母的選擇標(biāo)記。非整合型載體還包含自主復(fù)制序列(ARS)，所述自主復(fù)制序列確保細(xì)胞中載體的穩(wěn)定性(例如Myers,A.M.，etal.(1986)Gene45:299-310)。不含有AR序列的整合型載體包含與基因組區(qū)域同源的序列區(qū)?？蛇x地，可將線性DNA,例如源自PCR的線性DNA用于轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及細(xì)胞，所述細(xì)胞包含如本文所公開的至少一種突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶l040Y7)啟動(dòng)子、至少一種核酸片段或至少一種載體?？赏ㄟ^例如電穿孔將含有突變XOA7啟動(dòng)子的核酸分子(例如載體，其中將啟動(dòng)子可操作地與編碼蛋白質(zhì)的核酸連接)引入宿主中。在以單拷貝或多拷貝引入所述宿主中之后，或作為單拷貝或多拷貝自主復(fù)制質(zhì)粒存在于細(xì)胞中之后，將所述核酸分子整合到染色體中。如果使用幾種突變啟動(dòng)子，能夠?qū)⑺鼈內(nèi)颗c一種單獨(dú)的基因(所述基因編碼蛋白質(zhì)或功能性核酸(例如核酶、反義RNA等)、同樣的蛋白質(zhì)或不同的蛋白質(zhì)(例如將一種啟動(dòng)子變體與選擇標(biāo)記連接并且將另一種突變啟動(dòng)子與應(yīng)該表達(dá)的另一種蛋白連接))連接。因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選產(chǎn)生單拷貝菌抹，其包含與編碼蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的核酸可操作連接的一個(gè)拷貝爿OJW啟動(dòng)子；以及多拷貝菌抹，其包含與編碼蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的核酸可操作連接的多于一個(gè)拷貝，優(yōu)選至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20拷貝的爿QA7啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，具體為酵母細(xì)胞，優(yōu)選甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞。優(yōu)選地，曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬，特別巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。可以將^aY7啟動(dòng)子及由其突變的變體功能性地(flinctionally)引入非常多種不同的酵母細(xì)胞中，包括曱基營(yíng)養(yǎng)(例如巴斯德畢赤酵母)和非甲基營(yíng)養(yǎng)(例如釀酒酵母)細(xì)胞。啟動(dòng)子，特別是v40W和MOX啟動(dòng)子向其它生物體的可轉(zhuǎn)移性對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。盡管底物特異性和一些調(diào)節(jié)特征在不同酵母(例如巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母和釀酒酵母)之中有所區(qū)另"但已證明了外源啟動(dòng)子的識(shí)另iJ(例如Raschke，W.C.，etal.，Gene,1996.177:163-7;Pereim,GG.andC.P.Hollenberg,EurJBiochem,1996.238:181-91)。例如，在釀酒酵母中識(shí)別多形漢遜酵母MC《啟動(dòng)子，在葡萄糖存在下阻抑并且在碳源限制時(shí)去阻抑。類似地，可將^aw啟動(dòng)子用于多形漢遜酵母中，并且按照與AfO^啟動(dòng)子相同的方式調(diào)節(jié)。與^GA7啟動(dòng)子緊密相關(guān)的ZZ4/啟動(dòng)子也能夠成功地用在釀酒酵母中。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于表達(dá)所選蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄為功能性RNA的試劑盒，所述試劑盒包含i)如上所定義的載體，和ii)能夠在根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子控制下表達(dá)所述蛋白質(zhì)或功能性RNA的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的載體能夠在用于表達(dá)所選蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄功能性RNA(例如核酶、反義RNA、RNAi)的試劑盒中使用。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞。優(yōu)選的曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬，特別巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于在細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白、肽或功能性核酸的方法，所述方法包含以下步驟-提供載體或核酸分子，其包含根據(jù)本發(fā)明的^aw啟動(dòng)子和編碼蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的核酸，將所述啟動(dòng)子與所述核酸可操作地連接，-用所述載體或所述核酸分子轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞，-在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，-任選地誘導(dǎo)所述蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的表達(dá)和-分離所述表達(dá)的蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞。優(yōu)選地，曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬，特別巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及才艮據(jù)本發(fā)明的核酸分子、載體或細(xì)胞用于表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的用途。將根據(jù)本發(fā)明的核酸分子、載體或細(xì)胞用于表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸時(shí)，選擇滿足表達(dá)所需條件的合適^aw啟動(dòng)子是有利的(例如在去阻抑條件下(=不向培養(yǎng)基添加葡萄糖)或在曱醇誘導(dǎo)條件下的高表達(dá)或組成性表達(dá))。合適的突變XO\7啟動(dòng)子可在表2幫助下選擇。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于分離超表達(dá)克隆(superexpressionclone)的方法，所述方法包含以下步驟a)將包含突變曱醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核酸分子或載體引入細(xì)胞，所述甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子優(yōu)選^QA7啟動(dòng)子，其與編碼蛋白質(zhì)或功能性核酸的核酸和抗性標(biāo)記基因可操作地連接，b)將步驟a)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含合適的選擇標(biāo)記、非阻抑碳源和曱醇用于在誘導(dǎo)條件下超表達(dá)克隆的選擇性生長(zhǎng)；或所述培養(yǎng)基包含合適的選擇標(biāo)記和非阻抑碳源，而不含曱醇用于超表達(dá)克隆在去阻抑條件下的選擇性生長(zhǎng)，c)在所述培養(yǎng)基上培育來(lái)自步驟b)的細(xì)胞，d)分離獲得自步驟C)的細(xì)胞的菌落和e)通過測(cè)定所述細(xì)胞的表達(dá)率檢測(cè)超表達(dá)克隆。超或高表達(dá)克隆的構(gòu)建需要使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠分離這些克隆的方法，所述克隆含有包含突變曱醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體或核酸。本文提供這樣的方法。所述方法的第一步是將包含啟動(dòng)子的核酸(例如載體)引入合適的細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)所述啟動(dòng)子。啟動(dòng)子本身可以通過遺傳工程或通過化學(xué)(例如亞辟u酸氬鹽、亞硝酸鹽、延胡索酸、肼)或物理(例如輻射，特別是UV輻射)誘變來(lái)進(jìn)行突變。在進(jìn)一步的步驟中將含有所述突變啟動(dòng)子的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基，優(yōu)選直接或經(jīng)由液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含抗生素(例如Zeocin)和山梨糖醇(或另外的非阻抑碳源，例如[12]所述，特別是丙氨酸、甘露糖醇或海藻糖)用于在去阻抑條件下高表達(dá)克隆的生長(zhǎng)，并且另外包含甲醇，如果期望發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)條件下的高表達(dá)克隆。通過將葡萄糖與甲醇一起包含于培養(yǎng)基，可分離葡萄糖非阻抑的和曱醇誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體(為了防止曱醇揮發(fā)，可以將培養(yǎng)基在培育期間貯藏在甲醇飽和或包含甲醇的氣氛中)。細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中或培養(yǎng)基上培養(yǎng)之后，將所述細(xì)胞從所述培養(yǎng)基中分離并且可以用于進(jìn)一步分析(例如測(cè)定準(zhǔn)確的表達(dá)率，分離啟動(dòng)子以分析與野生型啟動(dòng)子相比啟動(dòng)子核酸序列中的改變)。根據(jù)本發(fā)明和例如[12]公開的方法中使用的非阻抑碳源優(yōu)選以0.1至10%的量使用，優(yōu)選以0.2至5%的量，更優(yōu)選以0.3至3%的量，特別以0.5至1%的量。優(yōu)選的非阻抑碳源選自下組丙氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖、乳糖和它們的組合。合適的抗性標(biāo)記基因的選擇依賴于用來(lái)選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。例如，如果使用Zeocin作為標(biāo)記，待引入載體的在突變」OX啟動(dòng)子控制下的抗性標(biāo)記基因是Shble基因。如果核酸編碼蛋白質(zhì)或肽，所得的/所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以是融合蛋白。特別有利的是提供在突變JOY7啟動(dòng)子的控制下的抗性標(biāo)記基因，因?yàn)樵谶@種情況下抗性標(biāo)記基因產(chǎn)物的表達(dá)率也依賴于突變啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度和行為。例如，負(fù)責(zé)核酸產(chǎn)物高表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子也將增加抗性標(biāo)記基因產(chǎn)物的表達(dá)率。這種克隆對(duì)于具有呈現(xiàn)啟動(dòng)子強(qiáng)度減少的啟動(dòng)子的克隆具有選擇優(yōu)勢(shì)。這使得在細(xì)胞轉(zhuǎn)化的再生之后能夠直接選擇超表達(dá)克隆。表達(dá)率優(yōu)選通過以下方法測(cè)定如凝膠電泳(例如SDS-PAGE)、抗體結(jié)合(例如ELISA)、定量(反轉(zhuǎn)錄酶)PCR(例如實(shí)時(shí)PCR)、酶活性(例如如果表達(dá)的蛋白質(zhì)是酶)或熒光測(cè)定(蛋白質(zhì)具有特征發(fā)射光譜如綠色熒光蛋白)。通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有非阻抑碳源的培養(yǎng)基中/上的選擇性生長(zhǎng)來(lái)選擇在不存在其它阻抑C源04QA7啟動(dòng)子的情況下是葡萄糖)時(shí)顯示表達(dá)增加的啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)化體)。在不存在其它阻抑C源04OH啟動(dòng)子的情況下是葡萄糖)而存在誘導(dǎo)物(例如曱醇)時(shí)，通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有非阻抑碳源和誘導(dǎo)物(例如曱醇)的培養(yǎng)基中/上的選擇性生長(zhǎng)來(lái)選擇顯示表達(dá)增加的啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)化體)。誘導(dǎo)物也可以是非阻抑碳源。通過將多拷貝與如上所述的調(diào)節(jié)選擇結(jié)合來(lái)選擇超表達(dá)克隆，所述多拷貝導(dǎo)致針對(duì)抗生素(例如Zeocin)的較高的抗性或培養(yǎng)基主要成分(例如Leu、His、Arg、Ura)的較高生產(chǎn)力。與巴斯德畢赤酵母有關(guān)的試劑盒、細(xì)胞和載體來(lái)獲得(例如Invitrogen)。培養(yǎng)基中的甲醇濃度可以優(yōu)選0.05至15%,更優(yōu)選0.1至10%，特別是0.3至5%。在科學(xué)文獻(xiàn)中，描述了用于不同培養(yǎng)條件的不同甲醇濃度。例如，搖瓶可以含有1%或更少的曱醇(GuarnaMM，etal.(1997)Biotech.Bioeng.56:279-286),發(fā)酵方法可以含有0.5%的曱醇(DamascenoLM，etal.(2004)ProteinExprPurif37:18-26;HellwigS.，etal.(2001)BiotechnolBioeng74:344-352;HellwigS.，etal.(1999)BiotechnolApplBiochem30:267-275)。多拷貝克隆的增強(qiáng)表達(dá)可能不僅依賴于細(xì)胞中多于一個(gè)拷貝的突變啟動(dòng)子的存在，還由于缺少幾種轉(zhuǎn)錄因子，因?yàn)檫@些因子可以結(jié)合至所述細(xì)胞中高數(shù)量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這能夠通過比較在曱醇誘導(dǎo)條件下的表達(dá)率與去阻抑條件下的表達(dá)率來(lái)證明，其中能夠發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)的表達(dá)率不僅是細(xì)胞中突變爿OW啟動(dòng)子拷貝數(shù)的效果(非線性效果)。例如，菌抹d6fF10顯示這種特征。用于分離超表達(dá)克隆的培養(yǎng)基可以包含另外的培養(yǎng)基成分如亮氨酸、尿嘧啶、精氨酸、組氨酸和/或腺嘌呤，并且山梨糖醇可以用葡萄糖交換以鑒定啟動(dòng)子變體，所述啟動(dòng)子變體在葡萄糖存在下與野生型啟動(dòng)子變體相比顯示出減少的阻抑。當(dāng)使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌抹時(shí)，可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含山梨糖醇(或其它非阻抑碳源)并且含有單獨(dú)培養(yǎng)基成分(例如亮氨酸、尿嘧啶、精氨酸、組氨酸和腺噤呤)的培養(yǎng)基上，用于在使用營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記(auxotrophymarker)的去阻抑條件下超表達(dá)克隆的選擇性生長(zhǎng)(步驟b)。在包含JOY7啟動(dòng)子的載體中普遍使用的P(TEF)-Zeo抗性標(biāo)記導(dǎo)致zeocin抗性蛋白的組成性表達(dá)，并且因此允許通過對(duì)較高濃度抗生素的抗性多拷貝克隆，其導(dǎo)致在一些可控制的調(diào)節(jié)環(huán)境下的較高表達(dá)(例如去阻抑表達(dá)、誘導(dǎo)表達(dá)等)。這使得檢測(cè)新啟動(dòng)子和克隆成為可能，所述新啟動(dòng)子具有改變的調(diào)節(jié)性質(zhì)，所述克隆中的多拷貝克隆導(dǎo)致在這種特殊調(diào)節(jié)條件下增強(qiáng)的表達(dá)。"超表達(dá)克隆"是在突變啟動(dòng)子的控制下與在野生型啟動(dòng)子控制下相比表達(dá)較多蛋白質(zhì)或功能性核酸的表達(dá)克隆，或與使用具有通常所用的啟動(dòng)子-選擇標(biāo)記組合的載體例如P(TEF)-Zeo相比表達(dá)較多蛋白質(zhì)或功能性核酸的表達(dá)克隆。與相同蛋白質(zhì)或肽或功能性核酸在野生型啟動(dòng)子控制下的表達(dá)率相比，根據(jù)本發(fā)明的"超表達(dá)克隆"的表達(dá)率可以增加至少20%,優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少100%，特別是至少500%(平均值加上兩至三倍的標(biāo)準(zhǔn)差)。"超表達(dá)克隆"可以優(yōu)選包含多于一個(gè)拷貝根據(jù)本發(fā)明的突變啟動(dòng)子或核酸分子。可選地，"超表達(dá)克隆"也可以命名為"高表達(dá)克隆"。根據(jù)本發(fā)明"曱醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"是其活性由培養(yǎng)基中存在的曱醇調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子優(yōu)選是X(M7(來(lái)自巴斯德畢赤酵母)或MOZ(來(lái)自多形漢遜酵母)啟動(dòng)子或源自曱基營(yíng)養(yǎng)酵母的任何其它曱醇誘導(dǎo)型和葡萄糖阻抑的啟動(dòng)子例如FMD,FLD，DAS(例如參見表6,實(shí)施例1)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，選擇標(biāo)記是抗生素，優(yōu)選zeocin。待用于培養(yǎng)基中的選擇標(biāo)記取決于細(xì)胞的哪種分子特征能夠用于將含有核酸或載體的細(xì)胞區(qū)別于不含所迷核酸或載體的細(xì)胞，所述核酸或載體包含突變的或野生型曱醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。因此選擇標(biāo)記可以是抗生素(抗生素抗性基因可存在于引入所述細(xì)胞的載體或核酸)。為了補(bǔ)償一些菌林的營(yíng)養(yǎng)缺陷，培養(yǎng)基中的選擇標(biāo)記可以是物質(zhì)如亮氨酸、尿嘧啶、精氨酸、組氨酸和腺嘌呤，取決于營(yíng)養(yǎng)缺陷的類型。優(yōu)選的核酸分子、載體和細(xì)胞是根據(jù)本發(fā)明的核酸、載體和細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，將核酸分子或載體通過轉(zhuǎn)化引入細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，優(yōu)選電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體鬲蟲合或通過4立子轟擊(參見仿J》口CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Editedby:FredM.Ausubeletal.;MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition),J.SambrookandD.Russell,2001，ColdSpringHarborLaboratoryPress)進(jìn)行。本發(fā)明通過以下的圖和實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述而不受其限制。圖1顯示用曱醇誘導(dǎo)之前(A)和誘導(dǎo)24(B)和72(C)小時(shí)之后，微量表達(dá)GFP-Zeo的巴斯德畢赤酵母菌林的SDS-PAGE。樣品如實(shí)施例1h)中所述制備。泳道1是X-33(陰性對(duì)照)，泳道2-4是X-33GFP-Zeo菌抹MutsA9、D2和E2，泳道5是X-33d6tF10。所有GFP-Zeo克隆中在42kDa存在強(qiáng)條帶。圖2顯示爿(9JV7啟動(dòng)子區(qū)和一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)中序列缺失的概況。將deltal-9區(qū)通過重疊延伸PCR缺失。圖3顯示去阻抑(碳饑餓)之后微量爿OY7啟動(dòng)子變體的熒光強(qiáng)度條形圖。將細(xì)胞以微量生長(zhǎng)在1%葡萄糖上。數(shù)據(jù)表現(xiàn)了4個(gè)獨(dú)立測(cè)量的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。RFU:相對(duì)熒光單位；WT:具有在野生型JOY7啟動(dòng)子控制下的GFP-Zeo的巴斯德畢赤酵母菌抹GFP-ZeoD2;Dl-D9:在GFP-Zeo基因之前具有缺失構(gòu)建體AOXlAl-A9的巴斯德畢赤酵母菌抹；EX:激發(fā)波長(zhǎng)；EM:發(fā)射波長(zhǎng)。圖4顯示在曱醇誘導(dǎo)之后微量^OW啟動(dòng)子變體的熒光強(qiáng)度條形圖。將細(xì)胞以微量生長(zhǎng)在1%葡萄糖上。數(shù)據(jù)表現(xiàn)了4個(gè)獨(dú)立測(cè)量的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。RFU:相對(duì)熒光單位；WT:具有在野生型JQZ/啟動(dòng)子控制下的GFP-Zeo的巴斯德畢赤酵母菌抹GFP-ZeoD2;Dl-D9:在GFP-Zeo基因之前具有缺失構(gòu)建體^aWAl-A9的巴斯德畢赤酵母菌抹；EX:激發(fā)波長(zhǎng)；EM:發(fā)射波長(zhǎng)。圖5顯示微量所選JOX/啟動(dòng)子變體的熒光強(qiáng)度條形圖。顯示在去阻抑和誘導(dǎo)條件下具有野生型和A6啟動(dòng)子變體的單拷貝菌株和多拷貝菌林的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表現(xiàn)4個(gè)獨(dú)立測(cè)量的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。WT:具有野生型爿QA7啟動(dòng)子的單拷貝GFP-Zeo菌株(GFP-ZeoD2)，D6:單拷貝AOXlA6承克?。籛T—E2:具有野生型爿OO啟動(dòng)子的多拷貝GFP-Zeo克??；D6*F10:多拷貝AOXlA6承克隆(X-33d6F10)。圖6顯示巴斯德畢赤酵母菌林在具有不同ZeocinTM濃度的MD和MDM瓊脂平板上液滴測(cè)試(droptest)的結(jié)果。將細(xì)胞生長(zhǎng)在BMD(l。/。)培養(yǎng)基上直到OD奶為1.5，分10步稀釋至最終稀釋率105,并且使用48針復(fù)制器(48pinreplicator)轉(zhuǎn)移至瓊脂平板。圖片頂部的數(shù)字表示對(duì)于所有平板均相同的稀釋因子。如上所述制備MD培養(yǎng)基。在MDM-Zeo平板中添加曱醇至終濃度大約0.5%。添加ZeocinTM至終濃度分別為100、200和500嗎/ml。X-33:巴斯德畢赤酵母X-33，A9:巴斯德畢赤酵母GFP-ZeoMutsA9，D2:巴斯德畢赤酵母GFP-ZeoD2，E2:巴斯德畢赤酵母GFP-ZeoE2。圖7顯示幾種多拷貝菌抹與對(duì)照菌株相比的表達(dá)水平；a)在去阻抑條件下的活性；b)在曱醇誘導(dǎo)之后的活性。圖8顯示厶6*多拷貝菌抹在去阻抑和誘導(dǎo)條件下與對(duì)照菌抹相比的表達(dá)水平。實(shí)施例實(shí)施例1:才才料和方法a)DNA制備/純化試劑盒根據(jù)提供的操作手冊(cè)使用幾種商業(yè)上能夠獲得的DNA制備和純化試劑盒(參見表3)。表3:DNA制備和純化試劑盒<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>b)TOPO⑧克隆根據(jù)提供的操作手冊(cè)進(jìn)行TOPO⑧克隆(用于克隆到pCR4Blunt-TOPO中和用于克隆到pCR-Blunt1I-TOPO⑧中)?？偸菍?pl的PCR產(chǎn)物用于克隆。根據(jù)上述規(guī)程(protocol)將每個(gè)克隆反應(yīng)的2和4ptl轉(zhuǎn)化到OneShot⑧化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌TOP10F，細(xì)胞中(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)。c)大腸桿菌轉(zhuǎn)化根據(jù)SEM(簡(jiǎn)單而有效的方法)規(guī)程將連接反應(yīng)物和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中[16]。將化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌TOP10F，細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化。d)巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的制備使用期望的巴斯德畢赤酵母宿主菌抹的單菌落接種300ml帶擋板寬頸Erlenmeyer瓶(baffledwide-neckedErlenmeyerflask)內(nèi)的50mlYPD(2%葡萄糖)中。在30。C、60。/o濕度和130rpm(PilotShakeRC-2TE)過夜溫育之后，使用一定體積的這種預(yù)培養(yǎng)物(pre-culture辨種2I帶擋板寬頸Erlenmeyer搖瓶中的200mlYPD(2%葡萄糖)至595nm處的光密度(OD595)為大約0丄將培養(yǎng)物在與預(yù)培養(yǎng)相同的條件下生長(zhǎng)至光密度為l.O至1.5。將細(xì)胞在4。C和4000rpm沉淀10分鐘，并且在200ml用水預(yù)冷的無(wú)菌水中重懸浮。將這種流程重復(fù)3次，分別將細(xì)胞在100ml水、10ml1M山梨糖醇和0.5ml1M山梨糖醇中重懸浮。將10jag期望的質(zhì)粒在300^1終體積中用Bg/II和(各50u)線性化過夜。限制酶切消化之后，將DNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程[16]在EtOH和0.3M乙酸鈉中沉淀。將DNA溶于11pl無(wú)菌ddH20，并且使用MF-MilliporeMembraneFilter(參見表12)脫鹽大約1-2小時(shí)。如果將PCR產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化，如上所述從EtOH;兄淀開始加工大約4-5嗎DNA。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)化，將80pi制備的細(xì)胞與10如上所述的DNA混合，并且在水上培育5分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移至用水預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯(electrotransformationcuvette)(Bio-Rad),并且在200Q、25和2.5kV進(jìn)行脈沖。立刻添加1ml用冰預(yù)冷的1M山梨糖醇。將懸浮液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的12mlPP管(Greiner,Frickenhausen,Germany,#184261)并且在30°C不搖動(dòng)溫育2小時(shí)。在此再生階段之后，將等分試樣(aliquot)涂布在選擇平板上。對(duì)于在誘導(dǎo)條件下具有高表達(dá)的轉(zhuǎn)化體的選擇，將細(xì)胞涂布在MSM-Zeo平板上，所述MSM-Zeo平板含有基本培養(yǎng)基和山梨糖醇(或任何其它非阻抑碳源)曱醇和zeocin。對(duì)于在去阻抑條件下顯示高表達(dá)的克隆的選擇，可將細(xì)胞涂布在缺乏曱醇的基本山梨糖醇zeo培養(yǎng)基平板上。在含有甲醇的選擇平板中包括葡萄糖，使其能夠檢測(cè)葡萄糖非阻抑表達(dá)克隆和它們的啟動(dòng)子。e)菌落PCR:將期望的畢赤酵母屬菌林的單菌落在100pl小管(microtube)內(nèi)的100plddH20中重懸浮，并且在95。C加熱5至IO分鐘。在13,200rpm離心1分鐘后，將10nl上清液用作PCR反應(yīng)的模板。將5nl這種第一輪PCR用作第二輪的模板。將5jnl第二輪PCR用于對(duì)照凝膠。PCR反應(yīng)根據(jù)所提供的操作手冊(cè)在緩沖條件下，在終體積50pl中含有10pmol的每種引物(AOXl一col和GFPrev)、200pM的每種dNTP和2.5單位的HotStarTaqDNA聚合酶(QIAGEN)或TaqDNA聚合酶(Promega)。為了測(cè)序，使用QIAquickPCRPurificationKit純化第二PCR產(chǎn)物。表4:菌落PCR的溫度程序<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>f)巴斯德畢赤酵母基因組DNA分離:將期望的巴斯德畢赤酵母菌林在無(wú)菌的12mlPP管內(nèi)的5mlYPD中在旋轉(zhuǎn)桶上于30°C生長(zhǎng)過夜，直至終OD595為5-10。根據(jù)所提供規(guī)程使用Easy-DNATMKit將1.5ml培養(yǎng)物用于DNA分離。g)蛋白質(zhì)試驗(yàn)(proteinassay):溶液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)量已長(zhǎng)期在生物化學(xué)中使用。它們的主要應(yīng)用之一是將多種生物化學(xué)方法歸一化為總蛋白量，如本案例中用于氧消耗率(oxygenconsumptionrate)。最常使用的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法是Bradford、Lowry和BCA方法?？紤]到4丈感性、動(dòng)力范圍(dynamicrange)和對(duì)特定試劑的相容性，這些方法具有一定的局限性。在這三種試驗(yàn)中，Bradford和Lowry比BCA頂更加可靠和可重復(fù)。另一方面在去污劑和/或還原劑存在時(shí)，Lowry和Bradford具有嚴(yán)重的局限性，其導(dǎo)致高空白值。因此在化學(xué)溶解之后，BCATM試驗(yàn)是優(yōu)選的方法。如根據(jù)說明書操作手冊(cè)(PierceBiotechnologyInc.),在化學(xué)細(xì)胞溶解之后以Y-Per⑧和BSA作為標(biāo)準(zhǔn)物，使用BCA，試驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，因此以下僅簡(jiǎn)要描述主要步驟。將200pl培養(yǎng)物在4000rpm和4°C離心5分鐘。棄去上清液之后，將沉淀在100plY-Pe滯中通過上下吹吸(pipettingupanddown)來(lái)重懸浮。將懸浮液在Thermomixer中1.5ml小管內(nèi)于室溫和600rpm溫育20分鐘。在13,200rpm和室溫將細(xì)胞碎片沉淀10分鐘之后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的小管中，并且貯藏在4。C用于BC八TM試驗(yàn)或SDS-PAGE。將25|il樣品在微量培養(yǎng)板的孔中與200piBCAm工作試劑(試劑A:試劑B=50:1)混合，充分震蕩30秒，并且用平板密封物(Promega)蓋緊。在37。C溫育30分鐘并冷卻至室溫之后，使用SpectramaxPlus384平板讀數(shù)器(platereader)測(cè)定在562nm的吸收。如有必要，在BCA試驗(yàn)之前將樣品用ddH20稀釋。h)SDS-PAGE:如上面部分描述的使用Y-Per⑧作為試劑通過化學(xué)細(xì)胞裂解來(lái)制備用于SDS-PAGE的樣品。將10pi溶解產(chǎn)物與10^2xSSB(sigma樣品緩沖液)混合，并且在95。C溫育5-10分鐘，并且將15pl的這種混合物加樣到蛋白質(zhì)凝膠上。使用180V進(jìn)行1小時(shí)電泳，并且使用CoomassieTM藍(lán)染色檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。表5:用于SDS-PAGE的凝膠制備<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>i)葡萄糖試驗(yàn):使用無(wú)去蛋白質(zhì)作用的葡萄糖-UV己糖激酶方法測(cè)定葡萄糖濃度(DIPROmedHandelsGmbH,Weigelsdorf,Austria,Prod.no.D590522)。將50pi畢赤酵母屬培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至PCR微量培養(yǎng)板并且在4000卬m離心5分鐘。將10pi上清液添加至UV-Star微量培養(yǎng)板內(nèi)的190pi己糖激酶試劑中并且在室溫培育15分鐘。培育之后《吏用SpectmmaxPlus384平才反讀數(shù)器在340nm測(cè)定吸收。j)液滴測(cè)試將巴斯德畢赤酵母菌林生長(zhǎng)在BMD(l。/o)中至終OD595為1.5,并且分IO步稀釋至終稀釋率105。使用48針復(fù)制器轉(zhuǎn)移至瓊脂平板上。將平板在30。C溫育直到菌落出現(xiàn)(在MD平板上通常是2天)。k)序列比對(duì)所有序列比對(duì)使用INRA主頁(yè)上的MultAlin進(jìn)4亍(InstitutNationaldelaRechercheAgronomique，Paris,France)(prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)[17〗，或4吏用EuropeanBioinformaticsInstitute的ClustalW(EBI,www.ebi.ac.ch/clustalw)[18]進(jìn)行。對(duì)于使用MultAlin的序列比較，總是將DNA序列相似性矩陣用于比較。甲醇利用途徑基因和多數(shù)過氧化物酶體基因以相對(duì)于葡萄糖阻抑、碳饑餓時(shí)去阻抑和通過甲醇誘導(dǎo)類似的方式調(diào)節(jié)。使用已定義的一組轉(zhuǎn)錄因子(抑制子以及誘導(dǎo)子)的相似轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)應(yīng)該是這種調(diào)節(jié)模式的原因。在這些啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)該顯示一些保守區(qū)域。共調(diào)節(jié)的基因的啟動(dòng)子區(qū)之間的多重序列比對(duì)應(yīng)該揭示涉及調(diào)節(jié)一致基因的轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)合位點(diǎn)。已報(bào)導(dǎo)曱基營(yíng)養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母和博伊丁氏念珠菌的幾種基因是共調(diào)節(jié)的并且已分離了它們的啟動(dòng)子序列(表6)。表6:來(lái)自甲基營(yíng)養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母和博伊丁氏念珠菌的曱醇利用途徑基因或過氧化物酶體基因的共調(diào)節(jié)基因<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>l)轉(zhuǎn)錄因子分析:4吏用GenomatixSoftwareGmbHServers上的GenomatixSuite1.6.1內(nèi)的MatlnspectorReleaseprofessional6.1Jan.2003進(jìn)4亍轉(zhuǎn)錄因子分析[15]。使用MatrixFamilyLibraryVersion3.1.1April2003groupALLfiuigUib(www.genomatix.de)將來(lái)自pPICZB的PAOXl序列搜索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。m)引物表7:所述實(shí)施例中使用的引物列表(由MWGBiotechEbersberg:Germany合成)_<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*使用方程式2(QuikChange多位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?計(jì)算Tm實(shí)施例1.1:報(bào)告構(gòu)建體的克隆使用GFP-Zeo作為由JO\7啟動(dòng)子變體驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)的報(bào)告分子(reporter)。構(gòu)建ATG起始密碼子周圍的序列以滿足用于在酵母中高表達(dá)基因的Kozak共有序列的最低要求。為了改變GFP-Zeo基因之前的啟動(dòng)子區(qū)，通過重疊延伸PCR插入五coRI限制位點(diǎn)(表8)。表8:用于本實(shí)施例的j(9義7序列(源自pPICZ)與巴斯德畢赤酵母菌抹NRRLY-11430(GenbankAN:U96967,[2])的」OW序列之間翻譯起始位點(diǎn)和周圍序列的比較。將五coRI限制位點(diǎn)用下劃線標(biāo)記，并且在位置-3和+4用粗體字母標(biāo)記最低Kozak要求。_-3+1+4P(A0X1)-GFPAAAACMCTAATTATTgaAagaattcMCcATGGCTAgCaA0X1(U96967)AAAACMCTAATTATTcgA-------MCgATGGCTAtCc使用10ng載體pPICZ-BARS1作為模板來(lái)擴(kuò)增基于PCR產(chǎn)生的報(bào)告體系組分P(JaY7)。反應(yīng)也在合適緩沖條件中的50jil終體積中含有10pmol的每種引物(分別是P(^OXOforw和P(v40Y7)rev)、200pM的每種dNTP和2.5USynergy聚合酶。將AOX1TT類似于AOX1啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增。在這個(gè)反應(yīng)中使用AOXlTTforw和AOXlTTrev作為引物。兩種PCR反應(yīng)均在循環(huán)變溫器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95。C,l分鐘；55。C，30秒；68°C,2分30秒)，以及在95°C5分鐘的初始變性步驟和在68。C10分鐘的最終延伸步驟。將2pl第一輪PCR用于與以上相同條件的第二輪擴(kuò)增。唯一的區(qū)別是延伸溫度增加至72。C。使用25ng的載體pTracerW-CMV2作為模板擴(kuò)增GFP-Zeo[19]。反應(yīng)也在合適緩沖條件中的50nl終體積中含有10pmol的每種引物(分別是GFP-Zeoforw和GFP-Zeorev)、200|aM的每種dNTP和2.5USynergy聚合酶。PCR反應(yīng)在循環(huán)變溫器中(參見表8)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95。C,l分鐘；55。C，30秒；72。C，2分30秒)，以及在95。C5分鐘的初始變性步驟和在72。C10分鐘的最終延伸步驟。在重疊延伸PCR之前將所有PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳純化。反應(yīng)在合適緩沖條件中的50^終體積中含有10ngP04QA7)、5ngAOX1TT和如上制備的作為模板的GFP-Zeo、200的每種dNTP和2.5USynergy聚合酶。PCR反應(yīng)在循環(huán)變溫器中(參見表8)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95。C，l分鐘；53°C,50秒；68。C,3分30秒)，以及在95。C5分鐘的初始變性步驟和在68°C10分鐘的最終延伸步驟。IO個(gè)循環(huán)之后添加IO^l的混合物，所述混合物含有合適的緩沖條件中的lOpmol的外部引物P(AOXl)forw和AOXlTTrev、還有200pM的每種dNTP和2.5USynergy聚合酶。在這次添加之后如程序設(shè)定繼續(xù)PCR。將具有大約2.4kb期望大小的所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化。將純化的產(chǎn)物克隆到pCR⑧4Blunt-TOPO⑧載體中并測(cè)序。測(cè)序揭示在^R告構(gòu)建體內(nèi)的4個(gè)突變和1個(gè)缺失。堿基對(duì)缺失位點(diǎn)存在于原始啟動(dòng)子序列的位置-15。因?yàn)檫@個(gè)位置在所有pPICZ載體(A、B和C;在^wl限制位點(diǎn)內(nèi))的多克隆位點(diǎn)之內(nèi)，缺失不應(yīng)該影響啟動(dòng)子活性并且因此不正確。第一個(gè)突變(T-x:)存在于啟動(dòng)子區(qū)位置-828。其它三個(gè)突變存在于GFP-Zeo編碼序列內(nèi)分別在位置+122、+507和+1075。位置+122的G->A轉(zhuǎn)變將Gly的GGA密碼子變成GAA密碼子，導(dǎo)致G41A氨基酸改變。位置+507的T-x:轉(zhuǎn)變是沉默突變，僅改變R169的密碼子。位置+1075的最后的突變(T->0將TGA終止密碼子變成精氨酸密碼子CGA。在構(gòu)建pAOX載體之后，將突變-828、+122和+1075使用QuikChange多位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖行迯?fù)。不改變位置+507的沉默突變和多聚接頭中的突變，因?yàn)槠洳灰胂∮忻艽a子。通過使用《p"I和iVort從pCR4Blunt-TOPO載體切除PAOXI-GFP-Zeo-AOXITT片段并且將其插入pBlueScript⑧SK-載體的K/wI和位點(diǎn)之間，來(lái)構(gòu)建pAOX。4吏用QuikChange⑧多位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene,Amsterdam,TheNetherlands)修正存在于爿QA7啟動(dòng)子和GFP-Zeo序列中的突變。根據(jù)提供的操作手冊(cè)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其在合適的緩沖條件中的25^終體積中含有100ngpAOX、100ng的誘變引物(分別是423forw、1372forw和2325forw)和1plQuikChange多酶混合物，PCR反應(yīng)在循環(huán)變溫器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95。C，1分鐘；55。C,l分鐘；65。C，10分30秒)，以及在95。C1分鐘的初始變性步驟。根據(jù)提供的操作手冊(cè)進(jìn)行Z^wI消化和化學(xué)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL10-GOLD(InvitrogenCorp.)細(xì)胞。所有3種突變的改正通過測(cè)序鑒定。實(shí)施例1.2:爿OY7啟動(dòng)子缺失的構(gòu)建使用P(AOXl)forw作為正向引物和AOXnrev(11=1...9)作為反向引物合成JQZ7啟動(dòng)子的左臂。使用10pmol的AOXnforw(11=1...9)作為正向引物和P(AOXl)rev作為反向引物合成右臂。使用12ng載體pAOX作為模板和10pg的每種引物合成全部的臂。反應(yīng)同樣在合適的緩沖條件中，在50pl的終體積中含有10pmol的每種引物、200pM的每種dNTP和0.6UAvoDNA聚合酶。PCR在循環(huán)變溫器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95。C,l分鐘；55。C,1分鐘；68。C，l分30秒)，以及在95。C5分鐘的初始變性步驟和在68。CIO分鐘的最終延伸步驟。在將所有臂用作重疊延伸PCR的模板之前將其在瓊脂糖凝膠上純化。表9:用于啟動(dòng)子缺失的重疊引物對(duì)和臂長(zhǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>反應(yīng)在合適的緩沖條件中的50pil終體積中含有如上所述制備的作為模板的10ng每種臂、200pM的每種dNTP和0.6UiVoDNA聚合酶。PCR在循環(huán)變溫器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95。C,45秒；60。C,45秒；68°C,2分鐘)，以及在95。C5分鐘的初始變性步驟和在68°C10分鐘的最終延伸步驟。在10個(gè)循環(huán)之后添加20pi混合物，所述混合物含有在合適緩沖條件中的10pmol外部引物P(AOXl)forw和P(AOXl)rev,還有200|iM的每種dNTP和0.6U尸woDNA聚合酶。在這次添加之后如程序設(shè)定繼續(xù)PCR。將具有大約898-947bp期望大小的所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化并且克隆到pCR4Blunt-TOPO(A2、A4、A5、A7和A8)或pCR-BluntII-TOPO載體(Al、A3、A6和A9)中并且測(cè)序。通過使用Bg/II和五coiI從TOPO⑧載體切除PA0X1A片段并且將它們插入到pAOX載體的Bg/II和五coiI位點(diǎn)之間取代野生型^OY7啟動(dòng)子，來(lái)構(gòu)建pAOXA載體。所得載體通過測(cè)序驗(yàn)證。實(shí)施例1.3:巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體分析如前所述進(jìn)行巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化。通過在MSM-Zeo瓊脂平板上以等分試樣涂布轉(zhuǎn)化和再生的畢赤酵母屬細(xì)胞來(lái)選擇Paox"或PAOX1A)-GFP-Zeo-AOX1TT的整合。將巴斯德畢赤酵母菌抹在深孔平板中培育，所述深孔平板每孔含有300piBMD(1%),在28。C、320rpm和80%濕度于室溫生長(zhǎng)60小時(shí)。這段時(shí)間之后，取50nl用于GFP萸光的測(cè)定。通過添加250piBMM2/孔然后再溫育72小時(shí)來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)。通過在10、24和48小時(shí)之后添加50plBMM10補(bǔ)充曱醇。曱醇誘導(dǎo)72小時(shí)后再次測(cè)量GFP熒光。分析報(bào)告酶的表達(dá)通過SpectramaxGeminiXS平板讀數(shù)器中具有在395nm的激發(fā)和在507nm的發(fā)射的GFP熒光檢測(cè)來(lái)分析巴斯德畢赤酵母中GFP-Zeo的表達(dá)。將如上所述在深孔平板中培養(yǎng)的50pl巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物在FIA微量滴定板中用ddH20稀釋1+3。由于有限的樣品量，只進(jìn)行一次測(cè)量。所有給出的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差由至少3個(gè)不同培養(yǎng)物(孔)計(jì)算。如果將整合盒整合到J<M7基因座而不取代^a\7基因，重組的畢赤酵母屬菌林能夠在曱醇上以野生型速率生長(zhǎng)，而通過雙交換取代J(9^7基因?qū)е略跁醮忌系偷枚嗟纳L(zhǎng)速率。將這兩種生長(zhǎng)表型分別稱為曱醇利用正型(methanolutilizationplus)(Mut+)和甲醇利用緩慢型(MutS)。為了分析曱醇利用表型，使用96針復(fù)制器將巴斯德畢赤酵母小規(guī)模培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到MM和MD瓊脂平板上并且在30。C溫育2天。2天之后，如果畢赤酵母屬菌林具有Mut+表型則在兩個(gè)平板上均出現(xiàn)菌落，而具有Muts表型的菌林僅在MD平板上出現(xiàn)菌落。將由pAOX或pAOXA質(zhì)粒之一的轉(zhuǎn)化得到的所有畢赤酵母屬菌抹通過菌落PCR分析，并且缺失構(gòu)建體還通過測(cè)序保證啟動(dòng)子序列在報(bào)告基因之前(GFP-Zeo)。實(shí)施例1.4:^aY7啟動(dòng)子的定向進(jìn)化雖然在基因編碼區(qū)上的PCR誘變得到良好的發(fā)展和建立，然而對(duì)于在啟動(dòng)子區(qū)的誘變一無(wú)所知。由于知識(shí)的缺乏進(jìn)行幾種誘變條件為了最小化突變譜內(nèi)的偏好，使用兩種不同的聚合酶，TaqDNA聚合酶和MutazymeDNA聚合酶(StratageneInc.)。由于完全缺乏在啟動(dòng)子序列進(jìn)化的突變頻率方面的知識(shí)的事實(shí)，測(cè)試幾種突變頻率(理i侖上1至14/kb)。使用HotStarTaqDNA聚合酶誘變根據(jù)[20]在100反應(yīng)體積中于啟動(dòng)子序列上進(jìn)行誘變PCR。反應(yīng)含有在合適緩沖條件中的5UHotStarTaqDNA聚合酶、12ngpAOX、40pmol的每種引物(P(AOXl)forw和P(AOXl)rev)和dNTPs(200juMdGTP、200juMdATP、1mMdTTP、ImMdCTP)。將MgCl2濃度增加至7mM(通常為3mM)以改變聚合酶的錯(cuò)誤率。PCR在循環(huán)變溫器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95。C，45秒；55。C,45秒；72。C，l分30秒)，以及在95。C15分鐘的初始變性步驟和在72。C10分鐘的最終延伸步驟。根據(jù)提供的操作手冊(cè)在50pi的終體積中在啟動(dòng)子序列上進(jìn)行GeneMorph⑧隨機(jī)誘變?cè)噭┖械牟僮鳌Ｊ褂貌煌康妮d體pAOX作為模板(參見表10)。使用12.5pmol的每種引物,P(AOXl)forw和P(AOXl)rev。PCR反應(yīng)在循環(huán)變溫器中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95。C，30秒；55。C，30秒；68。C,l分30秒)，以及在95。C1分鐘的初始變性步驟和在68。C10分鐘的最終延伸步驟。表10:GeneMorphPCR反應(yīng)中所用的模板量<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>進(jìn)行具有上述條件(Taq,3xGeneMo卬h⑧)的第一輪誘變。為了獲得更高的誘變頻率，使用GeneMorph⑧反應(yīng)約作為模板用于第二輪PCR。使用Taq和GeneMorph#2和#3條件。在轉(zhuǎn)化進(jìn)入巴斯德畢赤酵母X-33GFP-ZeoMutsA9細(xì)胞之前，將所有PCR反應(yīng)如前所述地沉淀和脫鹽。使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化和再生方法。通過如下方法來(lái)選擇在葡萄糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在含有100-500ng/mlZeocin的MD瓊脂平板上涂布150jal等分試樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮液并且在30。C溫育2天。實(shí)施例1.5:結(jié)果與討論I)報(bào)告體系的表征迄今為止，多種GFP變體在分子生物學(xué)中使用。盡管僅在少數(shù)點(diǎn)突變上有所不同，它們的特征相差甚遠(yuǎn)。除了改進(jìn)的折疊性質(zhì)(foldingproperty),它們的熒光光i瞽以及它們的量子產(chǎn)率并且因此在強(qiáng)度上都大不相同。依賴于它們的激發(fā)最大值(excitationmaximum),能夠?qū)⒕G色熒光蛋白分成兩個(gè)主要組在395nm具有激發(fā)最大值和470nm的較小最大值(minormaximum)的野生型GFP變體，和在480-490nm具有激發(fā)最大值的紅移GFP變體。根據(jù)其氨基酸序列，環(huán)-3-GFP(cycle-3-GFP)屬于野生型GFP變體組，在395nm具有激發(fā)最大值。為了在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)時(shí)控制光語(yǔ)性質(zhì)，測(cè)定熒光光鐠。GFP-Zeo中環(huán)-3-GFP的總激發(fā)最大值是395nm，而在478nm的第二最大值是漸消失的。發(fā)射光譜揭示510nm的發(fā)射最大值。操作手冊(cè)建議的兩種激發(fā)波長(zhǎng)中，395nm是優(yōu)選的并且將其用于所有進(jìn)一步的測(cè)量。自吸收在熒光光謙學(xué)中是非常頻繁的現(xiàn)象。在高濃度熒光團(tuán)(fluorophor)時(shí)，能夠?qū)⑻幱谂c吸收(激發(fā))光譜重疊的區(qū)域的發(fā)射的質(zhì)子吸收(輻射能量轉(zhuǎn)移)。如果將發(fā)生自吸收(發(fā)射內(nèi)部濾光效果(emissioninnerfiltereffect)),將觀察到較低的熒光強(qiáng)度。這導(dǎo)致啟動(dòng)子活性的低估。沒有內(nèi)部濾光效果的情況下，熒光強(qiáng)度以線性方式隨熒光團(tuán)增加而增加。因此測(cè)試表達(dá)GFP-Zeo的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞增加體積的熒光活性。在細(xì)胞水平至多3000RFU無(wú)發(fā)射內(nèi)部濾光效果是能夠檢測(cè)的。不能夠評(píng)估在細(xì)胞內(nèi)由GFP的積累引起的自吸收。檢測(cè)到在全部72小時(shí)誘導(dǎo)階段熒光的線性增加。由于該原因，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)部濾光效果看來(lái)是不可能的。因此細(xì)胞核內(nèi)GFP-Zeo的積累對(duì)于其定量沒有問題。本研究中測(cè)定的單拷貝啟動(dòng)子活性的范圍內(nèi)未發(fā)生內(nèi)部濾光效果。由于缺乏自吸收，啟動(dòng)子活性的低估不太可能發(fā)生。其他人觀察到的內(nèi)部濾光效果最可能的原因是使用不同的GFP變體和低得多的Stokes位移，并且因此重疊激發(fā)和發(fā)射光語(yǔ)。當(dāng)比較GFP表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果時(shí)必需要小心。使用幾種GFP變體，所述GFP變體具有截然不同的光譜性質(zhì)，還有最優(yōu)化的密碼子使用和因此在不同表達(dá)宿主中非常不同的表達(dá)水平，使不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的可比性變得復(fù)雜。II)微量JQA7啟動(dòng)子活性小規(guī)模培養(yǎng)微生物細(xì)胞(例如酵母、細(xì)菌)通常以搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行。在搖瓶中接種和培養(yǎng)大微生物文庫(kù)是勞動(dòng)和時(shí)間密集型的而導(dǎo)致高成本。近年來(lái)開發(fā)了使用深孔微量滴定板的微量培養(yǎng)體系作為備選方案。由于平行操作例如96或384個(gè)菌4朱/培養(yǎng)物并且需要較少材料，微量滴定體系在勞力、時(shí)間并且因此在成本強(qiáng)度方面優(yōu)于搖瓶培養(yǎng)。由于幾種原因，微量滴定體系主要的缺點(diǎn)小樣品體積和低通氣效率是較不相關(guān)的(l)分析系統(tǒng)中的技術(shù)進(jìn)步致使大量化合物較低的檢測(cè)限制，這使得所需樣品體積非常低；(2)用于在深孔微量滴定板中培育的方法和設(shè)備也已改進(jìn)。已經(jīng)在少數(shù)研究中證明，微量滴定板中的通氣速率和因此的生長(zhǎng)條件與搖瓶相似。也已經(jīng)使用環(huán)-3-GFP作為報(bào)告蛋白質(zhì)證明對(duì)于釀酒酵母的啟動(dòng)子的實(shí)時(shí)研究與搖瓶研究一致。如上所述在深孔微量滴定板中研究JO￥7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP-Zeo表達(dá)。細(xì)胞在葡萄糖上生長(zhǎng)之后，接著是使用甲醇做為碳源和能量源的誘導(dǎo)階段。巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中使用曱醇的^an啟動(dòng)子誘導(dǎo)導(dǎo)致GFP熒光的快速增加，所述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞具有PAOXl-GFP-Zeo-AOXlTT表達(dá)盒。GFP熒光以線性方式增加直到72小時(shí)。如果添加曱醇，GFP-Zeo的表達(dá)將繼續(xù)。如果不添加曱醇，曱醇通過蒸發(fā)和消耗在24小時(shí)內(nèi)耗盡并且GFP-Zeo表達(dá)減少至去阻抑水平。GFP-Zeo熒光的增加也和SDS-PAGE顯示的GFP-Zeo蛋白質(zhì)一致。在曱醇誘導(dǎo)下，出現(xiàn)的約42kDa的蛋白質(zhì)條帶隨熒光增加變得更強(qiáng)。42kDa處的強(qiáng)條帶存在于全部GFP-Zeo克隆中，而在陰性對(duì)照(X-33野生型)中無(wú)條帶出現(xiàn)。同樣在X-33d6+F10的樣品中，72小時(shí)甲醇誘導(dǎo)之后發(fā)現(xiàn)強(qiáng)條帶(圖1C，泳道5)。盡管未歸一化，42kDa條帶的強(qiáng)度和合適的熒光水平之間清楚的相關(guān)性是可以估計(jì)的。III)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)如前所述，幾種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的共有序列是已知的。JO\7啟動(dòng)子序列的序列分析揭示了幾種推定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，具有少數(shù)引起特別興趣的結(jié)果。在熱激因子和脅迫應(yīng)答元件基序之中，發(fā)現(xiàn)少數(shù)通常已知涉及葡萄糖調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。最感興趣的結(jié)合位點(diǎn)總結(jié)于表11和圖2。表ll:在爿aW啟動(dòng)子序列內(nèi)存在的轉(zhuǎn)錄因子(TF)結(jié)合位點(diǎn)。大寫字母的堿基對(duì)表示核心序列(coresequence)(基質(zhì)中4種最保守、連續(xù)性的殘基)，以下劃線標(biāo)記的堿基對(duì)表示高信息含量(Ci〉60,最大值為100)。TF基質(zhì)位置(5"缺失變體核心相似性基質(zhì)相似性序列SeqIDNo.HAP1.0152-66(-902至-888)l細(xì)O.證ct幽ga返tCGGAt31HSF.01135至155(-819至-799)l細(xì)0.784ggtcctg32HAP234.01193至205(-761至-749)△1l扁0.895CEiagcCCAAt犯c33HAP234.01203至215(-751至-739)All細(xì)0.923gagctCCAAtcaa34ABAA.01213至227(-741至-727)All細(xì)0.949ctcgctCATTccaat35STRE.01279至287(-675至-667)l扁l扁ccAGGGggg36RAP1.01332至346(-622至-608)A2l細(xì)0.845tacACCCgaacatca37ADR1.01371至377(-583至-577)A3l扁l扁tGGGGtc38HSR03516至536(_438至-418)A4l細(xì)0還AGAAacttccaaaagtcggc39HAP234.01665至677(-289至-277)A5l細(xì)0.883atcatCCAAaaag40MAT1MC.01680至690(-274至-264)l細(xì)0.901tgcaTTGTctc41GCR1.02699至713(-255至-241)A6l細(xì)0.872atgCTTCcaagattc42QA-1F.01743至763(-211至國(guó)191)A70.7850.775atga43*所給的位置相對(duì)于GFP-Zeo基因的翻譯起始位點(diǎn)(ATG)標(biāo)記；推定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的核心序列以大寫字母顯示。c表示與互補(bǔ)鏈的同源性。IV)曱醇調(diào)節(jié)基因中的調(diào).節(jié)序列文獻(xiàn)中描述的幾種序列涉及曱醇誘導(dǎo)基因的調(diào)節(jié)?；诎退沟庐叧嘟湍竼?dòng)子的缺失分析描述三種調(diào)節(jié)區(qū)域，兩種負(fù)作用區(qū)域(negativeactingregion)(URS1和URS2，上游阻抑序歹')和正作用結(jié)構(gòu)域(positiveactingdomain)(UAS,上游活化序列)[3]。對(duì)于多形漢遜酵母MOY啟動(dòng)子，也描述了兩種上游激活序列(UAS1和UAS2)和一種阻抑物結(jié)合位點(diǎn)(URS1)[8]。V^OY7啟動(dòng)子的缺失構(gòu)建體基于轉(zhuǎn)錄因子分析和多序列比對(duì)，選擇9種啟動(dòng)子區(qū)用于如前所述的通過重疊延伸PCR的缺失。將」aY7啟動(dòng)子缺失構(gòu)建體克隆到pAOX載體中以取代"野生型JOXT，啟動(dòng)子5'至報(bào)告基因GFP-Zeo。將質(zhì)粒線性化并且整合到巴斯德畢赤酵母基因組中。表12:^QA7啟動(dòng)子構(gòu)建體中缺失的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>所給的位置相對(duì)于S叫IDNo.1標(biāo)記如上所述分析整合體的GFP-Zeo表達(dá)和正確的啟動(dòng)子序列在GFP-Zeo基因之前的整合。進(jìn)一步詳細(xì)分析單拷貝整合體在不同碳源中的微量GFP-Zeo表達(dá)水平。在全部構(gòu)建體(缺失和野生型)中，只要葡萄糖或甘油存在于培養(yǎng)基中(有或無(wú)曱醇)，則不能檢測(cè)到GFP熒光。碳饑餓(其代表去阻抑條件)時(shí)，檢測(cè)到GFP焚光的輕^t增加。與野生型相比，一些啟動(dòng)子變體顯示顯著的區(qū)別(圖3)。在去阻抑條件下在6種構(gòu)建體(A3、A4、A5、A7、A8和A9，參見圖3)中發(fā)現(xiàn)顯著較低的啟動(dòng)子活性。Al具有野生型活性，而構(gòu)建體A2和A6*得到顯著較高的GFP-Zeo表達(dá)。后者的表達(dá)水平顯著高于野生型水平。曱醇誘導(dǎo)時(shí)，所有變體顯示顯著減少的啟動(dòng)子活性，僅有一個(gè)例外Al產(chǎn)生比野生型高約20%的活性。所有其它變體活性的減少是相當(dāng)顯著的，可參見圖4。根據(jù)甲醇誘導(dǎo)野生型活性歸一化的所有變體和野生型構(gòu)建體的啟動(dòng)子活性總結(jié)于表13。表13:微量啟動(dòng)子變體的萸光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)表示4個(gè)獨(dú)立測(cè)量的平均SD。WT啟動(dòng)子在72小時(shí)曱醇誘導(dǎo)之后的焚光強(qiáng)度(100。/o)是987士81。只要葡萄糖存在于培養(yǎng)基中則檢測(cè)不到熒光。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>構(gòu)建體A8中TATA框的缺失導(dǎo)致啟動(dòng)子嚴(yán)重的破壞，在去阻抑和誘導(dǎo)條件時(shí)分別大約卯°/。和80%嚴(yán)重降低的活性。通過消除實(shí)驗(yàn)測(cè)定(Ellis，S.B.,etal.,Mol.Cell.Biol.(1985)5:llll-1121)的轉(zhuǎn)錄起始(transcriptioninitiationstart)(A9),未觀察到對(duì)于表達(dá)水平的這種強(qiáng)烈影響。其是曱醇誘導(dǎo)之后最好的缺失構(gòu)建體之一。和期望的一樣，TATA框?qū)τ谵D(zhuǎn)錄水平具有強(qiáng)烈的影響。相反轉(zhuǎn)錄起始似乎不像TATA框一樣重要。距離TATA框一定距離內(nèi)的另一個(gè)區(qū)域可能在將原有的轉(zhuǎn)錄起始缺失之后作為轉(zhuǎn)錄起始起作用。能夠推測(cè)這種缺失在表達(dá)過程的幾個(gè)階段(例如轉(zhuǎn)錄起始、mRNA穩(wěn)定性、翻譯起始)的效果，因?yàn)槿笔Ц淖兞薽RNA的5'端。僅兩種構(gòu)建體A2和厶6*在去阻抑之后顯示顯著豐支高的表達(dá)水平。將Raplp和Gcrlp推定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)包括在缺失的序列之中。此外，推定的QA-1F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與厶6*的缺失序列非常接近。值得注意的是，已知Raplp和Gcrlp結(jié)合位點(diǎn)存在于啟動(dòng)子序列中時(shí)以協(xié)同方式(synergisticmanner)起作用[21]。依賴于普遍性轉(zhuǎn)錄因子Raplp的結(jié)合位點(diǎn)和合適的轉(zhuǎn)錄因子的序列背景，Raplp具有不同的細(xì)胞功能(例如端粒結(jié)構(gòu)、雜交(mating)、翻譯、糖酵解)[22-24]。如前所述，Gcrlp是調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)糖酵解基因的主要元件，并且對(duì)于釀酒酵母中的高水平表達(dá)是絕對(duì)必需的。Raplp和Gcrlp的結(jié)合位點(diǎn)存在于糖酵解基因上游激活序列(UAS)核心區(qū)域的附近處并且通過Raplp將DNA彎曲來(lái)減輕Gcrlp結(jié)合。另一方面，相鄰的Raplp結(jié)合位點(diǎn)不是依賴Gcrlp的基因活化的絕對(duì)必要條件?？雌饋?lái)當(dāng)較高數(shù)量的CT框(CT-box)存在時(shí)，Gcrlp能夠促進(jìn)與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。雖然描述了Raplp與Gcrlp以及Gcrlp與Gcrlp清楚的相互作用，但是提出了一些其它因子與Gcrlp和/或Raplp相互作用調(diào)節(jié)復(fù)合物的活性。在過去三十年中獲得了對(duì)誘導(dǎo)機(jī)制的廣泛認(rèn)識(shí)。在JOY7啟動(dòng)子序列中找不到如上所述的功能性UAS中Gcrlp和Raplp結(jié)合位點(diǎn)的基本上緊密的接近性。相反，兩種結(jié)合位點(diǎn)距離367bp。在推定的Gcrlp結(jié)合位點(diǎn)中，其核心序列CTTCC在啟動(dòng)子序列中以2倍存在，但它們之中沒有與Raplp結(jié)合位點(diǎn)或另外的CTTCC基序直接相鄰。因此存在于許多糖酵解基因中的這兩種結(jié)合位點(diǎn)的協(xié)同作用看起來(lái)是不可能的。由于Raplp和Gcrlp的推定作用是在去阻抑條件下用于^OY7的阻抑物蛋白，用于這種推定的新細(xì)胞功能的兩種蛋白質(zhì)(相互)作用的新形式是可能的。通過觀察無(wú)曱醇誘導(dǎo)時(shí)具有非常高的GFP-Zeo表達(dá)的多拷貝菌抹，強(qiáng)調(diào)在碳饑餓時(shí)的阻抑中涉及厶6*缺失(包括推定的Gcrlp結(jié)合位點(diǎn))。Al-A9系列最佳克隆的GFP-Zeo表達(dá)，稱為巴斯德畢赤酵母X-33d6fF10，示于圖5。在這種厶6*多拷貝菌抹中去阻抑之后的GFP-Zeo表達(dá)(60小時(shí)，微量)比單拷貝野生型啟動(dòng)子菌抹(X-33GFP-ZeoD2)在曱醇誘導(dǎo)之后的表達(dá)高大約10%。曱醇誘導(dǎo)之后巴斯德畢赤酵母X-33d6*F10的表達(dá)水平也遠(yuǎn)高于具有野生型啟動(dòng)子的多拷貝菌抹(X-33GFP-ZeoE2)。巴斯德畢赤酵母^2A7和A4S/和多形漢遜酵母MOZ啟動(dòng)子區(qū)啟動(dòng)釀酒酵母中報(bào)告酶p-半乳糖苷酶(大腸桿菌的lacZ)的表達(dá)[9]。釀酒酵母中這些基因的調(diào)節(jié)模式與它們的天然宿主相似葡萄糖阻抑基因表達(dá)。在碳饑餓條件時(shí)輕微地去阻抑表達(dá)，并且甘油作為碳源誘導(dǎo)表達(dá)。在釀酒酵母中和Z)AS7調(diào)節(jié)區(qū)域控制下的p-半乳糖苷酶表達(dá)水平與得自具有強(qiáng)釀酒酵母CTC7(組成型)和a4Z2(誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子的表達(dá)水平可比較[9]。已經(jīng)證明釀酒酵母中由MOY啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)也由乙醇、甲醇和油酸誘導(dǎo)。另外非常重要的發(fā)現(xiàn)是啟動(dòng)子的去阻抑/誘導(dǎo)中涉及Adrlp。Adrlp是釀酒酵母中^D//2(醇脫氬酶2)和一些過氧化物酶體蛋白的正效應(yīng)物[25],當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏葡萄糖時(shí)Adrlp也是MQZ啟動(dòng)子的正效應(yīng)物。如前所述由于當(dāng)甘油存在時(shí)MOT的去阻抑，JOA7和MO^基因的調(diào)節(jié)模式在它們的天然宿主中顯著不同。使用多形漢遜酵母中的」OY7啟動(dòng)子區(qū)揭示在異源宿主中甘油不阻抑爿OY7啟動(dòng)子[26]。因此，異源JOW啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)看起來(lái)如同源的MOZ啟動(dòng)子一樣。這導(dǎo)致如下提示巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母之間在調(diào)節(jié)模式中顯著的不同是由于在這兩種酵母中對(duì)不同碳源的總體轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。言下之意是盡管甘油和葡萄糖阻抑機(jī)制是與在巴斯德畢赤酵母中(部分)相同的，但在多形漢遜酵母(和釀酒酵母中一樣)的情況不同并且甘油不使用葡萄糖阻抑機(jī)制。存在于啟動(dòng)子序列中的三種推定的HAP2/3/4/5結(jié)合位點(diǎn)中的兩種在A1缺失構(gòu)建體內(nèi)，而第三種在A5中。Al的序列缺失導(dǎo)致曱醇誘導(dǎo)時(shí)啟動(dòng)子活性的增加，但未觀察到對(duì)于去阻抑啟動(dòng)子水平的影響。相反，A5的缺失導(dǎo)致在去阻抑以及誘導(dǎo)條件下啟動(dòng)子活性的嚴(yán)重減少。在A1缺失中，發(fā)現(xiàn)推定的構(gòu)巢曲霉(^spwg/〃船w'血/ara)abaA結(jié)合位點(diǎn)。abaA基因產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄激活子，所述轉(zhuǎn)錄激活子涉及構(gòu)巢曲霉中的分生孢子梗(無(wú)性繁殖器)發(fā)育[27]。因?yàn)樗型贫ǖ慕Y(jié)合位點(diǎn)是可能的激活子序列[27],它們的缺失應(yīng)該對(duì)A5構(gòu)建體中存在的表達(dá)水平具有負(fù)效應(yīng)。由于兩種缺失均非常長(zhǎng)的事實(shí)，另外的結(jié)合位點(diǎn)可能是造成觀察到的效果的原因。Al的缺失對(duì)表達(dá)水平具有相反的效果的事實(shí)說明推定的結(jié)合位點(diǎn)之一是阻抑物基序，或存在另外的結(jié)合位點(diǎn)，其超越了缺失推定的HAP和abaA結(jié)合位點(diǎn)的效果由此增加表達(dá)水平。但是，已知HAP復(fù)合物在釀酒酵母中負(fù)責(zé)正向調(diào)節(jié)涉及呼吸作用和能量代謝的基因。呼吸作用的調(diào)節(jié)由氧水平以及存在于培養(yǎng)基中的碳源控制，二者均由Hap復(fù)合物介導(dǎo)。在發(fā)酵酵母釀酒酵母中，葡萄糖阻抑幾種基因和因此的呼吸鏈功能以及檸檬酸循環(huán)。呼吸作用的葡萄糖阻抑部分通過Hap復(fù)合物介導(dǎo)，即通過只要葡萄糖存在時(shí)Hap4p的缺失。相反，氧依賴調(diào)節(jié)似乎由Haplp調(diào)節(jié)[28]。復(fù)合物從呼吸作用酵母乳酸克魯維酵母中分離Hap復(fù)合物基因的同源物。涉及呼吸作用的基因在呼吸作用酵母中組成型表達(dá)，即使存在葡萄糖。迄今為止，已經(jīng)顯示來(lái)自Hap復(fù)合物的幾乎每種呼吸鏈基因均獨(dú)立地調(diào)控[29]。Hap復(fù)合物的作用看起來(lái)在調(diào)整碳和氮的同化作用中，如同樣在釀酒酵母[30]和構(gòu)巢曲霉[29]中發(fā)現(xiàn)的一樣。曱醇利用途徑中的第一步是氧消耗，主要由巴斯德畢赤酵母中的JQA7基因產(chǎn)物催化。通過氧氣調(diào)節(jié)涉及能量代謝的大多數(shù)基因和幾乎每種編碼氧消耗酶的基因，主要通過Haplp和/或Hap2/3/4/5p[28]。當(dāng)生長(zhǎng)在作為唯一能量源和碳源的甲醇上時(shí)，曱醇利用途徑導(dǎo)致碳同化作用和能量產(chǎn)生。」aw啟動(dòng)子調(diào)節(jié)中涉及Hap復(fù)合物識(shí)別基序TTCCAA直覺上講得通。包括第二推定HSF結(jié)合位點(diǎn)的A4構(gòu)建體導(dǎo)致去阻抑和誘導(dǎo)之后啟動(dòng)子活性減少30%。因此HSF是去阻抑和誘導(dǎo)條件下爿OY7基因表達(dá)的普通的增強(qiáng)子。在釀酒酵母中，幾種脅迫條件如熱休克、氧化脅迫和葡萄糖饑餓導(dǎo)致HSF的活化。同樣已經(jīng)證明"代謝總開關(guān)(metabolicmasterswitches)"之一的蛋白激酶Snflp涉及磷酸化并且因此在碳饑餓時(shí)的HSF活化[31]。因此在葡萄糖饑餓(有或無(wú)誘導(dǎo))時(shí)出現(xiàn)爿QA7的完全活化中涉及HSF?，F(xiàn)有技術(shù)中公開了^aY7啟動(dòng)子的表達(dá)研究，其使用截短形式(truncatedversion)以及具有缺失序列的變體[32,33]。表14:Inan等的啟動(dòng)子研究的結(jié)果[32,33];使用0.5%甲醇作為碳源進(jìn)行誘導(dǎo)，使用0.5%曱醇和0.5%乙醇阻抑；起始位置表示爿OW啟動(dòng)子中相對(duì)于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)的序列5，端啟動(dòng)子片段相對(duì)于SEQIDNo.l的缺失相對(duì)活性[%]誘導(dǎo)阻抑<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>起始于153(-801)(表14)的構(gòu)建體Inan_BCDEF揭示了153(-801)上游至少一種激活蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。這種激活子結(jié)合位點(diǎn)的候選物是用Matlnspector發(fā)現(xiàn)的互補(bǔ)鏈上Haplp(52至66、-902至-888)和HSF(135至155、-819至-799)的結(jié)合位點(diǎn)。在feci限制位點(diǎn)(210-215(-744至-739))的截短導(dǎo)致啟動(dòng)子幾乎達(dá)到野生型啟動(dòng)子的活性(GeoffLinCereghino,Poster,SixthMeetingon"CurrentTopicsinGeneExpressionandProteomics，，,SanDiego，October19-22,2003)。為了用5^cI截短的啟動(dòng)子構(gòu)建體(pHWG0，GeoffLinCereghino,poster)達(dá)到野生型啟動(dòng)子水平，阻抑物蛋白的第二結(jié)合位點(diǎn)可以存在于210(-744)的上游，其缺失對(duì)于啟動(dòng)子活性具有相同影響但方向相反。阻抑物蛋白的位置是169(-784)和210(-744)之間,因?yàn)锳l構(gòu)建體(A169(-784)至234(-719))含有阻抑物結(jié)合位點(diǎn)。Al的缺失導(dǎo)致啟動(dòng)子活性增加20%(表14)，其在通過缺失激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)而減少的范圍之內(nèi)。通過與A4(△508(-445)至550(-403》的比較，阻抑物結(jié)合位點(diǎn)的位置能夠進(jìn)一步精確至433(-520)和508(-445)之間的序列，因?yàn)锳4缺失包括正作用轉(zhuǎn)錄因子，516至536(-438至-418)處的HSF。如果正作用HSF(如果其是HSF)位于提出的區(qū)域之內(nèi)，能夠推測(cè)在433和508(-520和-445)之間的阻抑物結(jié)合位點(diǎn)的較強(qiáng)效果。如果HSF的結(jié)合位點(diǎn)位于508和536(-445和-418)之間的區(qū)域，另外的激活子結(jié)合位點(diǎn)位于536和560(-418和-393)之間。如果不是，則可能是相同的結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)镮nanABCD—F(△560至709(-393至-245))變體僅具有16%的野生型活性，同樣A5構(gòu)建體(624至682(-329至-271))導(dǎo)致大約70%野生型水平的減少。和期望的一樣，將InanB片段從全長(zhǎng)啟動(dòng)子缺失(產(chǎn)生InanAj:DEF)以及從Inan—BCDEF中缺失(產(chǎn)生Inan—CDEF)分別導(dǎo)致較長(zhǎng)片段63和64%的減少。相反，盡管從全長(zhǎng)啟動(dòng)子缺失C片段導(dǎo)致啟動(dòng)子活性大約10%的增加，從截短的Inan—CDEF片段缺失導(dǎo)致49至14%的減少(表14)。解釋是依賴于它們的結(jié)合位點(diǎn)背景的轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同結(jié)合。最后的激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于713和760之間(-24至-194)(GeoffLinCereghino，PosterSanDiego)。此外，通過A7構(gòu)建體(A729至763，-225至-191),激活子的位置可以精確到下游729(-225)?？偠灾l(fā)現(xiàn)對(duì)于^aw啟動(dòng)子的表達(dá)水平具有強(qiáng)烈影響的幾個(gè)區(qū)域。結(jié)合來(lái)自本文提供的實(shí)施例和來(lái)自其他作者的所有已知調(diào)節(jié)位點(diǎn)，排除含有TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的區(qū)域，至少10個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)存在于PAoja啟動(dòng)子序列上。提供的數(shù)據(jù)揭示爿QA7啟動(dòng)子的配合調(diào)節(jié)(orchestralregulation):幾種因素對(duì)于結(jié)合至DNA的最大表達(dá)水平是必需的。在誘導(dǎo)條件下，幾種正作用轉(zhuǎn)錄因子(激活子)結(jié)合至DNA,而多數(shù)阻抑物蛋白不結(jié)合導(dǎo)致高水平表達(dá)。盡管是去阻抑的，啟動(dòng)子活性僅達(dá)到誘導(dǎo)水平的小部分(~3%)。這最可能是由于較少的激活子和較多的阻抑物蛋白結(jié)合至啟動(dòng)子區(qū)。在阻抑條件下，能夠假設(shè)無(wú)激活子結(jié)合至DNA和幾種阻抑物結(jié)合至DNA在阻抑條件下具有進(jìn)一步增加的阻抑物/激活子比率。已經(jīng)證明對(duì)于葡萄糖阻抑的釀酒酵母的^D//2(醇脫氫酶2)啟動(dòng)子，其結(jié)合緊鄰核小體的激活蛋白(例如Adrlp)，導(dǎo)致不穩(wěn)定并且因此導(dǎo)致在去阻抑時(shí)染色質(zhì)的重排。重排發(fā)生在TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的區(qū)域因此增加它們的可接近性。由于較高的可接近性，出現(xiàn)穩(wěn)定的前起始復(fù)合物的形成，因此將啟動(dòng)子活性增加至基礎(chǔ)水平。在增強(qiáng)PA0X1驅(qū)動(dòng)表達(dá)的幾種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合中，可以假設(shè)至少對(duì)于去阻抑的相似機(jī)制。將所有數(shù)據(jù)和假設(shè)放在一起，JOY7啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，并且?guī)追N(正和負(fù)作用)轉(zhuǎn)錄因子的推定結(jié)合位點(diǎn)揭示了高協(xié)同的機(jī)制，其能夠整合多種信號(hào)用于啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。VI)爿OY7啟動(dòng)子的PCR誘變此處已經(jīng)證明在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的核心序列內(nèi)的特定突變導(dǎo)致它們的效應(yīng)力(effectorforce)的顯著改變。假定少數(shù)激活子和阻抑物蛋白作用于JOY7啟動(dòng)子以導(dǎo)致其非常強(qiáng)的調(diào)節(jié)(在葡萄糖條件下幾乎無(wú)活性，在曱醇中非常高的活性)。因此^ao啟動(dòng)子的隨機(jī)誘變應(yīng)該導(dǎo)致幾種啟動(dòng)子變體，所述啟動(dòng)子變體具有破壞的或減少的阻抑物結(jié)合位點(diǎn)活性。進(jìn)行具有不同突變率的一系列PCR反應(yīng)。將所得啟動(dòng)子變體轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GFP-ZeoMutsA9菌抹中，其中將JOW基因用GFP-Zeo菌林取代。由誘變的啟動(dòng)子變體取代野生型^QA7啟動(dòng)子應(yīng)該以特定的比率發(fā)生。在MD-Zeo瓊脂平板上篩選當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖時(shí)具有較高表達(dá)率的啟動(dòng)子變體。涂布到含有100pg/mlZeocirv^的MD瓊脂平板上導(dǎo)致平板帶有巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的斑點(diǎn)并且無(wú)明顯的單菌落。似乎選擇壓力不足以阻抑野生型菌林的生長(zhǎng)。盡管當(dāng)葡萄糖存在時(shí)在巴斯德畢赤酵母GFP-ZeoMutsA9菌抹中不能檢測(cè)到熒光，少數(shù)GFP-Zeo蛋白可能在賦予ZeocinW抗性的細(xì)胞中表達(dá)。為了測(cè)試用于GFP-ZeoMutsA9菌抹生長(zhǎng)抑制的較高的Zeocin濃度，進(jìn)行如前所述的液滴測(cè)試。能夠在圖6中清楚地看出，增加至200pg/ml不減少巴斯德畢赤酵母菌才朱的細(xì)胞生存力(與100jug/ml相比)，但增加至500Mg/ml則減少，所述巴斯德畢赤酵母菌^:朱攜帶在爿aY7啟動(dòng)子控制下的GFP-Zeo基因。期望的是啟動(dòng)子誘變應(yīng)該僅導(dǎo)致輕樣"曾加的表達(dá)水平，因此500ng/mlZeocin的選擇壓力似乎太高。最終選擇350嗎/ml用于誘變啟動(dòng)子變體的所有進(jìn)一步篩選。由于涉及許多啟動(dòng)子區(qū)的非常復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，使用高誘變率的隨機(jī)誘變方法是有利的。實(shí)施例2:啟動(dòng)子缺失的產(chǎn)生基于實(shí)施例1的結(jié)果，產(chǎn)生第二代缺失變體。相對(duì)于第一系列，在這些新的缺失構(gòu)建體中，僅將推定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的小并且特異性的序列延伸(5-15bp)缺失(表15)。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula>才才泮+和方法a)誘變使用根據(jù)Wang等[34]的兩階段定位誘變規(guī)程導(dǎo)入所有缺失。在第一步中，評(píng)估兩種單獨(dú)的反應(yīng)(一種用于正向引物而一種用于反向引物)(100ngpAOX模板，15pmol引物，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2002.5U尸/"WfraTM聚合酶，總體積50pi,在合適的緩沖條件中)。將這兩個(gè)PCR反應(yīng)的25jLil組合并進(jìn)行第二PCR反應(yīng)步驟。將1piD/"I限制酶(IOu/pil)添加至30pl第二PCR反應(yīng)步驟中并且在37°C溫育1小時(shí)。將1-5|ilZ);"I消化的PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞[16]中并且在SOC培養(yǎng)基中的1小時(shí)再生時(shí)間之后涂布于LB-Amp平板上。表16:用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失的定位誘變的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>b)巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化和克隆的表征制備如上所述構(gòu)建的質(zhì)粒并如實(shí)施例1所述轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母中。結(jié)果和討論觀察到實(shí)施例2的短突變對(duì)表達(dá)水平的強(qiáng)烈影響，如已經(jīng)描述的實(shí)施例1的較大缺失一樣，其中所有突變對(duì)于啟動(dòng)子活性具有顯著的正或負(fù)效應(yīng)。特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的短缺失對(duì)于啟動(dòng)子活性具有強(qiáng)烈的影響并且給出關(guān)于獨(dú)立調(diào)節(jié)位點(diǎn)(例如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))調(diào)節(jié)性質(zhì)的更加精確的信息。特別感興趣的是Gcrl,因?yàn)槠浣Y(jié)合位點(diǎn)包括在A6缺失中。pAOXA6缺失突變體啟動(dòng)子區(qū)的測(cè)序和巴斯德畢赤酵母克隆基因組DNA的菌落PCR產(chǎn)物揭示了啟動(dòng)子區(qū)中額外的缺失(缺失SEQIDNo.1的核苷酸737至738(-217至-216))。由于這種啟動(dòng)子變體導(dǎo)致增強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，因而在去阻抑條件下產(chǎn)生較高的表達(dá)率，所以能夠?qū)㈩~外的突變導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子以增加在這些條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)。具有額外缺失(缺失SEQIDNo.1的核苷酸736至741(-218至-213))的QA-1F克隆的啟動(dòng)子活性與不具有這種額外缺失的AQA-1F啟動(dòng)子相比顯著不同活性從30。/。(去阻抑)和100。/。(誘導(dǎo))的野生型活性(AOX1AQA-1F,參見表15)分別改變至140。/。和70。/。(AOXlAQA-lFzus,參見表15)。這6個(gè)核苷酸的額外缺失看起來(lái)對(duì)啟動(dòng)子活性具有劇烈的影響。因此通過如上所述的定位誘變規(guī)程導(dǎo)入攜帶這種突變(A736-741)的新啟動(dòng)子變體。在這個(gè)區(qū)域兩種突變偶然(accidentially)并且獨(dú)立地出現(xiàn)兩次，這導(dǎo)致去阻抑條件下啟動(dòng)子活性的增加。值得注意的是雖然在兩種構(gòu)建體中存在第二種并且最可能是負(fù)影響的突變，但是存在啟動(dòng)子活性的增加。與單缺失相似通過重疊延伸PCR產(chǎn)生A2和A6的組合(A2A6)。表17清減少。由于與前述的厶6*構(gòu)建體相比，在這種構(gòu)建體中不存在額外的TA缺失，這個(gè)結(jié)果支持以下推測(cè)偶然發(fā)生的額外突變(A737-38)是碳饑餓時(shí)啟動(dòng)子活性增加的原因。幾種缺失導(dǎo)致啟動(dòng)子活性顯著的減少(例如Hsf,還有Hapl和Hap2345J)。這些推定的結(jié)合位點(diǎn)是序列重復(fù)的出眾的靶物，所述序列重復(fù)應(yīng)導(dǎo)致啟動(dòng)子活性的增加。有趣的是,在通過定位誘變產(chǎn)生的A736-741變體的4種克隆中的2種中，在位置552至560(-402至-394)存在9核苷酸(TTGGTATTG)的新缺失。缺失存在于不同區(qū)域的效果也存在于AHsf—2構(gòu)建體中。由于局部序列同源性這種效果是期望的。因此這種額外的缺失區(qū)域(A552-560、A737-38和A736-41)和緊密鄰近的序列(上游和下游5bp)也是推定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并且因此是用于缺失和重復(fù)的高度感興趣的靶物。缺失變體A736-41導(dǎo)致在曱醇誘導(dǎo)條件下表達(dá)水平更大的減少。多拷貝菌才朱在多數(shù)情況下，產(chǎn)生多拷貝菌抹導(dǎo)致GFP-Zeo超表達(dá)菌抹。在許多情況下，這些菌株主要在曱醇誘導(dǎo)條件下具有高于(16*10菌抹的表達(dá)水平。多拷貝菌抹的產(chǎn)生可以使用幾種構(gòu)建體完成，特別使用厶6*構(gòu)建體，雙缺失d2d6，包括Al、A2和厶6*缺失的構(gòu)建體，以及例如Gcrl、Rapl、abaA、Hap2345—1，還有例如QA-1F、Adrl、Hsf_2—MatlMC和Hsf—2—Hap2345—1(參見圖7)。在這些菌抹中，存在在誘導(dǎo)條件下與d6*F10菌抹相比較高的表達(dá)率。相反d6*F10菌林能夠在去阻抑條件下比已知產(chǎn)生的任何其它菌林產(chǎn)生更多的GFP-Zeo。將厶6*構(gòu)建體重復(fù)地轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母中導(dǎo)致高數(shù)量的多拷貝菌屬，所述多拷貝菌抹具有與46*10菌林相當(dāng)?shù)幕钚裕貏e在去阻抑條件下(圖8)。使用野生型啟動(dòng)子構(gòu)建體，觀察到與使用啟動(dòng)子變體相比低得多的多拷貝菌抹(例如E2菌抹)的頻率。盡管分析了多2-4倍的轉(zhuǎn)化體，最佳轉(zhuǎn)化體E2的表達(dá)水平僅是單拷貝轉(zhuǎn)化體的兩倍?？偠灾D(zhuǎn)化啟動(dòng)子變體導(dǎo)致較高的多拷貝菌抹頻率，并且這些菌抹是比多拷貝野生型啟動(dòng)子菌抹更多產(chǎn)的。實(shí)施例3:可供選擇的報(bào)告蛋白為了測(cè)試對(duì)于其它基本上良好表達(dá)的和工業(yè)相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如酶)的所有GFP-Zeo結(jié)果的實(shí)用性，將一些啟動(dòng)子變體克隆到這些報(bào)告酶(例如尸aHNL5a和HRP)之前?？寺?dòng)子變體克隆到載體pPICZaB-HRP-WT[35]和pGAPZA-戶aHNL5a中。為了pPICZaB-HRP-WT中的啟動(dòng)子交換，將iVcfel限制位點(diǎn)通過定位誘變(IOOng載體作為模板，引物NdelPICZfor和NdelPICZrev—參見表18)插入到啟動(dòng)子的5，端。將所得載體稱為pPICZaB-MM-HRP-WT。表18:用于在pPICZaB-HRP-WT中引入AWei限制位點(diǎn)和用于啟動(dòng)子交換的定位誘變的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>對(duì)于pGAPZA-尸aHNL5a表達(dá)克隆，首先將PaHNL5a基因從pfflL-D2載體(Glieder,A.，etal.Angew.ChemieInt.Ed.2003)克隆至pGAPZA載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pGAPZA-尸aHNL5a?？梢灾苯釉凇阠oRI/Bg/II消化pGAPZA-PaHNL5a和pAOXA質(zhì)粒之后將啟動(dòng)子變體克隆到pGAPZA-PaHNL5a中。為了pPICZaB-MM-HRP-WT中的交換，將啟動(dòng)子變體通過PCR擴(kuò)增，所述PCR使用引物AOXINDEI和AOXlrev(參見表18,10ngpAOXA，10pmol引物AOXINDEI和AOXlrev,200的每種dNTP，0.6uPhusion聚合酶在合適的緩沖條件中，并且總體積為50nl)。將PCR產(chǎn)物和pPICZaB-A^el-HRP-WT質(zhì)粒使用A^el/歷m/in限制位點(diǎn)克隆。轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)和酶試驗(yàn)(enzymeassay):對(duì)于巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化，將所有HRP載體通過A^el線性化，并且將所有尸aHNL5a質(zhì)粒通過Bg/II線性化。如實(shí)施例1中所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。同樣如實(shí)施例1中所述進(jìn)行巴斯德畢赤酵母菌林的生長(zhǎng)，僅有少數(shù)不同。將初始BMD(1%)的量增加至350(al,并且在60小時(shí)之后取100pl培養(yǎng)物用于離心(4000rpm、4。C、10min)。完全如實(shí)施例1中所述進(jìn)行曱醇誘導(dǎo)。取50|ul(去阻抑)或10pl(誘導(dǎo))來(lái)自離心的上清液進(jìn)行HNL試驗(yàn)，并且兩種情況下均取15pi用于HRP試驗(yàn)。HRP試驗(yàn)(根據(jù)[35]):將15jal上清液添加至PS樣t量滴定板內(nèi)50mMNaOAc緩沖液pH4.5中的150pillmMABTS/2、9mMH202中。在SpectramaxPlus384平板讀數(shù)器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)中于405nrn跟蹤吸收5分鐘。HNL試驗(yàn)(根據(jù)[36]):將50|il或10pi上清液添加至UV-Star微量滴定板中100或140pi0.05M石粦酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液pH5.0中。通過添加50pi0.06M杏仁腈(mandelonitrile)溶液(溶于0.003M磷酸鹽-杼檬酸鹽緩沖液，pH3.5)來(lái)起始反應(yīng)，并且在SpectramaxPlus384平板讀數(shù)器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA，USA)中于280nm跟蹤5分鐘。結(jié)果和討論使用可供選擇的報(bào)導(dǎo)蛋白尸aHNL5a和HRP的結(jié)果清楚地顯示使用GFP-Zeo檢測(cè)的啟動(dòng)子活性的可轉(zhuǎn)移性(表17)。由于HRP試驗(yàn)的較低的敏感性，在去阻抑條件的表達(dá)水平低于檢測(cè)極限。因此在去阻抑條件下不能測(cè)定HRP表達(dá)。表17:具有可供選擇的報(bào)告酶的幾種^a\7啟動(dòng)子變體的啟動(dòng)子活性(將A別為_tP日;h^知;杏&、^If4刑引用在括號(hào)內(nèi))<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>n.d.無(wú)法4僉測(cè)為了將多拷貝選擇轉(zhuǎn)移至可供選擇的報(bào)告體系，將JQA7啟動(dòng)子變體克隆到合適的HRP和尸aHNL5a質(zhì)粒中的Zeocin抗性基因之前，由此取代TEF1啟動(dòng)子。實(shí)施例4:可供選擇的報(bào)告蛋白GFP為了測(cè)試具有GFP的啟動(dòng)子變體，將實(shí)施例l和2中所述的啟動(dòng)子變體克隆到環(huán)-3-GFP基因之前。克隆將載體pAOX中環(huán)-3-GFP中的內(nèi)部BawHI和J^TzoI限制位點(diǎn)通過定位誘變?nèi)笔?，所述定位誘變使用引物Bam-del-f和Xho-del-f(表19)和100ng載體作為模板。使用引物GFP-Zeoforw(S叫.IDNo.4,表7,10pmol)和wtGFP-XhoI-r(表19，10pmol)和Phusion聚合酶，在合適的條件下通過PCR從所得質(zhì)粒(IOng)擴(kuò)增GFP片段。可以使用￡coRI/^oI的限制切割并且使用T4DNA連接酶連接將所得的PCR產(chǎn)物克隆到載體pPICZB中。將所得質(zhì)粒命名為pPICZ-GFP。將所有啟動(dòng)子變體克隆到pPICZ-GFP中能夠直接在5g/II/￡coRI消化pPICZ-GFP和pAOXA質(zhì)粒后進(jìn)行。表19:用于載體pAOX中環(huán)-3-GFP定位誘變和其GFP片段擴(kuò)增的引物名稱序列(5，->3，)Seq.IDNo.Bam-del-fcgccacaacattgaagatggttccgttcaactagcagaccattatc87Xho-del-fggaaacattctcggacacaaacttgagtacaactataactcacacaatg88wtGFP-XhoI-ratctcgagttacttgtacaattcatccatgccatgtgtaatccc89轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)和GFP4企測(cè)為了巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化，將所有質(zhì)粒通過Bg/II線性化。如實(shí)施例1中所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化和2小時(shí)的再生階段之后，將細(xì)胞涂布在含有100pg/mlZeocin的YPD-Zeo瓊脂平板上。巴斯德畢赤酵母的生長(zhǎng)、曱醇誘導(dǎo)和GFP熒光的測(cè)量完全如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。結(jié)果和討論再一次，使用GFP作為報(bào)告系統(tǒng)的結(jié)果顯示使用GFP-Zeo檢測(cè)的啟動(dòng)子活性的可轉(zhuǎn)移性(表20)。多拷貝菌林如實(shí)施例1和2中所述，使用Zeocin作為選擇標(biāo)記的多拷貝菌抹的發(fā)生是非常普遍的。能夠通過將選擇平板上Zeocin的濃度分別增加至500和1000pg/ml來(lái)極大地增加多拷貝菌抹的頻率。表20:具有GFP和GFP-Zeo作為報(bào)告基因的幾種爿(9Z7啟動(dòng)子變體與相同條件(分別是去阻抑和誘導(dǎo))下野生型啟動(dòng)子相比的相對(duì)啟動(dòng)子活性GFPGFP-Zeo啟動(dòng)子變體菌抹曱醇菌抹曱醇No.RFUNo.RFUWTEl100%D2100%AHaplC989%A284%Al4E679%A9134%Al畫38-F1275%D567%A2G1237%F240%ARaplD627%B934%A3H326%H270%AAdrlA950%A256%A4C766%H971%△538E628%D431%AMatlMC6C231%F632%A637F579%H391%△6*Ell23%A540%AGcrlA960%A255%△7D1238%A725%AQA-1F7A3《E261%AQA-lFzus7A615%H725%A8El11%Hl17%A93E523%A1261%A2A64B1022%F321%A736-415A78.8%C66%A737-381G115.0%A38%多拷貝菌才朱八l-38B10400%△637A3650%實(shí)施例5:使用GFP的充分系(sufficiencyseries)為了在不含有幾乎全部轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的體系中測(cè)試小部分的JQA7啟動(dòng)子，將爿QA7啟動(dòng)子在位置-176和-194TATA框之前切去少數(shù)堿基對(duì)，其產(chǎn)生勤出啟動(dòng)子元件AOX176和AOX194(表21)。為了允許后續(xù)將啟動(dòng)子元件克隆到基礎(chǔ)啟動(dòng)子片段之前以及克隆基礎(chǔ)啟動(dòng)子，將^;TI和五coRI限制位點(diǎn)分別插入5'和3'端。表21:將添加到基礎(chǔ)啟動(dòng)子變體之前的基礎(chǔ)啟動(dòng)子元件AOX176和AOX194和啟動(dòng)子片段737和201-214的序列。將限制位點(diǎn)BspTI和EcoRI加下劃線。_名稱序列(5，->3，)S叫.IDNo.AOX176~~CTTAAGGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTGAAAGAATTCAOX194CTTAAGTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATA91TATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAG_ATCAAAAAACAACTAATTATTGAAAGAATTC"T^TAGCCTAACGTT~201-214CATGATCAAAATTT克隆分別4吏用引物AOXlbasalrv(表21,10pmol)和AOXbasalfWn(10pmol,AOX194)和AOX176fW(10pmol，AOX176)從pAOX(10ng)擴(kuò)增l^f出AOX1元件。使用Phusion，聚合酶(0.6u)在合適條件下在總體積50pl中進(jìn)行PCR。如上所述使用引物AOXlbasalrv和737-38AOX176通過PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子變體AOX176-737。如上所述4吏用引物AOXlbasalrv和201-214AOX176通過PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子變體AOX176-201-214?？墒褂肂g/II/五coRI的限制切割并且使用T4DNA連接酶的連接將所得PCR產(chǎn)物克隆到載體pPICZ-GFP中，由此取代野生型爿aY7啟動(dòng)子。BglIIBspTIEcoRIAGATCTCGRCTTflAGCAATCGTCTTACTTTCTAACTTTTCTTACCTTTTACATTTCAGCAATATATATATATATTTCAAGGATATACCGAATTCTCTAGAGCTGAATTCGTTAGCAGAATGAAAGATTGAAAAGJATGGAAAATGTfiAAGTCGTTATATATATATATAAftGTTCCTATATGGCTTAAG將4種寡核苷酸Leu2basallf、Leu2basal2f、Leu2basallr和Leu2basal2r(各25pmol)混入20pl的總體積，加熱至95°C持續(xù)2分鐘，并且緩慢冷卻至室溫。將3pl的混合物與159ng的pPICZ-GFP5g/II/jE:coRI片段于16。C連接6小時(shí)。在轉(zhuǎn)化入大腸桿菌之后，將所得載體稱為pLeu2basal-GFP。如上所述使用引物L(fēng)EU2basalrv和737-38Leu2，和pLeu2basal-GFP作為模板通過PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子變體Leu2-737。可使用Bg/II/五coRI的限制切割并且使用T4DNA連接酶的連接將所得PCR產(chǎn)物克隆入載體pPICZ-GFP,由此取代野生型爿0￥7啟動(dòng)子。將所得質(zhì)粒稱為pLeu2-GFP-737。表22:用于產(chǎn)生基礎(chǔ)啟動(dòng)子元件和充分構(gòu)建體(su伍ciencyconstruct)的引物名稱序列(5，^3')SeqIDNo.AOXlbasalrvTTTGAATTCTTTCAATAATTAGTTGTTTTTTG94AOX176fWTTAGATCTCGACTTAAGGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAG95AOXlbasalfwnTTAGATCTCGACTTAAGTGTTCTAACCCCTACTTGACAG%737-38AOX176AAAGATCTTAGCCTAACGTTCTTAAGGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAG97201-214AOX176AAAGATCTCATGATCAAAATTTCTTAAGGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAG98LEU2basallfGATCTCGACTTAAGCAATCGTCTTACTTTCTAACTTTTCTTACCTTTTACATTTCAG99LEU2basal2fCAATATATATATATATTTCAAGGATATACCG100LEU2basallrAATTCGGTATATCCTTGAAATATATATATATATTGCTGAAATGTAAAAG101LEU2basal2rGTAAGAAAAGTTAGAAAGTAAGACGATTGCTTAAGTCGA102LEU2basalrvGGTTGAATTCGGTATATCCTTG103737-38Leu2AAAGATCTTAGCCTAACGTTCTTAAGCAATCGTCTTACTTTCTAAC104轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)和GFP4全測(cè)對(duì)于巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化，將所有質(zhì)粒通過萬(wàn)awffl線性化。如實(shí)施例1中所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化和2小時(shí)再生階段之后，將細(xì)胞涂布在含有100pg/mlZeocin的YPD-Zeo瓊脂平板上。巴斯德畢赤酵母的生長(zhǎng)、曱醇誘導(dǎo)和GFP熒光的測(cè)定完全如實(shí)施例1中所述的進(jìn)行。結(jié)果和討論這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)施例1和2中鑒定的小元件的添加能夠用于增加基礎(chǔ)啟動(dòng)子元件的啟動(dòng)子強(qiáng)度，所述基礎(chǔ)啟動(dòng)子元件源自^OY7啟動(dòng)子或源自釀酒酵母丄五t/2啟動(dòng)子。多拷貝菌林轉(zhuǎn)化之后存在的多拷貝菌抹的發(fā)生和頻率與實(shí)施例4中所述完全相同。質(zhì)粒中線性化的不同位點(diǎn)對(duì)多拷貝菌抹的產(chǎn)生不具有任何影響。表23:不添加和添加假定作為調(diào)節(jié)物結(jié)合位點(diǎn)的小爿OY7啟動(dòng)子片段之后基礎(chǔ)啟動(dòng)子元件的啟動(dòng)子活性。將GFP用作報(bào)告蛋白。顯示單拷貝以及多拷貝菌抹。，<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>Goedecke,S.,etal.(1994)Gene139(1),35-42.[9]Tschopp,J.F"etal.(1987)NucleicAcidsRes.15(9),3859-76.[10]Parpinello,G"etal.(1998)J.Bacteriol.180(11)，2958-67.[11]Alamae,T,etal.(1994)Yeast10(11),1459-66.[12]Inan，M.etal.(2001)J.Biosci.Bioeng.92(6),585-589.[13]Sreekrishna,K.，etal.(1997)Gene190(1)，55-62.[14]Romanos,M.，etal.(1998)MethodsMol.Biol.103(55-72.[15]Quandt,K.,etal.(1995)NucleicAcidsRes.23(23)，4878-84.[16]Ausubel，F(xiàn).M.,etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,NewYork,2003.[17]Corpet,F.(1988)NucleicAcidsRes.16(22),10881-90.[18]Che皿a,R.,etal.(2003)NucleicAcidsRes.31(13)，3497-500.[19]Bennett,R.P.,etal.(1998)BioTechniques24(3)，478-82.[20]Farinas,E.T"etal.(2001)Adv.Synth.Catal.343(6)，601-606.[21]Huie,M.A.etal.(1996)Yeast12(4)，307-17..[22]Lopez,M.C.,etal.(1998)PNASU.S.A.95(24)，14112-7.[23]Zeng,X.,etal.(1997)Genetics147(2),493-505.[24]DelVescovo，V"etal.(2004)J.Mol.Biol.338(5)，877-93.[25]Simon,M.,etal.(1992)Yeast8(4),303-9.[26]Raschke，W.C.,etal.(1996)Gene177(1-2)，163-7.[27]Andrianopoulos,A.etal.(1994)Mol.Cell.Biol.14(4),2503-15.[28]Kwast，K.E.,etal.(1998)J.Exp.Biol.201(Pt8)(1177-95.[29]Bourgarel,D.,etal.(1999)Mol.Microbiol.31(4)，1205-15.[30]Dang,V.D.，etal.(1996)J.Bacteriol.178(7),1842-9.[31]Hahn，J.S.etal.(2004)J.Biol.Chem.279(7),5169-76.[32]WO02/081650[33]US6,699,691[34]Wang,W.etal.(1999)Biotechniques26(4)，680-2.[35]Morawski，B.,etal.(2000)ProteinEng13(5)，377-84.[36]Weis,R.,etal.(2004)FEMSYeastRes.5,179—189.序列表SeqIDNo.l:巴斯德畢赤酵母啟動(dòng)子的ggtaccagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattgaaagaattcaacc權(quán)利要求1.野生型巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(AOX1)啟動(dòng)子(SEQIDNo.1)的突變巴斯德畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子，其包含選自下組的至少一種突變a)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)，b)SeqIDNo.1的核苷酸170至235(-784至-719)、核苷酸170至191(-784至-763)、核苷酸192至213(-762至-741)、核苷酸192至210(-762至-744)、核苷酸207至209(-747至-745)、核苷酸214至235(-740至-719)、核苷酸304至350(-650至-604)、核苷酸364至393(-590至-561)、核苷酸434至508(-520至-446)、核苷酸509至551(-445至-403)、核苷酸552至560(-402至-394)、核苷酸585至617(-369至-337)、核苷酸621至660(-333至-294)、核苷酸625至683(-329至-271)、核苷酸736至741(-218至-213)、核苷酸737至738(-217至-216)、核苷酸726至755(-228至-199)、核苷酸784至800(-170至-154)或核苷酸823至861(-131至-93)，和它們的組合。2.根據(jù)權(quán)利要求1的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子還包含SeqIDNo.1的核芬酸694至723(-260至-231)和/或核香酸729至763(-225至-191)的突變。3.根據(jù)權(quán)利要求l或2的啟動(dòng)子，其特征在于所述突變是缺失、取代、插入、倒位和/或倍增。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的啟動(dòng)子，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)選自下組Hapl、Hsf、Hap234、abaA、Stre、Rapl、Adrl、MatlMC、Gcrl和QA-1F。5.根據(jù)權(quán)利要求4的啟動(dòng)子，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)Hapl包含SeqIDNo.1的核芬酸54至58，Hsf包含SeqIDNo.1的核苦酸142至149和517至524,Hap234包含S叫IDNo.1的核苷酸196至200、206至210和668至672,abaA包含SeqIDNo.1的核芬酸219至224，Stre包含SeqIDNo.1的核苦酸281至285，Rapl包含SeqIDNo.1的核苷酸335至339，Adrl包含SeqIDNo.1的核苷酸371至377,MatlMC包含SeqIDNo.1的核苦酸683至687，Gcrl包含SeqIDNo.1的核苷酸702至706和QA-1F包含SeqIDNo.1的核芬酸747至761。6.核酸分子，包含根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的至少一種突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(AOXl)啟動(dòng)子和編碼蛋白質(zhì)(肽)或功能性核酸的至少一種核酸，其特征在于所述啟動(dòng)子和所述核酸可操作地連接在一起形成單或多拷貝表達(dá)盒。7.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(A0X1)啟動(dòng)子或根據(jù)權(quán)利要求6的核酸分子。8.細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的至少一種突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(A0X1)啟動(dòng)子、根據(jù)權(quán)利要求6的至少一種核酸片段或根據(jù)權(quán)利要求7的至少一種載體。9.根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，特別是酵母細(xì)胞，優(yōu)選甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞。10.根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)胞，其特征在于所述曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬。11.根據(jù)權(quán)利要求8至IO任一項(xiàng)的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。12.用于表達(dá)所選蛋白的試劑盒，所述試劑盒包含i)根據(jù)權(quán)利要求7的載體，和ii)能夠在根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的啟動(dòng)子控制下表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其特征在于所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其特征在于所述曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬。15.根據(jù)權(quán)利要求12至14任一項(xiàng)的試劑盒，其特征在于所述細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。16.用于在細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白、肽或功能性核酸的方法，所述方法包括以下步驟-提供根據(jù)權(quán)利要求6的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求7的載體，所述核酸分子和載體包含根據(jù)權(quán)利要求l至5任一項(xiàng)的AOX1啟動(dòng)子和編碼蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的核酸，將所述啟動(dòng)子與所述核酸可操作地連接，-將所述細(xì)胞用所述載體或所述核酸分子轉(zhuǎn)化，-在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，-任選地誘導(dǎo)所述蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的表達(dá)和-分離所述表達(dá)的蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于所述甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬。19.根據(jù)權(quán)利要求16至18任一項(xiàng)的方法，其特征在于細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。20.根據(jù)權(quán)利要求6的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求7的載體或根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項(xiàng)的細(xì)胞用于表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的用途。21.用于分離超表達(dá)克隆的方法，所述方法包括以下步驟a)將包含突變曱醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核酸分子或載體引入細(xì)胞，所述曱醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子優(yōu)選A0X1啟動(dòng)子，其與編碼蛋白質(zhì)或功能性核酸的核酸和抗性標(biāo)記基因可操作地連接，b)將步驟a)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含合適的選擇標(biāo)記、非阻抑碳源和曱醇，用于在誘導(dǎo)條件下超表達(dá)克隆的選擇性生長(zhǎng)；或所述培養(yǎng)基包含合適的選擇標(biāo)記和非阻抑碳源而不含甲醇，用于超表達(dá)克隆在去阻抑條件下的選擇性生長(zhǎng)，c)在所述培養(yǎng)基上培育來(lái)自步驟b)的細(xì)胞，d)分離獲得自步驟c)的細(xì)胞的菌落，和e)通過測(cè)定所述細(xì)胞的表達(dá)率檢測(cè)超表達(dá)克隆。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于選擇標(biāo)記是抗生素，優(yōu)選Zeocin或遺傳霉素。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于選擇標(biāo)記是Zeocin，并且標(biāo)記抗性基因是shble基因。24.根據(jù)權(quán)利要求21至23任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述核酸分子是根據(jù)權(quán)利要求6的核酸分子。25.根據(jù)權(quán)利要求21至23任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述載體是根據(jù)權(quán)利要求7的載體。26.根據(jù)權(quán)利要求21至25任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞。27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于所述曱基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬。28.根據(jù)權(quán)利要求21至27任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。29.根據(jù)權(quán)利要求21至28任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述非阻抑碳源選自下組丙氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖、乳糖和它們的組合。30.根據(jù)權(quán)利要求21至29任一項(xiàng)的方法，其特征在于將核酸分子或載體通過轉(zhuǎn)化來(lái)引入細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化優(yōu)選電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)化，或通過原生質(zhì)體融合，或通過粒子轟擊。全文摘要野生型巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)醇氧化酶1(AOX1)啟動(dòng)子(SEQIDNo.1)的突變巴斯德畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子包含選自下組的至少一種突變a)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)，b)SeqIDNo.1的核苷酸170至235(-784至-719)、核苷酸170至191(-784至-763)、核苷酸192至213(-762至-741)、核苷酸192至210(-762至-744)、核苷酸207至209(-747至-745)、核苷酸214至235(-740至-719)、核苷酸304至350(-650至-604)、核苷酸364至393(-590至-561)、核苷酸434至508(-520至-446)、核苷酸509至551(-445至-403)、核苷酸552至560(-402至-394)、核苷酸585至617(-369至-337)、核苷酸621至660(-333至-294)、核苷酸625至683(-329至-271)、核苷酸736至741(-218至-213)、核苷酸737至738(-217至-216)、核苷酸726至755(-228至-199)、核苷酸784至800(-170至-154)或核苷酸823至861(-131至-93)，和它們的組合。文檔編號(hào)C12N15/00GK101128581SQ200680005888公開日2008年2月20日申請(qǐng)日期2006年2月23日優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日發(fā)明者安東·格利德,弗朗茲·哈特納申請(qǐng)人:格拉茨科技大學(xué);計(jì)劃資訊有限責(zé)任公司