本發(fā)明涉及一種DNA精確定量的方法，特別是涉及一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)精確定量的方法。

背景技術：

共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA)簡稱為cccDNA，是乙肝病毒感染宿主細胞后在細胞內復制并建立感染狀態(tài)，病毒松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)進入細胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓撲酶等“修復”形成的、結構完整的、超螺旋雙鏈DNA分子。cccDNA存在于細胞核內，成為乙肝病毒的復制“池”，目前尚沒有可以進入細胞核內，并能夠清除cccDNA的藥物，這也是現(xiàn)有抗病毒藥物治療效果不佳和治療后容易復發(fā)的原因之一。

對于cccDNA的定量檢測是肝炎病毒檢測難點，因為有多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA)，必須有效地分離cccDNA和其他類型的病毒DNA。

目前檢測cccDNA的方法包括侵入法PCR(Wong,Hepatology,2004:40)、嵌和引物法(Jun-Bin,J Virol Methods,2003:112)、跨rcDNA探針法(He,Biochem Biophys Res Commun 2002；295)等。侵入法靈敏度低，約104copies/ml，而且容易受到病毒非法復制過程產生的線性雙鏈分子干擾。嵌合引物法除了同樣受到線性雙鏈分子干擾外，在高豐度rcDNA樣本中會受到假陽性干擾?？鐁cDNA雙缺口定量PCR法雖然不會受到線性雙鏈分子干擾，但在高豐度rcDNA樣本中會因為rcDNA的不完全延伸產物正鏈負鏈自退火造成假陽性干擾。

數(shù)字PCR對樣品進行微滴化處理，能夠產生非常均一、重復的1納升液滴，每個樣品形成20,000個液滴。將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。使用數(shù)字PCR可使用與傳統(tǒng)PCR類似的思路進行cccDNA定量(Di,Biotechnol Lett,2015；中國專利申請?zhí)?01410755640.3，201510055540.4)，其原理與傳統(tǒng)的定量PCR類似，利用特異性DNA酶降解rcDNA及單鏈DNA，然后用數(shù)字PCR進行常規(guī)定量操作。

目前對于人肝細胞cccDNA定量的問題主要是：因為rcDNA等其他病毒形式的干擾造成cccDNA定量不準確，普通定量PCR儀器上常使用的雙缺口法會受到rcDNA非特異性擴增的干擾導致假陽性。

因此，有必要開發(fā)一種新的乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)精確定量的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)精確定量的方法。

本發(fā)明所述的乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)精確定量的方法，包括以下步驟：

A.通過核酸定量控制樣本的拷貝數(shù)在10000拷貝之內；

B.采用雙缺口法設計檢測cccDNA及rcDNA的引物及探針；

C.進行數(shù)字式PCR擴增，使用已知濃度的cccDNA質粒作為陽性對照；

D.擴增結束后，在數(shù)字PCR儀分析軟件中調整分析參數(shù)，以陽性對照孔中陽性微粒平均熒光強度的1/2～1/3設為陽性閾值，然后通過數(shù)字式PCR儀自帶軟件分析待測樣本計算樣本中cccDNA拷貝數(shù)，排除由非特異性擴增造成的假陽性。

根據(jù)本發(fā)明所述方法的進一步特征，所述步驟A中，使用分光光度計測量樣本的OD260，OD280數(shù)值，計算樣本內的DNA濃度及純度，使用TE緩沖液調整樣本的濃度在1000-10000/微升之間。

根據(jù)本發(fā)明所述方法的進一步特征，所述步驟B中，擴增條件參考所使用的PCR聚合酶說明書，擴增循環(huán)數(shù)設計在15-25循環(huán)之間。

本發(fā)明利用數(shù)字PCR將每個PCR反應分散到不同單獨液滴的原理，將傳統(tǒng)的跨rcDNA雙缺口定量PCR引用到數(shù)字PCR中，更重要的是利用終點法熒光檢測的原理，利用cccDNA質粒標本作為內參確定檢測閾值，排除rcDNA雙缺口法由于豐度過高不完全延伸產物正鏈負鏈自退火造成的假陽性干擾。本發(fā)明所述方法解決了rcDNA雙缺口法PCR法的假陽性干擾問題，與其他數(shù)字PCR檢測cccDNA相比，無需特異性DNA酶對樣本進行處理，實現(xiàn)了閉管操作，減少了交叉污染風險并簡化操作流程。

附圖說明

圖1是以cccDNA質粒作為陽性對照模板進行數(shù)字PCR擴增后，由機器自行判讀閾值的檢測結果圖。

圖2是以檢測樣本進行數(shù)字PCR擴增，使用儀器自動設置的閾值進行計算得到的檢測結果圖。

圖3是以相同的檢測樣本進行數(shù)字PCR擴增，根據(jù)圖1的結果調整閾值為3500，進行計算得到的檢測結果圖。

具體實施方式

跨rcDNA雙缺口定量PCR法是目前比較流行的cccDNA檢測方法，通過在rcDNA雙鏈分子的缺口處兩側設計引物和探針，使PCR擴增反應在缺口處終止，從而避免了rcDNA分子被擴增造成假陽性，而cccDNA由于沒有缺口，PCR可以正常進行產生陽性信號。但實際反應中，總有部分rcDNA分子由于PCR擴增酶的修復特性使其缺口被修復完整，變成cccDNA分子形式，從而產生假陽性結果。

本發(fā)明所述的乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA精確定量的方法，包括以下步驟：

(1)使用分光光度計測量樣本的OD260，OD280數(shù)值，計算樣本內的DNA濃度及純度，使用TE緩沖液調整樣本的濃度在1000-10000/微升之間，由此通過核酸定量控制樣本的拷貝數(shù)在10000拷貝之內。

(2)采用雙缺口法設計檢測cccDNA及rcDNA的引物及探針；

雙缺口法設計cccDNA的引物及探針，序列如下：

正向引物：CTCCCCGTCTGTGCCTTCT(SEQ ID NO:1)；

反向引物：GCCCCAAAGCCACCCAAG(SEQ ID NO:2)；

探針：FAM-CGTCGCATGGARACCACCGTGAACGCC-BHQ1。

(3)進行數(shù)字式PCR(例如Bio-Rad公司的PCR儀)，擴增條件參考所使用的PCR聚合酶說明書，擴增循環(huán)數(shù)設計在15-25循環(huán)之間，使用已知濃度的cccDNA質粒作為陽性對照；

數(shù)字PCR實驗條件：

95度10min；95度20s，58度60s，25個循環(huán)。

(4)擴增結束后，在數(shù)字PCR儀分析軟件中調整分析參數(shù)，以陽性對照孔中陽性微粒平均熒光強度的1/2～1/3設為陽性閾值，然后通過數(shù)字式PCR儀自帶軟件分析待測樣本計算樣本中cccDNA拷貝數(shù)，排除由非特異性擴增造成的假陽性。

(5)結果分析：

每次實驗取一個孔以cccDNA質粒作為陽性對照模板進行擴增。分析時，先由機器自行判讀陽性對照孔的熒光閾值，然后以陽性對照孔陽性樣本平均熒光強度的1/2-1/3設置樣本孔的判讀閾值，再由儀器計算樣本孔的cccDNA數(shù)量。

圖1是以cccDNA質粒作為陽性對照模板進行擴增后由機器自行判讀閾值的數(shù)字PCR檢測結果圖。圖1顯示以cccDNA質粒作為陽性對照模板進行擴增，由機器自行判讀閾值，分辨陰性、陽性微滴。如圖1所示，可見陽性微滴(上方藍色點)的熒光強度位于6000-8000之間，按陽性微滴平均熒光強度1/2-1/3作為閾值，因此設3500為樣本分析的陽性閾值。

本次實驗采用的樣品實際上不含cccDNA，只含rcDNA。

圖2是以上述檢測樣本進行數(shù)字PCR擴增，使用儀器自動設置的閾值進行計算得到的檢測結果圖。如圖2所示，使用儀器自動設置的閾值進行計算，儀器自設閾值為1500，從而計算出該樣本含30個cccDNA拷貝，出現(xiàn)假陽性。此處的假陽性結果應為rcDNA分子被PCR酶延伸形成的假cccDNA分子并進一步作為模板擴增所導致，這也是傳統(tǒng)PCR試驗中假陽性的主要來源。

圖3是以相同的檢測樣本進行數(shù)字PCR擴增，根據(jù)圖1的結果調整閾值為3500，進行計算得到的檢測結果圖。如圖3所示，根據(jù)圖1的結果設置閾值為3500，儀器計算該樣本含0個cccDNA拷貝，可見該閾值設定排除了rcDNA自延伸導致的假陽性結果。

通過上述實驗表明，本發(fā)明所述的方法有效地解決了rcDNA雙缺口法PCR法的假陽性干擾問題，與其他數(shù)字PCR檢測cccDNA相比，無需特異性DNA酶對樣本進行處理，實現(xiàn)了閉管操作，減少了交叉污染風險并簡化操作流程。

原理分析：數(shù)字PCR儀通過將模板分子分散到20000個微滴中，當模板分子拷貝數(shù)明顯低于微滴數(shù)時，每個微滴中僅包含一個或沒有模板分子，在每個微滴中單獨進行單分子模板的PCR反應。考慮到rcDNA分子在被PCR酶修復為完整的雙鏈DNA前需要1個以上的PCR循環(huán)進行反應，因此同樣為單分子模板的PCR反應，擴增速度將至少慢于正常cccDNA分子模板一個循環(huán)的時間。本發(fā)明是利用終點法熒光檢測的原理，利用cccDNA質粒標本作為內參確定檢測閾值，排除rcDNA雙缺口法由于風度過高不完全延伸產物正鏈負鏈自退火造成的假陽性干擾。