專利名稱：突變的aprE啟動子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及在芽孢桿菌屬(Bacillus)物種中制備蛋白質。具體地，本發(fā)明涉及突變的aprE啟動子和其在制備蛋白質的方法中的用途。
背景技術：
遺傳工程使得可以改良用作工業(yè)生物反應器、細胞工廠和用于食品發(fā)酵中的微生物。芽孢桿菌屬物種產(chǎn)生并分泌大量的有用蛋白質和代謝物(Zukowski 1992 Zukowski MM(1992)制備具有商業(yè)價值的產(chǎn)品，DoiRH、McGlouglin M(編)《芽孢桿菌生物學工業(yè)應用》(Biology of bacilliapplications to industry)，Butterworth-Heinemann，Stoneham，Mass第311-337頁)。最常見的工業(yè)使用芽孢桿菌是地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、淀粉液化芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。而且，由于其的GRAS(一般被認為是安全的)狀態(tài)，枯草芽孢桿菌是制備食品和制藥工業(yè)中所用蛋白質的自然候選者。
枯草芽孢桿菌的aprE基因編碼細胞外蛋白酶枯草桿菌蛋白酶，一種通過生物技術工業(yè)生產(chǎn)的有價值的酶(Debadov VG(1982)芽孢桿菌的工業(yè)用途，Dubnau DA(編)《芽孢桿菌的分子生物學》(The Molecular Biologyof the Bacilli)，Academic PressNew York/London，第1卷，第331-370頁)。對使用枯草芽孢桿菌作為宿主生物的重組蛋白制備系統(tǒng)(尤其是由枯草桿菌蛋白酶啟動子驅動的那些)的開發(fā)，為在該領域中進行研究和商業(yè)生產(chǎn)提供了一個重要工具(Oyama等(1989)使用枯草桿菌蛋白酶Amylosacchariticus的前原結構編碼區(qū)在枯草芽孢桿菌中分泌大腸桿菌的氨肽酶P，J.Ferment.Bioeng.68289-292)。盡管枯草桿菌蛋白酶的合成對于孢子形成是不必需的(Stahl和Ferrari(1984)用體外來源的缺失突變體置換枯草芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶結構基因，J.Bacteriol.158411-418)，但通過負責起始孢子形成的那些事件所共同的機制可以觸發(fā)其產(chǎn)生，并由此成為發(fā)育相關的基因表達模型(Sonenshein AL(1989)孢子形成的代謝調節(jié)和其它穩(wěn)定期現(xiàn)象，Smith，I，Slepecky RA，Setlow P(編)《原核生物發(fā)育的調節(jié)》(Regulation ofProcaryotic Development)，American Society for Microbiology，Washington，DC第109-130頁)。aprE基因是由西格馬A(σA)轉錄的而且其表達受到幾種調節(jié)物的高度控制，這些調節(jié)物例如DegU/DegS、AbrB、Hpr和SinR(Valle和Ferrari(1989)Smith I，Slepecky RA，Setlow P(編)《原核生物發(fā)育的調節(jié)》，American Society forMicrobiology，Washington，DC第131-146頁)。共有的西格馬A啟動子已得到鑒定(Helman等，1995，Nucleic Acid Research，第23卷，第2351-2360頁)。盡管對于蛋白質在宿主細胞中的產(chǎn)生的理解已有進展，但仍需要方法以增加蛋白質在宿主細胞如芽孢桿菌宿主細胞中的表達。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及突變aprE啟動子在蛋白質制備中的用途。本發(fā)明的基礎是以下未預料到的發(fā)現(xiàn)，即在含有該突變aprE啟動子的宿主細胞中目的蛋白質的產(chǎn)生增加了100倍。本發(fā)明還基于以下未預料到的發(fā)現(xiàn)，即具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的突變aprE啟動子能夠增強異源和同源蛋白質的轉錄并且在蛋白質的產(chǎn)生過程中仍是可調節(jié)的。因此，本發(fā)明提供分離的突變aprE啟動子，在另一實施方案中提供具有SEQ ID NO1所給核苷酸序列的分離的突變aprE啟動子。本發(fā)明還提供包含分離的突變aprE啟動子的宿主細胞和使用該宿主細胞生產(chǎn)目的蛋白質的方法。在一個實施方案中，宿主細胞是芽孢桿菌屬物種，在另一實施方案中，該芽孢桿菌屬物種包括地衣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、淀粉液化芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。在另一實施方案中，目的蛋白質是枯草桿菌蛋白酶。
在再一實施方案中，包含分離的突變aprE啟動子、尤其是SEQ IDNO1的分離的突變aprE啟動子的宿主細胞，還包含編碼對于宿主細胞可以是同源或異源的目的蛋白質的核酸。該核酸可以編碼治療上有意義的蛋白質或肽，例如生長因子、細胞因子、配體、受體和抑制劑、以及疫苗和抗體。該核酸可以編碼商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質或肽，例如蛋白酶(包括枯草桿菌蛋白酶)、糖酶如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂酶。該核酸可以是天然存在的基因、突變基因或合成基因。工業(yè)蛋白質的例子包括酶如包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶和脂酶在內的水解酶；異構酶如消旋酶、差向異構酶、互變異構酶(tautomerases)、或變位酶；轉移酶、激酶和磷酸酶。在一個實施方案中，該蛋白質與細胞異源，在另一實施方案中其與細胞同源。在本文所公開的一個舉例說明性實施方案中，該蛋白質是β-半乳糖苷酶，在本文所公開的另一舉例說明性實施方案中，該蛋白質是枯草桿菌蛋白酶。
本發(fā)明提供在芽孢桿菌屬物種中制備目的蛋白質的方法，包括培養(yǎng)包含分離的aprE啟動子的芽孢桿菌，所述芽孢桿菌還包含編碼該目的蛋白質的核酸；和任選地回收所述目的蛋白質。在一個實施方案中，該分離的突變aprE啟動子具有SEQ ID NO1所示序列。在該方法的一個實施方案中，所述編碼目的蛋白質的核酸整合在芽孢桿菌的基因組中，在另一實施方案中，編碼目的蛋白質的核酸存在于復制型質粒上。本發(fā)明還提供方法以制備包含分離的突變aprE啟動子的宿主細胞。
附圖簡述

圖1是野生型和突變型aprE啟動子的DNA序列比較，虛線箭頭指示了突變的堿基(僅繪出了aprE調節(jié)區(qū)的相關序列)。通過雙頭箭頭指示出-35和-10盒的間隔。還顯示了所形成的mRNA的第一個堿基。
圖2顯示了通過SDS-PAGE檢測到的JJ6菌株中β-半乳糖苷酶的合成。每個泳道上方的數(shù)字代表在特定間隔期(小時)時采取的樣品，因此是具有特定表達時間的樣品(見正文)。使用LacZ蛋白質(116kDa)作為分子標記。
圖3是說明命名為OS4的PCR融合序列構建的示意圖。
詳述定義野生型形式的aprE啟動子是指RNA聚合酶識別并用以起始轉錄的區(qū)域，其包括圖1所示位于-35和-10的兩個盒。圍繞-35和-10盒顯示的其它元件，例如-35和-10盒間的間隔區(qū)、和-10盒的下游(3’)向下至+40的區(qū)域對于啟動子的強度起著重要作用。正如本文所用，術語“突變的aprE啟動子”是指在-35盒中具有修飾的aprE啟動子，該啟動子還可以在間隔區(qū)中、-35盒上游區(qū)域、-10盒中及-10盒下游區(qū)域具有額外的修飾。在一個優(yōu)選實施方案中，突變aprE啟動子具有命名為SEQ ID NO1的序列TGGGT CTTGA CAAAT ATTAT TCCAT CTATT ACAAT AAATT CACAGA。突變aprE啟動子是增強按每單位時間產(chǎn)生的mRNA分子數(shù)量測量的轉錄頻率的啟動子。
正如本文所用，芽孢桿菌屬包括本領域技術人員已知的所有成員，包括但不限于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
正如本文所用，“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列、和其片段或部分、以及基因組來源的或合成來源的DNA或RNA，其既可以是雙鏈也可以是單鏈，而且不論其是有義鏈還是反義鏈。正如本文所用，“氨基酸”是指肽或蛋白質序列或其部分。
術語“分離的”或“純化的”在本文中是指除去其天然相關的至少一個成分的核酸或氨基酸。
正如本文所用，術語“異源蛋白質”是指非天然存在于革蘭氏陽性宿主細胞中的蛋白質或多肽。異源蛋白質的例子包括酶如包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶和脂酶在內的水解酶；異構酶如消旋酶、差向異構酶、互變異構酶或變位酶；轉移酶、激酶和磷酸酶。該蛋白質可以是治療上有意義的蛋白質或肽，例如生長因子、細胞因子、配體、受體和抑制劑、以及疫苗和抗體。該蛋白質可以是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質或肽，例如蛋白酶、糖酶如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂酶。編碼該蛋白質的基因可以是天然存在的基因、突變基因或合成基因。
術語“同源蛋白質”是指革蘭氏陽性宿主細胞自身或天然存在的蛋白或多肽。本發(fā)明包括通過重組DNA技術產(chǎn)生同源蛋白質的宿主細胞。本發(fā)明包括在編碼該同源蛋白如蛋白酶的天然核酸中具有缺失或中斷的芽孢桿菌宿主細胞，該細胞中以重組形式重新導入了編碼該同源蛋白質或其變體的核酸。在另一實施方案中，該宿主細胞產(chǎn)生同源蛋白質。
優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明涉及突變aprE啟動子在制備蛋白質的方法中的用途。aprE在指數(shù)生長結束、當達到最大生物質時，以自然方式被誘導，從而使突變和質粒分離的可能性最小化。自然誘導避免了對人為誘導劑的需要，例如那些基于IPTG、氧等化學物質的系統(tǒng)(Walsh K，Koshland DE Jr.(1985))、或通過熱進行的物理誘導(Bujard等，1983)。由于其在發(fā)酵過程中應用的簡單性，aprE基因的這種自然誘導尤其對于大的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)有著重要的經(jīng)濟優(yōu)點。
aprE啟動子序列在-10和-35盒之間有17bp，而且其-10盒位于距轉錄起始位點6bp的位置。構建攜帶如下特定突變的菌株，其中所述特定突變影響i)aprE’-lacZ mRNA的轉錄起始速率，和ii)aprE’-枯草桿菌蛋白酶mRNA的轉錄起始速率。而且，我們還分析了hpr2和degU32背景的作用。對這些突變的每一個的各自作用及它們的選擇的組合進行了檢測。
通過將aprE啟動子中的天然-35盒序列改變?yōu)門TGACA序列，β半乳糖苷酶活性增加了100倍以上而枯草桿菌蛋白酶的活性增加了30倍以上。不受理論的束縛，該修飾似乎使RNAP更易于識別該啟動子區(qū)域，由此促進了開放復合物的形成并增加了其形成的速率。
在一個優(yōu)選實施方案中，芽孢桿菌屬物種是經(jīng)遺傳改造包含具有SEQID NO1所示序列的突變aprE啟動子和編碼目的蛋白質或多肽(如蛋白酶或其它酶)的核酸的枯草芽孢桿菌。在其它實施方案中，芽孢桿菌宿主細胞還在內源性蛋白酶(如Apr、Npr、Epr、Mpr、或本領域技術人員已知的其它蛋白酶)中包含突變或缺失。
本發(fā)明提供用于在芽孢桿菌屬物種中增加產(chǎn)生和分泌目的異源或同源蛋白質的宿主細胞、表達方法和系統(tǒng)。在一個實施方案中，宿主細胞經(jīng)遺傳改造包含突變的aprE啟動子、尤其是具有SEQ ID NO1所示序列的突變aprE啟動子，并還包含編碼目的蛋白質或多肽的核酸。編碼目的蛋白質的核酸可以整合在宿主細胞的基因組中或在復制型質粒上提供。對于芽孢桿菌適當?shù)膹椭菩唾|粒描述在芽孢桿菌的分子生物學方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)(Harwood和Cutting編，John Wiley & Sons，1990)中，該文獻特此并入作為參考；見關于質粒的第3章。
在該文獻中描述幾種在芽孢桿菌中直接克隆DNA的策略。質粒標記拯救轉化包括由攜帶部分同源居住質粒(resident plasmid)的感受態(tài)細胞攝取供體質粒(Contente等，Plasmid 2555-571(1979)；Haima等，Mol.Gen.Genet.223185-191(1990)；Weinrauch等，J.Bacteriol.154(3)1077-1087(1983)；和Weinrauch等，J.Bacteriol.169(3)1205-1211(1987))。進入的供體質粒與居住的“輔助”質粒的同源區(qū)域在模擬染色體轉化的過程中重組。
通過原生質體進行的轉化，對于枯草芽孢桿菌，描述在Chang和Cohen(1979)Mol.Gen.Genet 168111-115；對于巨大芽孢桿菌(B.megaterium)，描述在Vorobjeva等(1980)FEMS Microbiol.Letters7261-263；對于淀粉液化芽孢桿菌，描述在Smith等(1986)Appl.andEnv.Microbiol.51634；對于蘇云金芽孢桿菌，描述在Fisher等(1981)Arch.Microbiol.139213-217；對于球形芽孢桿菌(B.sphaericus)，描述在McDonald(1984)J.Gen.Microbiol.130203；和對于幼蟲芽孢桿菌(B.larvae)，描述在Bakhiet等(1985)49577。Mann等(1986，Current Microbiol.13131-135)報道了芽孢桿菌原生質體的轉化，而Holubova((1985)Folia Microbiol.3097)公開了使用含有DNA的脂質體將DNA導入原生質體中的方法。
實施本發(fā)明的方式和方法可以通過參考以下實施例更完整地為本領域技術人員所理解，這些實施例并不任何方式對本發(fā)明的范圍或權利要求書的范圍構成限制。
實施例1材料和方法aprE基因轉錄調節(jié)區(qū)的定點誘變通過將來自質粒pSG35.1(Ferrari E，Henner DJ，Perego M，HochJA(1988)枯草芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的轉錄和孢子形成突變體中枯草桿菌蛋白酶的表達，J.Bacteriol.170289-295)的、含有aprE啟動子和結構基因頭8個密碼子的509堿基對(bp)EcoRI-BamHI片段，克隆在質粒pT7(Novagen)中，構建質粒pT7-aprE。此新質粒用作模板，根據(jù)Merino等(1992)一種在pUC/M13載體上進行單個或組合的寡核苷酸指導的誘變的一般基于PCR的方法(Biotechniques 12509-510)所描述的實驗方案，進行單個或組合寡核苷酸指導的PCR誘變。使用Taq DNA聚合酶(Promega Co.)在Perkin Elmer PCR系統(tǒng)中進行PCR。引入5’aprE調節(jié)區(qū)中的核苷酸替代如下A-34→T、C-33→G、T-32→A、A-31→C、A-12→G、G+1→A。PCR誘變的終產(chǎn)物通過使用Sanger等(1977)描述的雙脫氧鏈終止法確定核苷酸序列得以驗證。用EcoRI和BamHI消化這些DNA，并將其克隆在整合型質粒pSG-PLK的相同限制性位點中。質粒pSG-PLK是pSG35.1的衍生物，其中EcoRI-BamHI區(qū)被來自pUC19的多聚接頭置換，留下無啟動子的lacZ基因。pSG-PLK中的這個改變使得可以較為容易地選擇轉化子，因為鋪在X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖)瓊脂上的菌落僅在它們攜帶有aprE啟動子的時候才可是藍色的。表1提供了構建的枯草芽孢桿菌的索引。
表1
縮寫cat，氯霉素乙酰轉移酶基因；amyE-前部，amyE基因的5’末端。
實施例II轉錄起始野生型aprE調節(jié)區(qū)(rraprE-WT)的特征包括在其-10盒中具有幾乎完善的σA共有序列(TAcAAT)的啟動子；-35區(qū)僅具有共有序列6核苷酸的兩個(TactaA)；-10和-35區(qū)之間存在17bp；而且-35盒上游存在一個AT豐富的序列，該序列對于RNA聚合酶(RNAP)α亞基的識別是重要的(Ross等，1993，細菌啟動子中的第三個識別元件由RNA聚合酶α亞基結合的DNA，Science 2621407-1413。)?；谶@些特征，在該啟動子區(qū)的-35區(qū)進行定點誘變，以便獲得為枯草芽孢桿菌的σA因子所識別的基因的-35共有區(qū)?？紤]到aprE調節(jié)區(qū)的-35區(qū)僅具有存在于共有序列中的6個核苷酸中的兩個，故引入4個核苷酸改變(ACTA-34至-31→TGAC)。此修飾的調節(jié)區(qū)在本文中命名為rraprE-TTGACA。將此突變體克隆在lacZ報道基因的上游并使其整合在枯草芽孢桿菌染色體的amy座位中，產(chǎn)生菌株JJ1。測試該菌株的β-半乳糖苷酶活性；-35啟動子盒的修飾導致它的β半乳糖苷酶活性與攜帶aprE野生型啟動子的親本BSR6菌株相比增加了106倍(見表2和圖2)。
表2
表2顯示了不同菌株中獲得的β半乳糖苷酶水平比較。
A.所示值是三次獨立實驗的平均值。所測定的活性是從aprE’-lacZ融合物表達的β-gal。
實施例IIIhpr2和degU32背景對aprE’-lacZ表達的影響已有報道，hpr2突變可增加枯草桿菌蛋白酶的表達水平。該突變是在該359bp結構基因的DNA區(qū)段中具有一個缺失，該缺失導致其活性降低65％(Perego和Hoch 1988，一種枯草芽孢桿菌中蛋白酶產(chǎn)生和孢子形成的調節(jié)基因，hpr座位的序列分析和調節(jié)，J.Bacteriol.1702560-2567)。degU32是由A2006→T的替代組成的突變，該突變將該蛋白質第12位的氨基酸從組氨酸殘基改變?yōu)榱涟彼釟埢?Henner等，1988，枯草芽孢桿菌sacU(Hy)突變定位在類似于兩組分信號轉導系統(tǒng)的保守原核生物家族的兩個相連基因上，J.Bacteriol.1705120-9)。此突變增加了DegU-PO4態(tài)，因此其可使其激活作用持續(xù)較長的時間。
為了構建超量生產(chǎn)菌株，將hpr2和degU32基因型以單獨和組合的方式轉移至BSR6(BSR1 amyE∷pSG35.1)和JJ1(BSR1 amyEpTTGACA)菌株中(見表1)。表2中展示了這些菌株的β半乳糖苷酶活性數(shù)據(jù)。具有hpr2突變的JJ3菌株產(chǎn)生3.3倍的增加，而JJ2菌株有1.8倍的增加。帶有degU32遺傳背景的菌株JJ5和JJ4分別有36.3和1.3倍的增加。在同時帶有degU32和hpr2遺傳背景菌株的JJ7和JJ6中獲得的活性水平，與它們的親本菌株相比分別是66和2.7倍。
在Bolanos等(2.8倍)和Olmos等(4.6倍)制備的同源菌株JJ3中獲得了類似結果(Bolanos 1994碩士論文Sobreproduccion de la enzimaβ-galactosidasa de Escherichia coli en Bacillus sublitis，Instituto de Biotechnologia，Universidad Nacional Autonoma deMexico，Cuernavaca，Mor.Mexico.；Olmos等，1996，功能性SpoOA是枯草芽孢桿菌中aprE的最大表達所必需的，F(xiàn)EBS Lett.38129-31)。hpr2突變不僅對野生型啟動子也對菌株JJ2中的修飾啟動子起作用。
盡管不愿受理論的束縛，但可以想到突變degU32和-35共有序列的改變以相似方式促進了RNAP對該啟動子序列的識別，并可以幫助和穩(wěn)定DNA-RNAP開放復合物的形成。
總之，為了構建超量生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌菌株在該方法中分析了幾個元件。最有意義的改變出現(xiàn)在將圖1所示突變啟動子序列并入aprE基因的調節(jié)區(qū)中時，產(chǎn)生菌株JJ1。該改變允許相對于本研究中被認作野生型的菌株(BSR6)出現(xiàn)100倍以上的增加。盡管菌株JJ6的β半乳糖苷酶活性達到了最大水平，但它與JJ1菌株不同的是有幾個多效作用。
實施例IV測量β半乳糖苷酶的合成本實施例舉例說明了異源蛋白β半乳糖苷酶的產(chǎn)生。
為了直接估計β半乳糖苷酶蛋白質的合成以便與在我們的超量生產(chǎn)菌株中發(fā)現(xiàn)的活性水平建立直接關系，我們通過菌株JJ6(BSR1amyE∷pTTGACA hpr2 degU32)(該菌株具有最大水平的β半乳糖苷酶活性)的SDS-PAGE分析了總蛋白譜。在Shaeffer培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株JJ6，并定期間隔采取樣品。通過超聲獲得的無細胞提取物通過SDS-PAGE進行分析，并用考馬斯亮蘭染色(圖2)。觀察到具有116kDa分子量的β半乳糖苷酶蛋白條帶。孢子形成過程在接種后5小時開始。在此時，重組蛋白開始表達并在2小時后達到其最大值，相應于總細胞內蛋白質的約10％。
實施例V本實施例描述了含有突變aprE啟動子的枯草芽孢桿菌宿主細胞的構建。修飾aprE啟動子后產(chǎn)生的細胞外蛋白酶AprE的水平通過使用菌株OS4進行定量。為了比較，在相同條件下分析了帶有野生型aprE基因的幾種其它菌株。這些菌株間的差異在于它們含有已知增加aprE表達的突變(Valle和Ferrari，同上)。
此分析的結果顯示在表3中。正如可以看到的，與野生型菌株相比，OS4菌株產(chǎn)生多32.7倍的AprE。另一方面，與帶有野生型aprE和degU、scoC突變的菌株相比，OS4菌株產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶少了50％?？紤]到表2中給出的使用lacZ表達獲得的結果，可能進一步使用hpr2和/或degU突變增加枯草桿菌蛋白酶的產(chǎn)量。使用OS4菌株獲得的這些結果說明，修飾的aprE啟動子也可以用于超量產(chǎn)生分泌至培養(yǎng)基的同源蛋白質。
本文中命名為OS4的PCR融合序列的構建在以下3個步驟中構建OS4 PCR融合序列1)通過PCR從枯草芽孢桿菌168的染色體DNA擴增2個獨立的片段；2)在PCR類型的方法中不使用引物，裝配2個純化的PCR片段；和3)使用OSBS-1和OSBS-8末端引物通過PCR擴增該裝配產(chǎn)物。
1).使用芽孢桿菌168的染色體DNA作為模板并使用2套引物，擴增aprE基因座位。第一對引物由位于芽孢桿菌染色體1101.821kb至1101.851kb間的OSBS-1(5’-ATATGTGGTG CCGAAACGCT CTGGGGTAAC-3’)SEQ ID NO2和位于1105.149kb至1105.098kb間的Stu-1(5’-CTCAAAAAAA TGGGTCTACT AAAATATTAT TCCATCTATT ACAATAAATTCA-3’)SEQ ID NO3組成。該擴增片段為3.327kb并含有以下基因截短的yhfL’、yhfM、yhfN和aprE啟動子區(qū)域，枯草芽孢桿菌基因組的描述見Kunst等，1997，Nature，第390頁，第249-256頁。
第二對引物由位于染色體1105.098kb至1105.149kb間的Stu-2(5’-TGAATTTATTGTAATAGATGGAATAATATTTTAGTAGACCCATTTTTTTGAG-3’)SEQ ID NO4和位于1107.733kb至1107.704kb間的OSBS-8(5’-CTTTTCTTCA TGCGCCGTCA GCTTTTTCTC-3’)SEQ ID NO5組成。擴增片段為2.635kb并含有以下部分aprE的啟動子區(qū)域、yhfO、yhfP和截短的yhfQ’。兩個PCR產(chǎn)物在啟動子區(qū)域重疊。使用Stu-1和Stu-2互補引物在aprE啟動子-35區(qū)中引入4個突變，其中TACTAA被TTGACA序列代替。根據(jù)廠商說明書，使用含有rTth聚合酶的Perkin ElmerGeneAmp XL PCR試劑盒進行所有的PCR。PCR反應在100μl體積中進行。
DNA-2-5μl3.3×XL緩沖液II-30μl10mM dNTP混合物-3μl25mM Mg(OAc)2-4μl25μM OSBS-1引物(或OSBS-8)-2μl25μM Stu-1引物(或Stu-2)-2μl2U/μl rTth聚合酶-2μl水-調節(jié)至100μlPCR條件是95℃-30秒、54℃-30秒、68℃-3分鐘，30個循環(huán)。所獲PCR片段，3.327kb和2.635kb，使用QIAGEN PCR純化試劑盒根據(jù)廠商說明書進行純化并用于PCR裝配。
2).將5μl等分試樣的純化PCR片段混合在一起，并加入不含引物的新鮮PCR混合物中。PCR混合物的總體積是100μl，并具有上述成分。PCR裝配條件是95℃-30秒、52℃-30秒、68℃-2分鐘，10個循環(huán)。
3).10個PCR循環(huán)后，在該裝配混合物中補加OSBS-1和OSBS-8引物，并再進行15個循環(huán)的PCR擴增。此次PCR條件是95℃-30秒、52℃-30秒、68℃-5分鐘。獲得期望的5.962kb產(chǎn)物，命名為OS4-Pcons-aprE并用于轉化OS1感受態(tài)細胞以產(chǎn)生OS4菌株。
OS1感受態(tài)細胞的轉化通過用卡那霉素基因置換aprE基因，從稱為BG2822的枯草芽孢桿菌產(chǎn)生OS1菌株。將卡那霉素基因插入芽孢桿菌染色體上從1103.484kb至1105.663kb的位置中。因此，該菌株在LB+1.6％脫脂乳平板上不形成任何暈圈(halos)。BG2822是具有nrp缺失(編碼中性蛋白酶的基因中的缺失)的枯草芽孢桿菌168衍生物(J.Bacteriol.1984，第160卷，第15-21頁)。
由于OS4-Pcons-aprE PCR融合物不帶有任何抗生素標記，所以通過中板集合(congression)將此融合物引入細胞中。使20μl PCR產(chǎn)物與1μl(約10nM)pBS19質?；旌?，并用于轉化OS1。將轉化混合物鋪在LB+1.6％脫脂乳+5μg/ml cmp平板上。第二天，挑取形成暈圈的菌落并進行單菌落劃板。進行兩次菌落純化。通過對aprE啟動子區(qū)域測序，分析5個獨立的克隆。所有這些克隆在aprE啟動子的-35區(qū)都有共有序列。
表3
表3.aprE基因在不同芽孢桿菌菌株中的表達2×SMB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后測量aprE活性。
1在此菌株中將aprE啟動子的-35區(qū)改變?yōu)楣灿行蛄蠺TGACA。
實施例XI實施例XI提供培養(yǎng)修飾的枯草芽孢桿菌菌株和檢測蛋白酶的實驗方案。
培養(yǎng)在2ml LB(Luria-Bertani培養(yǎng)基)中預培養(yǎng)這些菌株至A620nm處的約0.35OD。然后將這些預培養(yǎng)物等分在96孔微滴定板中(Costar，Cat#3598)，每種菌株4個孔。使用無菌的96孔印模(stamp)，從預培養(yǎng)板上接種含有200μl 2×SMB培養(yǎng)基的96孔過濾底平板(Millipore，MAGVN2250)。在濕潤搖箱中280RPM，37℃培養(yǎng)該平板，并在20和48小時培養(yǎng)后測定蛋白酶活性。
Luria-Bertani培養(yǎng)基向950ml去離子水中添加細菌用胰蛋白胨10g細菌用酵母提取物 5gNaCl 10g搖動這些溶解物至溶解。用5N NaOH(約0.2ml)調節(jié)pH至7.4。用去離子水將溶液體積調節(jié)至1升，并在15lb/sq in通過液體循環(huán)上高壓滅菌20分鐘。
蛋白酶測定從培養(yǎng)板上采取等分試樣，并使用Multispence(Asys Hitech)在96孔微量滴定板中Tris緩沖液(100mM pH8.6，0.005％Tween 80)內稀釋。將來自該稀釋板的等分試樣分裝在含有Tris緩沖液和底物(1mg/mlSuc AAPF pNA-Bachem Cat#L-1400)的96孔板來測定上述滴定板中的蛋白酶活性。然后在96孔板讀數(shù)器(Molecular Devices，SpetraMax 250)讀取反應物的數(shù)據(jù)?；诘孜锼獾乃俾?、0.02mg/U轉化因素和稀釋因素，測定每孔蛋白酶濃度。
序列表<110>Valle，F(xiàn)ernandoFerrari，Eugenio<120>突變的aprE啟動子<130>GC583<140>US 09/479,494<141>2000-01-07<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>啟動子<400>1tgggtcttga caaatattat tccatctatt acaataaatt cacaga 46<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2atatgtggtg ccgaaacgct ctggggtaac 30<210>3<211>52<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>3ctcaaaaaaa tgggtctact aaaatattat tccatctatt acaataaatt ca 52<210>4<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4tgaatttatt gtaatagatg gaataatatt ttagtagacc catttttttg ag 52<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cttttcttca tgcgccgtca gctttttctc 30<210>6<211>46<212>DNA<213>芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)<400>6tgggtctact aaaatattat tccatctatt acaataaatt cacaga 4權利要求
1.分離的突變aprE啟動子，其在圖1所示野生型啟動子的-35共有盒的核苷酸中包含修飾。
2.分離的突變aprE啟動子，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.包含分離的突變aprE啟動子的表達載體，其中所述突變啟動子在圖1所示野生型啟動子的-35盒中包括修飾。
4.權利要求3的表達載體，其中分離的突變aprE啟動子具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
5.包含分離的突變aprE啟動子的宿主細胞，其中所述突變啟動子在圖1所示野生型啟動子的-35共有盒的核苷酸中包括修飾。
6.權利要求5的宿主細胞，其中突變的aprE啟動子具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.權利要求5的宿主細胞，其中所述宿主細胞來自芽孢桿菌屬物種。
8.權利要求7的宿主細胞，還包含與突變aprE啟動子相連的編碼目的蛋白質的核酸序列。
9.權利要求8的宿主細胞，其中所述目的蛋白質是與所述宿主細胞同源的。
10.權利要求8的宿主細胞，其中所述目的蛋白質是與所述宿主細胞異源的。
11.權利要求8的宿主細胞，其中所述目的蛋白質選自蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶、脂酶、異構酶、轉移酶、激酶和磷酸酶。
12.權利要求7的宿主細胞，其中所述芽孢桿菌屬物種選自地衣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
13.在芽孢桿菌中制備目的蛋白質的方法，包括培養(yǎng)包含編碼該目的蛋白質的核酸的芽孢桿菌，所述芽孢桿菌還包含分離的突變aprE啟動子；和任選地回收該蛋白質。
14.權利要求13的方法，其中所述分離的突變aprE啟動子具有SEQ IDNO1所示序列。
15.權利要求13的方法，其中所述芽孢桿菌包括地衣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
16.權利要求13的方法，其中所述目的蛋白質包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶、和脂酶；異構酶如消旋酶、差向異構酶、互變異構酶、或變位酶；轉移酶、激酶和磷酸酶。
17.權利要求15的方法，其中所述核酸整合在芽孢桿菌基因組中。
18.權利要求15的方法，其中所述核酸位于復制型質粒上。
19.權利要求13的方法，其中所述芽孢桿菌物種是枯草芽孢桿菌，所述目的蛋白質是蛋白酶。
20.權利要求19的方法，其中所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
21.分離的突變aprE啟動子，其與野生型aprE啟動子相比在-35共有盒的一或多個核苷酸中包含修飾，其中所述突變的aprE啟動子增強按每單位時間產(chǎn)生的mRNA分子數(shù)測量的轉錄頻率。
22.包含權利要求21的分離的突變aprE啟動子的表達載體。
23.權利要求1的突變aprE啟動子，還在圖1所示野生型啟動子的17堿基對間隔區(qū)中包含修飾。
24.權利要求1的突變aprE啟動子，還在圖1所示野生型啟動子的-10共有盒的核苷酸中包含修飾。
25.權利要求3的表達載體，還包含編碼目的蛋白質的核酸。
26.權利要求25的表達載體，其中所述目的蛋白質選自蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶、脂酶、異構酶、轉移酶、激酶和磷酸酶。
27.權利要求25的表達載體，其中蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
28.權利要求4的表達載體，還包含編碼目的蛋白質的核酸。
29.包含權利要求28的表達載體的宿主細胞。
30.權利要求7的宿主細胞，其中所述宿主細胞是枯草芽孢桿菌宿主細胞。
31.權利要求6的宿主細胞，其中所述宿主細胞是選自地衣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的芽孢桿菌屬物種。
全文摘要
本發(fā)明提供突變的aprE啟動子和在包含該突變的aprE啟動子的芽孢桿菌宿主細胞中制備目的蛋白質的方法。本發(fā)明提供優(yōu)選的aprE突變啟動子的序列，該序列使枯草芽孢桿菌中蛋白質的產(chǎn)生增加100倍。
文檔編號C12N15/63GK101054588SQ200710086290
公開日2007年10月17日 申請日期2000年12月21日 優(yōu)先權日2000年1月7日
發(fā)明者E·費拉里, F·瓦爾 申請人:金克克國際有限公司