專利名稱：：乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)突變及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)突變，可根據(jù)所述突變情況來(lái)制備判斷病人易感性和/或預(yù)后的檢測(cè)試劑或試劑盒。
背景技術(shù)：
：2000年調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是全球第五種常見惡性腫瘤，其死亡率居全球第三位。中國(guó)1990-1992年的抽樣數(shù)據(jù)同樣顯示，全國(guó)肝癌標(biāo)化死亡率為17.83/10萬(wàn)，約占癌癥死亡的18.82%，居第2位。流行病學(xué)資料表明乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒慢性感染以及黃曲霉毒素暴露是肝癌發(fā)生的重要外界環(huán)境危險(xiǎn)因素，最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，約53%的肝癌發(fā)生與HBV感染有關(guān)，HBV對(duì)人類生命健康造成了極大的危害。江蘇啟東是中國(guó)肝癌高發(fā)區(qū)，也是重要的腫瘤高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)。HBV感染和黃曲霉毒素暴露是啟東肝癌發(fā)生的主要原因。啟東自然人群中HBsAg與肝癌關(guān)系的前瞻隊(duì)列顯示，男性HBsAg(+)者與(-)者的肝癌發(fā)生率分別為619.30/10萬(wàn)與51.70/10萬(wàn)，RR為11.98;而女性HBsAg(+)者與(-)者的肝癌發(fā)生率分別為193.96/10萬(wàn)與11.37/10萬(wàn)，RR為17.06，差異均有顯著性?？梢?，HBV與肝癌的因果關(guān)系強(qiáng)烈。啟東長(zhǎng)期的腫瘤登記資料顯示，肝癌一直是啟東居民第1位的惡性腫瘤，根據(jù)1978-2002年的調(diào)査數(shù)據(jù)顯示，啟東男女性肝癌年齡調(diào)整發(fā)病率分別為79.6/10萬(wàn)與23.1/10萬(wàn)；相比之下，全國(guó)2000年估計(jì)的肝癌年齡調(diào)整發(fā)病率分別為38.9/10萬(wàn)與14.5/10萬(wàn)。乙型肝炎病毒DNA為部分環(huán)狀雙鏈DNA，約有3200堿基對(duì)，由正鏈和負(fù)鏈構(gòu)成。負(fù)鏈有4個(gè)開放讀碼區(qū)(0RF)，分別為前S/S區(qū)，前C/C區(qū)，P區(qū)和X區(qū)。除此之外還有多個(gè)基因表達(dá)調(diào)控序列，包括2個(gè)直接重復(fù)序列(DRI、DRII)、2個(gè)增強(qiáng)子(ENI、ENII)和4個(gè)啟動(dòng)子(SP1、SP2、XP和CP)。S區(qū)包括S、pre-Sl和pre-S2，可以合成小蛋白、中蛋白及大蛋白。前C/C區(qū)用于合成HBcAg和HBeAg，X區(qū)和P區(qū)分別合成HBx和DNA聚合酶。CP(nt.1643-1849)包括BCP區(qū)(basalcorepromoter,BCP)和上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR)。BCP(nt.1742-1849)指導(dǎo)3.5kb前CmRNA(pre-CmRNA)和2.4kb前基因組m腿(prege國(guó)emRNA)的轉(zhuǎn)錄，是HBV復(fù)制的重要調(diào)控區(qū)。URR(nt.1643-1741)位于BCP的5'端，總體來(lái)講它可以在肝細(xì)胞內(nèi)刺激pre-CmRNA和pgRNA的轉(zhuǎn)錄。HBV復(fù)制過(guò)程中要經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏有效的堿基校對(duì)功能，故HBV基因組比一般DNA病毒易發(fā)生變異。HBV的不同基因區(qū)均可發(fā)生突變，病毒DNA序列突變可能導(dǎo)致病毒在宿主體內(nèi)持續(xù)存在，導(dǎo)致慢性感染，甚至致癌。隨著對(duì)HBV與肝癌關(guān)系研究的深入，到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)了許多與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的突變位點(diǎn)。BCP區(qū)nt.1762A—T和nt.1764G—A的雙突變最常見，是HBV典型的突變類型之一。BCP發(fā)生變異，影響HBV復(fù)制，同時(shí)也下調(diào)HBeAg的合成，與疾病的不良預(yù)后密切相關(guān)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究表明，nt.1762T/1764A雙突變可以減少pre_CmRNA的量和HBeAg的分泌。BCP突變還可以上調(diào)病毒的復(fù)制，可能通過(guò)增加m脂A轉(zhuǎn)錄來(lái)上調(diào)基因組的表達(dá)。最近冊(cè)V雙突變與肝癌發(fā)生的關(guān)系也受到廣泛的重視。有研究結(jié)果提示，nt.176271764^雙突變與肝臟病變的嚴(yán)重程度相平行，從3%的無(wú)癥狀攜帶者到64。/。的肝細(xì)胞癌(HCC)患者(0R-20.04，95%CI7.25-55.4，代O.001)，雙突變與肝癌相關(guān)有非常顯著性(OR-IO.60,95%CI4.92-22.86,代O.001)。HBVX基因(簡(jiǎn)稱HBx基因，或X基因)是HBVDNA中最小的ORF，位于nt.1374nt.1838之間，編碼154個(gè)氨基酸。根據(jù)HBx蛋白的功能，它可分為2部分近氨基端的150aa為其自身的調(diào)控區(qū)域，該區(qū)域(120aa)能夠抑制HBx蛋白的反式激活活性；另一部分為近羧基端的51154aa為其反式激活區(qū)域，該區(qū)域是HBx蛋白發(fā)揮其反式激活作用的基礎(chǔ)，該區(qū)域的某些基因發(fā)生點(diǎn)突變或缺失，就會(huì)對(duì)其反式激活作用造成影響。HBx蛋白研究顯示，HBx的反式激活作用是HBV自身復(fù)制和感染宿主細(xì)胞所必需的，并促使肝臟慢性炎癥和肝硬化的發(fā)生。研究表明，HBx蛋白本身不能與雙鏈DNA結(jié)合，主要是通過(guò)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，與DNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子相互作用，直接或間接作用于相關(guān)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，來(lái)實(shí)現(xiàn)其反式激活功能。HBx對(duì)其自身啟動(dòng)子和許多細(xì)胞基因啟動(dòng)子都有正向調(diào)節(jié)作用，可激活病毒和細(xì)胞基因，在HBV感染并發(fā)展為肝細(xì)胞癌的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。HBx基因的3'末端與HBV的核心啟動(dòng)子CP湘重疊，因此，BCP區(qū)核苷酸變異可引起相應(yīng)位置HBx蛋白氨基酸的變異，從而通過(guò)影響HBx蛋白的功能而起到致癌作用。通過(guò)質(zhì)譜分析，Kuang等報(bào)道啟東HCC病人的血清標(biāo)本和組織標(biāo)本中HBVT1762/A1764突變率分別為53.3%和74.3%，但有關(guān)乙型肝炎病毒感染在肝癌發(fā)生中的作用及如何發(fā)生作用的研究較少。由于癌癥是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預(yù)防腫瘤(如肝癌)，目前人們已越來(lái)越關(guān)注腫瘤的早期診斷和預(yù)后，盡管目前本領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些位點(diǎn)的突變與肝癌有關(guān)，然而還有必要作進(jìn)一步研究，從而為肝癌的診斷、分型或預(yù)后提供更詳盡的依據(jù)，進(jìn)一步提高診斷、分型或預(yù)后的準(zhǔn)確性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)變異的試劑或試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供體外檢測(cè)核酸樣品中乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)變異的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)變異的試劑盒，它包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基"A"的序列的引物；或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基"A"的序列的限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列的引物；或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列的限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括6容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列的引物；或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列的限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列的引物；或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列的限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的乙型肝炎病毒的基因型是C型。在另一優(yōu)選例中，所述的乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)核苷酸位置編號(hào)基于GenBank登錄號(hào)DQ980547。在另一優(yōu)選例中，所述的引物是具有SEQIDNO:IO和SEQIDNO:ll所示序列的引物對(duì)。在另一優(yōu)選例中，所述的探針具有選自SEQIDNO:12-SEQIDNO:16任一所示的序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種體外(優(yōu)選非診斷性地)檢測(cè)核酸樣品中乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)變異的方法，所述的方法包括以下步驟檢測(cè)該核酸樣品的乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)，并與野生型的乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)比較，存在選自以下變異形式就表明該個(gè)體乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)存在核苷酸變異乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位，T—A。在另一優(yōu)選例中，所述的變異形式還包括乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位，C—T。在另一優(yōu)選例中，所述的變異形式還包括乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位，A—T;或乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位，G—A。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖l顯示了HBx突變的生長(zhǎng)抑制影響。其中，A:Huh-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載體(pcDNA3.1)、野生型HBx、人工構(gòu)建的HBx突變體A1764、A1764/T1762、A1764/T1762/A1768后的克隆形成情況。B:HBx突變體引起的生長(zhǎng)抑制影響，結(jié)果顯示為兩次獨(dú)立轉(zhuǎn)染所獲結(jié)果的平均值。*，P<0.05;**，P〈0.01。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次揭示乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766或1768位堿基的突變與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。并且還發(fā)現(xiàn)，該兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合第1762或1764位突變的累積可提高肝癌發(fā)生的可能性。因此，可將該兩個(gè)位點(diǎn)的變異作為肝癌易感性標(biāo)志，從而設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)所述突變位點(diǎn)的試劑或試劑盒。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明人自1992年起，建立了一個(gè)用于腫瘤病因?qū)W研究的前瞻性隊(duì)列，共計(jì)1，638人。此隊(duì)列中慢性肝炎符合2000年《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)。隊(duì)列含HBsAg(+)患者852例(其中男性776例，女性76例)，HBsAg(-)患者786例(男性723例，女性63例)。迄今為止，隊(duì)列中累計(jì)發(fā)生肝癌189例，其中HBsAg(+)患者中有170例發(fā)生肝癌。隊(duì)列成員每年隨訪一次，留有完整的隨訪資料和系列血樣，長(zhǎng)達(dá)15年。對(duì)該隊(duì)列成員的研究首次發(fā)現(xiàn)，除了乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762和1764位突變外，第1766或1768位突變可提高肝癌發(fā)生的可能性。并且，第1762和1764位突變?cè)诼愿窝谆蚋伟┗颊咧型蛔儽壤裏o(wú)明顯不同，而第1766和1768位突變?cè)诟伟┗颊咧械谋壤@著高于慢性肝炎患者?；诒景l(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可以將乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766和1768位的相關(guān)突變作為標(biāo)志，從而從乙型肝炎病毒陽(yáng)性的人群中分離出對(duì)于肝癌易感性的人群，或作為肝癌疾病的鑒別診斷、禾n/或易感性分析的輔助性工具；早期評(píng)估相關(guān)人群肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)。例如，可從乙型肝炎病毒陽(yáng)性患者人群中分離出乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766禾tV或1768位發(fā)生突變的人群，作為肝癌的高發(fā)人群，從而達(dá)到早期監(jiān)測(cè)早期預(yù)防的目的。此外，還可通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)其它位點(diǎn)的突變情況來(lái)評(píng)估肝癌易感性。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766或1768位的突變結(jié)合第1762或1764位突變的累積(如三個(gè)位點(diǎn)的突變)可提高肝癌發(fā)生的可能性。所述突變位點(diǎn)例如是第1764位G—A(簡(jiǎn)寫為A1764)，第1762位A—T(簡(jiǎn)寫為T1762)和第1768位T—A(簡(jiǎn)寫為A1768);或是第1762位A—T(簡(jiǎn)寫為T1762)，第1764位G—A(簡(jiǎn)寫為A1764)和第1766位C—T(簡(jiǎn)寫為T1766)。所述突變?cè)诟伟┗颊咧械陌l(fā)生比例顯著高于慢性肝炎患者中?；诒景l(fā)明人的上述發(fā)現(xiàn)，可采用各種技術(shù)來(lái)檢測(cè)乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766或1768位的堿基的突變情況，這些技術(shù)均包含在本發(fā)明中。例如，對(duì)相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行序列測(cè)定，從而判斷是否發(fā)生變異。在檢測(cè)相關(guān)位點(diǎn)的變異時(shí)，檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此可用例如Western印跡法間接判斷基因有無(wú)突變。此外，可用相關(guān)位點(diǎn)特異的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)進(jìn)行體外鑒定；或者可根據(jù)相關(guān)位點(diǎn)設(shè)計(jì)可特異性結(jié)合的探針來(lái)進(jìn)行體外鑒定；或者可利用特異性的限制性內(nèi)切酶來(lái)進(jìn)行體外鑒定。作為一種可選的方式，還可采用基于PCR技術(shù)的單堿基延伸技術(shù)來(lái)檢測(cè)變異位點(diǎn)，其原理是設(shè)計(jì)一條引物，位于待測(cè)變異位點(diǎn)的上游，并且該引物的3'端距離變異位點(diǎn)一個(gè)堿基。加入不同熒光標(biāo)記的ddNTP進(jìn)行反應(yīng)，只有當(dāng)加入的ddNTP與變異位點(diǎn)堿基互補(bǔ)時(shí)，引物才得以延伸?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)延伸堿基所發(fā)出的熒光來(lái)判斷變異的類型。本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)是否含有所述變異位點(diǎn)的試劑。所述的試劑例如是對(duì)相關(guān)突變位點(diǎn)特異的引物；對(duì)相關(guān)突變位點(diǎn)特異的探針；或?qū)ο嚓P(guān)突變位點(diǎn)特異的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)是否含有所述變異位點(diǎn)的試劑盒，該試劑盒包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基"A"的序列的引物；或與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針；或可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基"A"的序列的限制性內(nèi)切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列的引物；或與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針；或可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列的限制性內(nèi)切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列的引物；或與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針；或可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列的限制性內(nèi)切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當(dāng)容器中的、用于特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列的引物；或與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針；或可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列的限制性內(nèi)切酶。當(dāng)所述試劑盒中含有針對(duì)多于一個(gè)位點(diǎn)變異情況的檢測(cè)試劑時(shí)，檢測(cè)或評(píng)估的準(zhǔn)確性可能提高。作為本發(fā)明的可選擇的方式，所述的試劑盒中可包括特異性與乙型肝炎10病毒核心啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生T1766和/或A1768突變的基因產(chǎn)物結(jié)合且不結(jié)合于相關(guān)位點(diǎn)未突變的基因產(chǎn)物的抗體。更優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括常規(guī)的可用于檢測(cè)抗原抗體結(jié)合狀況的試劑。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對(duì)照液、顯色液、洗液、抗體等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說(shuō)明書和/或芯片圖像分析軟件等。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)通過(guò)大規(guī)模地對(duì)乙型肝炎或肝癌發(fā)病人群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)肝癌發(fā)生相關(guān)的新的變異位點(diǎn)，研究病例多，準(zhǔn)確性高。(2)首次針對(duì)新的變異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出特異性的檢測(cè)試劑和試劑盒，為早期評(píng)估相關(guān)人群肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)提供了新的途徑。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和分?jǐn)?shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。材料和方法病人和標(biāo)本本研究中使用的血清標(biāo)本來(lái)自啟東地區(qū)1992年以來(lái)建立的一個(gè)前瞻性隊(duì)列，隊(duì)列含852名表面抗原陽(yáng)性患者及786名表面抗原陰性患者。從1996年開始收集每位患者血清，-4(TC儲(chǔ)存。肝癌患者都經(jīng)過(guò)病理診斷。為了進(jìn)行病例對(duì)照研究，從隊(duì)列中挑選了129份表面抗原陽(yáng)性的血清標(biāo)本71份來(lái)自慢性肝炎患者，58份來(lái)自肝癌患者。年齡為男性39.9士9.1歲，女性41.9士10.4歲(/M).24);男女性別比為55:3(肝癌)及68:3(肝炎)，(/M.00)。為了進(jìn)行縱向調(diào)査研究，篩選15例肝癌確診當(dāng)年伴有T1762/A1764或者T1766/A1768突變的肝癌患者。每一患者診斷肝癌前2到7年的血清中至少有一份PCR擴(kuò)增的HBVDNA可供研究。擴(kuò)增和序列分析HBVDNAnt.1266-1823核苷酸采用蛋白酶消化，酚-氯仿-異戊醇抽提法自100W血清中提取HBVDNA。以PCR引物HB1、R-dr和半巢式引物HB2(見表l)擴(kuò)增HBVnt.1266-1823核苷酸序列，這部分序列包括了X基因和核心啟動(dòng)子序列。PCR按如下條件進(jìn)行94°C3分鐘，循環(huán)程序?yàn)?4°C25秒/58。C25秒/72。Cl分鐘共35個(gè)循環(huán)，72"C延伸7分鐘。膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收PCR產(chǎn)物。采用ABIPrism3700DNA序列分析儀進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序。采用ClustalW軟件進(jìn)行DNA序列分析。表1寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，小些字母表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；粗黑體字母表示KOZAK序列；帶下劃線字母表示人工突變位點(diǎn)。HBV基因型鑒定通過(guò)X基因與標(biāo)準(zhǔn)序列的比較，確定HBV基因型(GenBank登錄號(hào))基因型A:AB116076'AB116081，AB116085'AB116094;基因型B:AB115551,AY167089，AY167101，AY206375;基因型C:AB112063,AB112471，AY306136，AB117758;基因型D:AB116266,AB120308，AB126581，AY233292;基因型E:AB091255,AB091256'AB106564,AB205190;基因型F:AB116654,AY179735，AY090458,AB166850;基因型G:AB056514'AB056515，AF405706;基因型H:AY090457;AY090454。用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。定點(diǎn)突變和質(zhì)粒的構(gòu)建以野生型HBVDNA(Genbank登錄號(hào)DQ980547)為模板，釆用PCR方法擴(kuò)增X基因。通過(guò)拼接PCR的方法，以含有突變核苷酸的引物F2-4，F(xiàn)2-4.2和F2-4.2.8，引入突變點(diǎn)(表1)。第一輪PCR以引物F1/R1和F2-(4，4.2或4.2.8)/R2擴(kuò)增產(chǎn)生兩個(gè)片段。第一輪PCR的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，F(xiàn)l和R2(末端含有限制系內(nèi)切酶位點(diǎn)XbaI和KpnI)為擴(kuò)增引物，擴(kuò)增產(chǎn)生突變的X基因。X基因全長(zhǎng)通過(guò)XbaI和KpnI位點(diǎn)克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)(Invitrogen，Carlsbad,CA)。所有的重組產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)非目的突變。質(zhì)粒DNA以Qiagen小量試劑盒純化(Qiagen,Valencia,CA)。克隆形成試驗(yàn)釆用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，含X基因載體及空載體pcDNA3.l(-)轉(zhuǎn)染HuH7細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)和liverChang細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)的量為每皿(35mm)2pg。轉(zhuǎn)染36小時(shí)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到60mm皿中，以含有G418(80(^g/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。每3到4天換液直至克隆形成?？寺∫灶A(yù)冷的甲醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)相對(duì)危險(xiǎn)度分析(OR值)、卡方檢驗(yàn)、Fisher's確切概率(x2分析)、t-檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。以統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)包SPSS12.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例i.肝癌及肝炎病人中乙肝病毒核心啟動(dòng)子/x基因變異情況為了檢測(cè)乙肝病毒核心啟動(dòng)子/x基因變異情況，使用高保真的聚合酶通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增乙肝病毒DNA基因片斷(核苷酸1266-1823)。PCR產(chǎn)物包含整個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)及全長(zhǎng)的X基因(3'端缺失15個(gè)核苷酸)。該區(qū)域最常見的突變是1762位由A突變?yōu)門，1764位由G突變?yōu)锳，其總體突變率分別為74.4%和89.1%(表2)。但是在肝癌及肝炎病人中T1762/A1764突變差異沒(méi)有顯著性。另外本發(fā)明人在鄰近的1766及1768位發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)突變熱點(diǎn)。有意思的是1766位由C突變?yōu)門及1768位T突變?yōu)锳在肝癌組中的發(fā)生率顯著高于肝炎組。在肝癌組和肝炎組中，T1766突變率分別為22.4%和9.9%(代O.05)，A1768突變率分別為19.0%和7.0%(代O.05)。表2.HCC和CH患者中CP/X突變的情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>其中，HCC表示肝細(xì)胞癌；CH表示慢性肝炎；OR表示讓步比；CI表示置信區(qū)間。表3是在基本核心啟動(dòng)子區(qū)突變的不同組合情況。該區(qū)域的單點(diǎn)突變非常少見，在整個(gè)研究中只有一例發(fā)生A1764突變，T1762、T1766及A1768突變總是伴隨著A1764突變的發(fā)生。雙突變發(fā)生率很高，尤其是T1762+A1764雙突變發(fā)生率在所有HBV感染者中達(dá)到69.8%。相比于之前的研究T1762/A1764雙突變?cè)黾恿薍BV攜帶者肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)性，這些資料顯示T1762/A1764雙突變?cè)诟伟┖透窝捉M中差異并沒(méi)有顯著性(65.5%vs.73.2%，/^>0.05)。研究顯示三點(diǎn)突變也與肝癌的發(fā)生有關(guān)，在58例肝癌病人中有13例(22.4%)發(fā)生三點(diǎn)突變，而在71例肝炎中發(fā)生率為5例(7.0%)。這些結(jié)果提示是突變的類型而不是突變的位置在HBV的生物學(xué)功能中發(fā)揮重要的作用。表3.從患者分離的HBV中BCP突變形式<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>其中，HCC表示肝細(xì)胞癌；CH表示慢性肝炎；HCC與CH相比的三突變頻率，*P<0.05。"+"表示該位置發(fā)生突變。之前的研究顯示a盒中T1653突變及基本核心啟動(dòng)子V1753突變會(huì)增加C基因型慢性乙肝病毒感染者中肝癌的發(fā)生率，本發(fā)明人比較了這兩個(gè)突變?cè)诟伟┖蛯?duì)照組中的分布情況。T1653突變?cè)趦山M中都較常見，肝癌組中突變率高于肝炎組(肝炎組為28.2%，肝癌組為37.9%，"0.05)。V1753突變率較低，肝炎組中為15.5%，肝癌組中為25.9%，兩組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例2.肝癌病人中HBV基本核心啟動(dòng)子突變的縱向觀察大多數(shù)關(guān)于HBV基因突變和肝癌發(fā)生關(guān)系的研究都使用了取之于肝癌診斷后的組織標(biāo)本。在肝癌高發(fā)區(qū)建立的管理良好的隊(duì)列使本發(fā)明人在研究中可以檢測(cè)肝癌診斷前后不同年份血清標(biāo)本中HBV基因突變情況。表4顯示在疾病進(jìn)展過(guò)程中基本核心啟動(dòng)子突變的變化。一些病例中缺失的序列資料是由于PCR擴(kuò)增CP/X基因失敗或者是在隊(duì)列建立前血清標(biāo)本的缺失。在8例病人診斷前4-7年的血清標(biāo)本中檢測(cè)基本核心啟動(dòng)子序列，結(jié)果顯示，除了#3-94號(hào)病人在肝臟惡變過(guò)程中保持T1762/A1764雙突變外，其他病例都顯示為基本核心啟動(dòng)子突變的積累。對(duì)于8例病人，核心啟動(dòng)子突變總數(shù)在肝炎階段為10個(gè)堿基，到了肝癌階段增加為22個(gè)堿基。僅貼99病人在1762位出現(xiàn)一個(gè)回復(fù)突變。值得注意的是不同于T1762/A1764突變，T1766及A1768突變?cè)诟伟╇A段或肝癌早期階段的標(biāo)本中被檢測(cè)到。相應(yīng)的核心啟動(dòng)子三點(diǎn)突變?cè)诟伟┌l(fā)展P介段前很短地時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)。這些結(jié)果，與橫斷面得到的結(jié)果一起提示HBV核心啟動(dòng)子T1766/A1768突變可以作為肝癌一個(gè)有意義的預(yù)測(cè)分子標(biāo)志。_表4.HCC患者中BCP突變的縱向觀察_樣品HCC前4-7年HCC前2-3年HCC其中，HCC表示肝細(xì)胞癌；SNA表示血清標(biāo)本不存在；VNA表示在PCR擴(kuò)增后病毒DNA不存在，00-O-O表示1762-1764-1766-1768;O表示野生型序列，參表示突變。實(shí)施例3.CP/X基因突變與HBV基因型在受試者中，HBV基因型主要為基因型C。在129位研究受試者中119位感染了基因型C的病毒株。還有8例為基因型B,2例為B、C型混和感染。沒(méi)#281SNA#1-155SNA#380VNA#3-94#11#1564SNA#231#183#486#1571#899#1525VNA#146#987SNA#702VNAVNA-—--VNA參4—iimmHIL有檢測(cè)到其他的基因型。58例肝癌患者中53例(91.4%)為基因型C，3例(5.2%)為B型，2例為B、C型混和感染。在71例對(duì)照組中66例(93.0%)為C型，5例(7.0%)為B型。肝癌病人與肝炎病人中基因型分布相似，這說(shuō)明基因型不是該地區(qū)肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。感染HBV基因型C的病人中T1762及A1764突變率較B型高(T1762突變78.2%vs.37.5%,代O.05;A1764突變:92.4%vs.37.5%'代O.01)。T1653,V1753,T1766及A1768突變僅僅見于基因型C，見表5。表5.在感染HBV基因型B和基因型C的患者中CP/X突變的情況突變總(n-127)基因型B(f8)基因型C(n=119)尸值T165342(33.1%)0(0%)42(35.3%)0.052VI75326(20.5%)0(0%)26(21.8%)0.205T176296(75.6%)3(37.5%)93(78.2%)0.021A1764113(89.0%)3(37.5%)110(92.4%)0細(xì)T176618(14.2%)0(0%)18(15.1%)0.597A176814(11.0%)0(0%)14(11.8%)0.597實(shí)施例4.核心啟動(dòng)子突變通過(guò)影響HBX功能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用由于核心啟動(dòng)子與HBVX基因重疊，因此基本核心啟動(dòng)子突變會(huì)影響HBX蛋白。在X基因開放編碼框架中T1762，A1764,A1768突變會(huì)導(dǎo)致HBX蛋白的三個(gè)氨基酸的改變，即130位的賴氨酸變?yōu)榈鞍彼幔?31位纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔?32位苯丙氨酸變?yōu)槔野彼?。T1766突變并不改變HBX蛋白的氨基酸序列。為了確定核心啟動(dòng)子自然突變對(duì)HBX蛋白生物學(xué)功能的影響，通過(guò)PCR定點(diǎn)突變方法人工構(gòu)建一系列不同類型的突變株。通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBX突變對(duì)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡作用。正如所預(yù)期的，相比于空載體，野生型HBX蛋白的表達(dá)導(dǎo)致了明顯的克隆形成數(shù)的減少。A1764突變并不影響HBX蛋白的生長(zhǎng)抑制功能。但是，鄰近的1762或1768位一個(gè)或兩個(gè)突變減弱了野生型HBX蛋白克隆抑制能力，見圖1。野生型HBX及A1764突變導(dǎo)致約80%克隆形成數(shù)的減少，A1764+T1762雙突變及T1762+A1764+A176817三點(diǎn)突變分別使克隆數(shù)回復(fù)至33.0%及52.8%。這些數(shù)據(jù)提示基本核心啟動(dòng)子以累積突變的方式影響了HBX蛋白的生長(zhǎng)抑制能力。實(shí)施例5檢測(cè)試劑盒一.引物及試劑盒根據(jù)HBV啟動(dòng)子區(qū)第1766和第1768位突變的序列，設(shè)計(jì)如下引物正向(SEQIDNO:10):5'biotin-TACTTCAAAGACTGTTTGTTTAA-3'(nt.1704-nt.1726);反向(SEQIDNO:11):5,biotin-AAAAAGTTGCATGGTGCTGGTGAAC-3'(nt.1801-nt.1825)。采用常規(guī)的PCR技術(shù)，利用上述引物來(lái)擴(kuò)增受試核酸樣品，通過(guò)常規(guī)的凝膠電泳確定是否獲得PCR產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所述引物可特異性地?cái)U(kuò)增出突變位點(diǎn)相關(guān)序列，準(zhǔn)確性高。將上述引物置于適當(dāng)?shù)娜萜髦校糜谥苽湓噭┖?。?探針及試劑盒根據(jù)HBV啟動(dòng)子區(qū)第1762、1764及1766和第1768位突變的序列，設(shè)計(jì)如下探針(nt.1754-nt.1776):1762+1764位TAGGTTAATGATCTTTGTACTAG(SEQIDNO:12);1764+1766位TAGGTTAAAGATTTTTGTACTAG(SEQIDNO:13);1762+1764+1766位TAGGTTAATGATTTTTGTACTAG(SEQIDNO:14);1762+1764+1768位TAGGTTAATGATCTATGTACTAG(SEQIDNO:15);1764+1766+1768位TAGGTTAAAGATTTATGTACTAG(SEQIDNO:16)。將所述探針點(diǎn)樣于硝酸纖維膜。生物素標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與固定在硝酸纖維膜上的特異性寡核苷酸探針雜交。雜交后，未能雜交的DNA從檢測(cè)條上被洗脫。加入標(biāo)記有堿性磷酸酶的鏈霉抗生物素蛋白(鏈親和素)，與雜交產(chǎn)物上標(biāo)記的生物素結(jié)合。經(jīng)底物BCIP/NBT作用，在相應(yīng)的特異性探針位置，顯現(xiàn)紫色/棕色沉淀?xiàng)l帶。經(jīng)驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)本發(fā)明人設(shè)計(jì)的特定探針具有非常優(yōu)異的特異性，檢測(cè)的準(zhǔn)確性高。上述探針或點(diǎn)樣了探針的芯片可置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，制備試劑盒。討論CP指導(dǎo)3.5kb前CmRNA和2.4kb前基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄，是HBV復(fù)制的重要調(diào)控區(qū)。CP區(qū)由核心上游調(diào)節(jié)序列和基本核心啟動(dòng)子組成。自然突變多集中于BCP區(qū)。BCP區(qū)最為常見的突變是T1762和A1764雙突變。研究表明，雙突變與肝臟疾病進(jìn)程有關(guān)。在南非，肝癌病人中HBV有66。/。發(fā)生CP區(qū)突變，而在年齡和HBeAg水平匹配的肝炎病人中雙突變發(fā)生率僅為11%。許多其它實(shí)驗(yàn)室的研究也顯示了此種相關(guān)性。然而，也有部分研究顯示CP區(qū)突變與臨床結(jié)局無(wú)明顯相關(guān)性。之前的研究多數(shù)集中在T1762/A1764突變，因此，還不清楚BCP區(qū)是否還有其他突變或者聯(lián)合突變與HCC發(fā)生有關(guān)。本發(fā)明人對(duì)T1766和A1768突變?cè)诟闻K疾病進(jìn)展中的作用也進(jìn)行了分析。病例對(duì)照研究結(jié)果顯示盡管T1762/A1764T熱點(diǎn)突變十分常見(T1762:74.4%,A1764:89.1%)，但其中的任何一種突變或聯(lián)合突變均未增加HCC發(fā)生的危險(xiǎn)性。相反，當(dāng)A1762/T1764雙突變不合并T1766或A1768突變時(shí)，突變?cè)贖CC病人中的發(fā)生率更低。隊(duì)列研究結(jié)果即T1762/A1764突變可以在HCC發(fā)生前的很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)存在也證明了此種現(xiàn)象。值得注意的是，T1766和A1768突變可以作為肝癌的有效分子標(biāo)志。HCC病人HBVT1766與A1768的突變率分別為22.4%和19.0%，均高于慢性肝炎病人中的發(fā)生率(代0.05)。進(jìn)一步研究顯示T1766或A1768突變常伴有A1764突變。這種突變累積在HBV慢性感染的病人中也有報(bào)道。以上結(jié)果提示，是突變的累積而不是突變位置與肝癌的發(fā)生有關(guān)。在此研究中，雙突變無(wú)論T1762+A1764還是A1764+A1766突變?cè)趦山M間均沒(méi)有明顯不同，而肝癌病人HBVBCP三點(diǎn)突變發(fā)生率明顯高于肝炎病人(22.4%vs.7.0%,代O.05)?？梢酝茰y(cè)，在HBV慢性感染過(guò)程中，首先A1764發(fā)生突變，然后CP區(qū)發(fā)生其它較少見的突變。在感染的不同階段，雙突變或三點(diǎn)突變?cè)谒拗髅庖叻磻?yīng)，藥物治療和環(huán)境致癌因素比如AFB1的壓力下被篩選出。T1766/A1768突變最初在爆發(fā)性肝炎病人中有報(bào)道。T1766/A1768突變株是感染基因型A的低病毒血癥病人中的主導(dǎo)株。最近，T1766/A1768報(bào)道與肝硬化的發(fā)生明顯相關(guān)。據(jù)本發(fā)明人所知迄今還沒(méi)有T1766/A1768突變與肝癌發(fā)生關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。T1766/A1768導(dǎo)致肝臟疾病的機(jī)制還不是很清楚。病19毒形成實(shí)驗(yàn)顯示T1766/A1768突變可通過(guò)增加pgRNA包裝成核心粒子的途徑使病毒復(fù)制增強(qiáng)15倍。在另一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)研究中，T1762/A1764/T1766突變使DNA復(fù)制增加了8倍，而T1762/A1764熱點(diǎn)突變僅使其增加了2倍。病毒復(fù)制的增加可以解釋由于HBV突變導(dǎo)致的爆發(fā)性肝炎的發(fā)生。為了研究HBVCP突變對(duì)HCC發(fā)生的生物學(xué)影響，HBV突變導(dǎo)致的HBx改變對(duì)肝癌發(fā)生的影響進(jìn)行了研究。HBx蛋白具有反式激活作用，可以激活病毒和細(xì)胞啟動(dòng)子及增強(qiáng)子。在體外不同的細(xì)胞類型和體內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠HBx蛋白表達(dá)的研究提示了HBx在控制細(xì)胞增值和變異中的重要作用。HBx自然變異在不同臨床病程的病人血清和肝臟組織中均有報(bào)道。值得注意的時(shí)，肝癌病人組織中HBx的分離物尤其是HBV整合的，通常在X基因的羧基端有缺失。進(jìn)一步功能研究顯示HBx羧基端缺失可導(dǎo)致HBx依賴的轉(zhuǎn)錄激活抑制，細(xì)胞循環(huán)停滯和調(diào)亡抑制。這種缺失可能還增加HBx的轉(zhuǎn)化能力。由于T1762,A1764和A1768突變還可以改變HBx的氨基酸序列，因此BCP區(qū)突變是否改變HBx的生物學(xué)功能也值得研究。本研究進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)HBx對(duì)細(xì)胞增值的影響。結(jié)果顯示，BCP突變尤其是T1762/A1764/A1768三點(diǎn)聯(lián)合突變可以很大程度上減弱HBx對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。此種突變是否可以增加HBx的轉(zhuǎn)錄激活活性值得進(jìn)一步進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)。迄今為止，通過(guò)全基因序列分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了A-H八種基因型。臺(tái)灣和日本研究顯示與基因型B相比，基因型C可以增加肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)性。然而，本發(fā)明的研究結(jié)果并不支持這一結(jié)果。盡管啟東主要流行毒株為基因型C，但其在肝癌和肝炎中的分布無(wú)顯著性差異(94.8%vs.93.0%)。相比之下，基因型C比B型CP/X區(qū)更易發(fā)生突變。T1762/A1764突變?cè)诨蛐虲與B中的發(fā)生率分別為92.4%和37.5%(代0.01)，T1766/A1768突變僅見于基因型C的病人。3例病人發(fā)生T1762/A1764突變的基因型B中，2例已經(jīng)發(fā)展成肝癌病人。以上數(shù)據(jù)提示，可能并不是HBV基因型C而是HBVC基因型的CP區(qū)高突變率與肝癌發(fā)生有關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō)，本發(fā)明人研究結(jié)果顯示HBVCP/X區(qū)T1766/A1768聯(lián)合突變與肝癌發(fā)生有關(guān)。BCP區(qū)突變?cè)诟伟┑陌l(fā)生中可能起到協(xié)同作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海市腫瘤研究所<120>乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)突變及其用途<130>080405<160>16<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉19<212〉隱<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>1gccaagtgtttgctgacgc<210〉2〈211〉20<212〉DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉2emagUgcatggtgctggtg<210>3<211〉20<212>DNA<213〉人；l:序列<220><221>misc一feature<223〉引物<400〉3ccatactgcggaactcctag<210>4〈211〉34<212>DNA<213〉人T.序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400〉4gaatctagaccaccatggctgctagggtgtgctg34〈210〉5<211〉29<212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈221〉misc一feature<223>引物<400>5ctaatctcctcccccaactcctcccagtc29<210>6<211〉35<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉6gttgggggaggagattaggttaaagatctttgtac35<210〉7<211〉35<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>7gttgggggaggagattaggttaatgatctttgtac3523〈210〉8<211〉35<212>陽(yáng)<213〉人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400>8gttgggggaggagattaggttaatgatctatgtac<210>9<211〉35<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<柳〉9catggtaccttaggcagaggtgaaaaagttgcatg3535<210〉10<211>23<212〉,<213〉人工序列<220><221>misc一feature<223〉引物<柳〉10tacttcaaagactgtttgtttaa23<210〉11<211〉25<212>DNA〈213〉人工序列<220〉〈221〉misc一feature<223〉引物<400〉11aaaaagttgcatggtgctggtgaac<210>12<211〉23<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉寡核苷酸探針<柳>12taggttaatgatc"tgtactag23<210〉13<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉寡核苷酸探針<400〉13taggttaaagatttttgtactag23<210>14<211>23<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉寡核苷酸探針<400〉14taggttaatgatU"gtactag23<210〉15<211〉23<212〉DNA<213>人工序列<220〉〈221〉misc一feature<223〉寡核苷酸探針<400〉1525taggttaatgatctatgtactag23<210〉16<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉寡核苷酸探針"00〉16taggttaaagatttatgtactag2權(quán)利要求1.一種檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)變異的試劑盒，其特征在于，它包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基“A”的序列的引物；或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基“A”的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位為堿基“A”的序列的限制性內(nèi)切酶。2.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列的引物；或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位為堿基"T"的序列的限制性內(nèi)切酶。3.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列的引物；或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列結(jié)合的探針；或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位為堿基"T"的序列的限制性內(nèi)切酶。4.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，還包括容器，以及裝于所述容器的特異性擴(kuò)增乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列的引物；或容器，以及裝于所述容器的與乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列結(jié)合的探針或容器，以及裝于所述容器的可特異性識(shí)別乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位為堿基"A"的序列的限制性內(nèi)切酶。5.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒的基因型是C型。6.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物是具有SEQIDNO:IO和SEQIDNO:ll所示序列的引物對(duì)。7.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的探針具有選自SEQIDNO:12-SEQIDNO:16任一所示的序列。8.—種體外檢測(cè)核酸樣品中乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)變異的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟檢測(cè)該核酸樣品的乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)，并與野生型的乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)比較，存在選自以下變異形式就表明該個(gè)體乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)存在核苷酸變異乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1768位，T—A。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的變異形式還包括乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766位，C—T。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的變異形式還包括乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1762位，A—T;或乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1764位，G—A。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了檢測(cè)核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)變異的試劑或試劑盒。本發(fā)明還公開了體外檢測(cè)核酸樣品中乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)變異的方法。本發(fā)明首次揭示乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子區(qū)第1766或1768位的堿基的突變與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。并且還發(fā)現(xiàn)，該兩個(gè)位點(diǎn)或其一結(jié)合第1762或1764位突變的累積可提高肝癌發(fā)生的可能性。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101532048SQ20081003458公開日2009年9月16日申請(qǐng)日期2008年3月13日優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日發(fā)明者紅屠,曹志剛,霞郭,晏金,錢耕蓀申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所