專利名稱：：利用氧化還原電位調(diào)控乳酸發(fā)酵的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及利用氧化還原電位調(diào)控乳酸發(fā)酵的方法。
背景技術(shù)：
：乳酸廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中，乳酸及其鹽類、酯類在食品、醫(yī)藥及化學工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的用途。由于將來石油供應(yīng)可能減少，人們逐漸對再生資源的原料，如L-乳酸等重視起來。聚L乳酸在自然條件下能緩慢分解。因此它不像PVC、PP塑料那樣造成"白色污染"。聚L-乳酸在制造食品包裝材料和農(nóng)用薄膜等方面也有很大潛力。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)的乳酸約占總?cè)樗岙a(chǎn)量的一半以上。由于發(fā)酵過程微通氣甚至不通氣，發(fā)酵液的溶氧非常低，通常低于溶氧電極的檢測低限，導(dǎo)致難以利用普通的溶氧水平參數(shù)優(yōu)化厭氧或微好氧的發(fā)酵過程。在微生物培養(yǎng)過程中，氧化還原電極所測得電位反映了進行最快的氧化還原電對，因此可以利用該電極對正在變化的化學物質(zhì)的相對濃度進行檢測。由于培養(yǎng)基中02/&0氧化還原電對的氧化性要遠大于培養(yǎng)基中存在的其他物質(zhì)，因此即使培養(yǎng)基中僅僅含有痕量氧，也可以在氧化還原電極上產(chǎn)生信號。用氧化還原電極檢測痕量的溶氧，可以得到溶氧電極檢測限之外的測量值，所以可以將發(fā)酵液中的氧化還原電位作為過程參數(shù)來優(yōu)化發(fā)酵過程。近年來，已有文獻報導(dǎo)將氧化還原電位調(diào)控成功應(yīng)用于檸檬酸和木糖醇的發(fā)酵優(yōu)化和放大。然而，目前還不知道氧化還原電位是否對于其他各種類的發(fā)酵產(chǎn)生影響，在乳酸發(fā)酵過程中不同的氧化還原電位是否對發(fā)酵產(chǎn)生較大影響目前還沒有相關(guān)報導(dǎo)，更沒有相關(guān)的發(fā)酵優(yōu)化研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用氧化還原電位調(diào)控乳酸發(fā)酵的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種在乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程中提高乳酸產(chǎn)量的方法，所述方法包括控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-190-150mV。在另一優(yōu)選例中，控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-180-160mV。更優(yōu)選的，控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-175-165mV。在另一優(yōu)選例中，控制發(fā)酵液的氧化還原電位的方法是(1)設(shè)定一發(fā)酵液氧化還原電位控制值，所述的控制值是在-190-150mV之間的數(shù)值；(2)測定發(fā)酵液的氧化還原電位；(3)根據(jù)(2)的測定結(jié)果，當氧化還原電位低于控制值時向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣(或含有氧氣的空氣)，當氧化還原電位高于控制值時停止向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣(或含有氧氣的空氣)。在另一優(yōu)選例中，利用氧化還原電極測定發(fā)酵液的氧化還原電位。在另一優(yōu)選例中，所述的乳酸菌是擬干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵液含有蛋白胨10土2g/L，葡萄糖40土10g/L，酵母膏10土2g/L，牛肉膏6士2g/L，硫酸鎂O.2±0.05g/L，硫酸錳0.2±0.05g/L，氯化鈉0.03±0.01g/L，硫酸亞鐵0.01±0.005g/L,醋酸鈉4±lg/L，檸檬酸二胺2±0.5g/L，磷酸二氫鉀2±0.5g/L，吐溫-801±0.3mL/L。在另一優(yōu)選例中，乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程中，發(fā)酵液的溫度為37土2'C(優(yōu)選37土rC;更優(yōu)選37±0.5°C)。在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵過程中發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為120士20rpm(優(yōu)選120土10rpm;更優(yōu)選120土5rpm)。在本發(fā)明的第二方面，提供一種用于生產(chǎn)乳酸的設(shè)備，所述設(shè)備中包括一發(fā)酵罐本體，所述發(fā)酵罐中盛有培養(yǎng)乳酸的發(fā)酵液；一個或多個進料口和/或出料口；一個或多個通氣口；以及一個或多個氧化還原電極；所述的氧化還原電極可檢測發(fā)酵液的氧化還原電位，當還原電位低于控制值時向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣(或含有氧氣的空氣)，當氧化還原電位高于控制值時停止向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣(或含有氧氣的空氣)；其中，所述的控制值是在-190-150mV之間的數(shù)值。在另一優(yōu)選例中，所述的設(shè)備還包括攪拌裝置；或所述發(fā)酵罐本體是轉(zhuǎn)動的。在另一優(yōu)選例中，所述的設(shè)備還包括控制裝置，所述的控制裝置選自下組:控制發(fā)酵液溫度的溫控裝置、控制發(fā)酵液pH值的裝置、控制攪拌速度的裝置、控制罐體轉(zhuǎn)動的裝置、和/或控制加料或出料的裝置。在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵液含有蛋白胨10土2g/L，葡萄糖40土10g/L，酵母膏10±2g/L,牛肉膏6土2g/L，硫酸鎂O.2±0.05g/L，硫酸錳O.2±0.05g/L，氯化鈉0.03±0.01g/L，硫酸亞鐵0.Ol士O.005g/L，醋酸鈉4土lg/L，檸檬酸二胺2±0.5g/L，磷酸二氫鉀2±0.5g/L，吐溫-801±0.3mL/L。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了脈沖通氣乳酸發(fā)酵過程中ORP變化曲線圖。圖2顯示了脈沖通氣乳酸發(fā)酵過程乳酸、葡萄糖、細胞濃度變化曲線圖。圖3顯示了在乳酸發(fā)酵過程中ORP控制曲線圖。圖4顯示了不同0RP下進行發(fā)酵，菌體生長和代謝曲線。其中，A為不同ORP下菌體濃度(0D620值)變化曲線；B為不同ORP下葡萄糖的濃度變化曲線；C為不同ORP下乳酸濃度變化曲線。圖5顯示了不同ORP下細胞的比生長速率。圖6顯示了葡萄糖在乳酸桿菌內(nèi)的代謝途徑示意圖。圖7顯示了不同ORP下胞外有機酸曲線圖。其中，A為發(fā)酵過程中丙酮酸的變化曲線；B為a酮戊二酸的變化曲線；C為檸檬酸的變化曲線；D為乙酸的變化曲線。圖8顯示了不同ORP下乳酸對葡萄糖平均得率系數(shù)。其中，a:不同ORP下平均乳酸得率系數(shù)；b:不同ORP下不同時間平均乳酸得率系數(shù)變化。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)的研究和試驗，首次揭示一種通過控制發(fā)酵液的氧化還原電位(Oxidation-ReductionPotential,0RP)來優(yōu)化乳酸發(fā)酵的方法，所述方法可使得菌體較快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，以較高的比生長速率生長，可大大提高乳酸菌生產(chǎn)乳酸的產(chǎn)量。深入研究還發(fā)現(xiàn)，可通過調(diào)節(jié)細胞外氧化還原電位來影響細胞的生理特性和細胞內(nèi)的代謝流分布，促進細胞生長和乳酸生成。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人利用在線氧化還原電極研究了控制不同氧化還原電位對乳酸發(fā)酵過程的影響，意外地發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵液的氧化還原電位在-190-150mV區(qū)間時可大大提高乳酸的產(chǎn)量，顯著高于氧化還原電位在約-220mV或約-120mV時。因此，本發(fā)明提供一種在乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程中提高乳酸產(chǎn)量的方法，所述方法包括控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-190-150mV?？刂瓢l(fā)酵液的氧化還原電位的方法是首先設(shè)定一發(fā)酵液氧化還原電位控制值，所述的控制值是在-190-150mV之間的數(shù)值；然后測定發(fā)酵液的氧化還原電位；根據(jù)測定結(jié)果，當氧化還原電位低于控制值時向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣或含有氧氣的空氣，當氧化還原電位高于控制值時停止向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣，從而使得發(fā)酵過程中的氧化還原電位保持在控制值附近。為了控制氧化還原電位所需要控制的氧氣的通氣量根據(jù)不同的發(fā)酵規(guī)模而定，當在本發(fā)明的教導(dǎo)下得知了所需調(diào)節(jié)的氧化還原電位后，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員均可根據(jù)發(fā)酵規(guī)?；蛲ㄟ^有限次的試驗來確定合適的通氣量。更優(yōu)選的，控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-180-160mV;進一步優(yōu)選的是控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-175-165mV。本發(fā)明的方法適合于調(diào)節(jié)乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的過程，所述的乳酸菌可以是多種本領(lǐng)域常規(guī)用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的菌株。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的乳酸菌選自擬干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。用于配制乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基的原料(如碳源、磷源、有機氮源、無機鹽、微量元素)及其使用量均可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)用于乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的原料及使用量而定。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基的原料含有蛋白胨10土2g/L，葡萄糖40土10g/L,酵母膏10士2g/L，牛肉膏6土2g/L，硫酸鎂0.2±0.05g/L，硫酸錳0.2±0.05g/L，氯化鈉0.03±0.01g/L，硫酸亞鐵0.Ol士O.005g/L，醋酸鈉4±lg/L，檸檬酸二胺2±0.5g/L，磷酸二氫鉀2±0.5g/L，吐溫-801±0.3mL/L。培養(yǎng)乳酸菌的其它條件，如溫度、濕度、通氣量等，可采用本領(lǐng)域已知的條件。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程中，發(fā)酵液的溫度為37±2°C;優(yōu)選37±rC;更優(yōu)選37±0.5°C。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程中，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為120土20rpm;優(yōu)選120土10rpm;更優(yōu)選120士5rpm。在本發(fā)明的一個實例中，通過實驗發(fā)現(xiàn)，氧化還原電位水平控制在約-170mV時最有利于乳酸生成，乳酸最高濃度達176g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為94%，其平均乳酸產(chǎn)率3.7g/(Lh)，比ORP控制在約-220mV和約-120mV時分別高19%、37%。在研究過程中，本發(fā)明人還通過對發(fā)酵過程中的胞外有機酸濃度及代謝流分析發(fā)現(xiàn)，氧化還原電位是通過影響細胞內(nèi)代謝流分布來影響乳酸合成的。在本發(fā)明的一個實例中，可以看出，當氧化還原電位在約-170mV時乳酸對葡萄糖的平均得率系數(shù)均要顯著高于氧化還原電位控制在約-220mV和約-120!1^時，說明葡萄糖的代謝流最大量地流向了乳酸生成途徑。當氧化還原電位控制在約-170mV時，TCA循環(huán)能提供足夠多前體來維持細胞活性的前提下，由葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑生成的丙酮酸最大量地流向了乳酸生成途徑，使乳酸產(chǎn)量提高。通過上述方法，本發(fā)明人證實了氧化還原電極有足夠的靈敏度檢測微耗氧發(fā)酵過程的痕量氧，從而應(yīng)用于微好氧發(fā)酵過程中的優(yōu)化，并且可有效地應(yīng)用于乳酸發(fā)酵過程的優(yōu)化。發(fā)酵設(shè)備基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，可以開發(fā)特定用于乳酸發(fā)酵生產(chǎn)用的可調(diào)節(jié)氧化還原電位的發(fā)酵設(shè)備。因此，本發(fā)明一種用于生產(chǎn)乳酸的設(shè)備，所述設(shè)備中包括一發(fā)酵罐本體，所述發(fā)酵罐中盛有培養(yǎng)乳酸的發(fā)酵液；一個或多個進料口和/或出料口；一個或多個通氣口；以及一個或多個氧化還原電極；所述的氧化還原電極可檢測發(fā)酵液的氧化還原電位，當還原電位低于控制值時向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣(或含有氧氣的空氣)，當氧化還原電位高于控制值時停止向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣(或含有氧氣的空氣)；其中，所述的控制值是在-190-150mV之間的數(shù)值。所述的氧化還原電極可以是一個或者是多個，通常情況下只需要一個電極。氧化還原電極的制造、設(shè)置是本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)；利用氧化還原電極來測定電位的方法也是本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)。此外，所述的設(shè)備還可包含其它的一些對于控制或調(diào)節(jié)發(fā)酵過程有用的裝置，這些裝置可以是本領(lǐng)域常用于建造發(fā)酵設(shè)備的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的設(shè)備還包括攪拌裝置，或所述發(fā)酵罐本體是轉(zhuǎn)動的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的控制裝置中還包括選自下組的裝置控制發(fā)酵液溫度的溫控裝置、控制發(fā)酵液pH值的裝置、控制攪拌速度的裝置、控制罐體轉(zhuǎn)動的裝置、和/或控制加料或出料的裝置。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次揭示一種通過控制發(fā)酵液的氧化還原電位來優(yōu)化乳酸發(fā)酵的方法，所述方法可使得菌體較快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，以較高的比生長速率生長，可大大提高乳酸菌生產(chǎn)乳酸的產(chǎn)量。(2)首次揭示可通過調(diào)節(jié)細胞外氧化還原電位來調(diào)節(jié)細胞的生理特性和細胞內(nèi)的代謝流分布，從而促進細胞生長和乳酸生成。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實驗材料和方法1.菌種擬干酪乳桿菌Za"o力aci7^M"/Agracase/(獲自上海國佳生化工程技術(shù)研究中心有限公司)。菌種用15%(v/v)甘油混合MRS發(fā)酵液、-S(TC下保存。2.培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，葡萄糖40，酵母膏10，牛肉膏6，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.2，氯化鈉0.03，硫酸亞鐵0.01，醋酸鈉4，檸檬酸二胺2，磷酸二氫鉀2，吐溫-801mL，碳酸鈣10，NaOH調(diào)pH6.0，121。C滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,葡萄糖40,酵母膏10，牛肉膏6，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.2，氯化鈉0.03，硫酸亞鐵0.01，醋酸鈉4，檸檬酸二胺2，磷酸二氫鉀2，吐溫-801mL，NaOH調(diào)pH6.0，121。C滅菌15min。3.發(fā)酵從甘油管中接種子于試管斜面，37'C下培養(yǎng)22-24h后轉(zhuǎn)入茄子瓶斜面37'C下培養(yǎng)22-24h，再轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基，在37'C培養(yǎng)12h。最后以20%接種量轉(zhuǎn)接裝液量為3L的5L發(fā)酵罐，pH用6mol/L氨水調(diào)節(jié)至6.0，37。C下培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm。4.分析方法菌體密度測定(l)取發(fā)酵液lmL，稀釋到一定濃度，在721分光光度計620nm下測吸光值；(2)取發(fā)酵液10mL在12000rpm下離心5min,用去離子水洗滌沉淀3次，在125'C烘干至恒重，稱重。葡萄糖濃度測定DNS法改進測發(fā)酵液中的還原糖(參見李巧枝，董淑麗.生物化學實驗技術(shù)，北京氣象出版社；2002:51-52)。乳酸濃度測定取發(fā)酵液樣品lmL12000rpm離心5min，取上清液20iiL于200^L20%的高碘酸溶液中，再加入20uL1.0%的乙腈內(nèi)標。充分混合后，取0.5uL進行氣相色譜分析(汽化室溫度14CTC,柱箱溫度130°C，檢測器溫度160°C。載氣氮氣，柱前壓為0.18MPa;空氣壓力為0.05Mpa;氫氣壓力為0.12Mpa)。色譜儀用GC-920氣相色譜儀，色譜柱為GDX-103不銹鋼填充柱3mX3mm(蘭州中科安泰)。有機酸測定取10ml發(fā)酵液，7500rpm4。C離心10min，取1.5ml上清液4°C12000rpm(16090g)離心15min，再取上清液用0.22um的膜過濾，濾液于-2(rC保存待用。采用HPLC法測定發(fā)酵液中的有機酸，色譜柱為AquaS印公司C8(5um，4.6mmX25cm)，采用0.01mol/L磷酸水溶液(用NaH2P04調(diào)節(jié)至pH2,32)作為流動相，流速O.6mL/min，進樣量20叱，柱溫3(TC，檢測波長210nm。氧化還原電位的測定采用氧化還原電位電極(Mettler2100e，瑞士)。5.間接參數(shù)計算細胞比生長速率^=丄義"+'—Z";細胞平均比生長速率5=1;平均得率系數(shù)^。其中，X代表細胞濃度；"代表取樣時間點；A^;代表最終產(chǎn)物濃度；C,代表初始產(chǎn)物濃度&^代表最終底物濃度；5^"w代表初始底物濃度。實施例實施例l脈沖通氣對ORP和乳酸發(fā)酵的影響本實施例中，檢測脈沖通氣對ORP和乳酸發(fā)酵的影響。通氣時間和通氣量如圖1所示。該發(fā)酵過程中ORP和溶氧(DO)的變化情況見圖1。在厭氧發(fā)酵或微好氧發(fā)酵中，溶氧電極對發(fā)酵液中微量溶氧的檢測靈敏度不夠使溶氧這一參數(shù)在發(fā)酵中的應(yīng)用具有了很大的局限性。由圖1可以看出，隨著發(fā)酵的進行，溶氧電極和氧化還原電極的讀數(shù)逐漸下降，當溶氧電極的讀數(shù)下降到零時，氧化還原電極的讀數(shù)還在下降；在脈沖通氣過程中，隨著微通氣的進行，溶氧電極的讀數(shù)沒有出現(xiàn)明顯變化，而氧化還原電極的讀數(shù)隨通氣的波動則很明顯，響應(yīng)時間也不超過半分鐘。通過脈沖通氣實驗可以看出，在厭氧發(fā)酵或微好氧發(fā)酵中，氧化還原電極有足夠的靈敏度來檢測發(fā)酵液中微量氧的變化，而且響應(yīng)時間快，從而可以作為微好氧發(fā)酵過程中的一個參數(shù)來調(diào)控發(fā)酵。在該發(fā)酵過程中，隨著菌體的生長和細胞的代謝，發(fā)酵液中的溶氧逐漸降低，氧化還原電位逐漸下降。圖1結(jié)合圖2，可以看出隨著發(fā)酵液中葡萄糖的消耗，每次脈沖通氣之后，0RP反彈后回復(fù)的值均比反彈前來得高。發(fā)酵至60小時，最大細胞濃度是7.4g/L(細胞干重)，乳酸最終濃度152g/L。如果在48h(乳酸達到最高濃度時)結(jié)束發(fā)酵，乳酸的產(chǎn)率為3.16g/(Lh)。實施例2控制不同的氧化還原電位對乳酸發(fā)酵的影響為了考察氧化還原電位具體是怎樣影響乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的，本實施例對比了三種ORP水平下的發(fā)酵情況，其中，0RP1為-220mV左右、0RP2為-170mV左右、0RP3為-120mV左右。之所以選這個三個水平，是因為前面脈沖通氣發(fā)酵過程中，ORP在這個范圍之內(nèi)變化。0RP的控制情況見圖3;不同0RP下菌體生長和代謝情況見圖4，發(fā)現(xiàn)不同的氧化還原電位對細胞量的影響不大。當發(fā)酵液中的氧化還原電位為0RP2時最有利于乳酸的生成，乳酸最高濃度達到177g/L，平均產(chǎn)率為3.7g/(L，h)，分別比0RP1、0RP3高19%、37%。圖4發(fā)酵液中葡萄糖濃度和細胞濃度(ODe2。)變化曲線顯示，到60小時，不同ORP水平下，細胞濃度相差不大，葡萄糖基本都被細胞耗完，而初始糖濃度都相同，也就是被細胞吸收消耗的葡萄糖量在不同的ORP下是基本一樣的，但最后產(chǎn)生的乳酸濃度卻不同，在0RP1、ORP2、ORP3下分別為154g/L、177g/L、131g/L，這說明ORP是通過影響了細胞內(nèi)的代謝流分布而影響乳酸產(chǎn)量的。不同ORP下細胞的比生長速率見圖5。細胞從種子培養(yǎng)基環(huán)境接種到發(fā)酵液環(huán)境會有一個適應(yīng)階段。在這個適應(yīng)階段細胞是以較低的比生長速率生長或者不生長的。從圖5可以看出，細胞在ORP為ORP2時最快適應(yīng)厭氧環(huán)境，以最高的比生長速率生長。而乳酸的生成是與細胞生長部分相關(guān)的，比生長速率越高，產(chǎn)酸率就越高。乳酸菌在ORP為0RP2下最快適應(yīng)外界環(huán)境后以最高的比生長速率生長，從而最有利于乳酸的生成。不同ORP下乳酸發(fā)酵的各發(fā)酵參數(shù)見表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例3氧化還原電位對細胞內(nèi)代謝流分布的影響以往研究提出這樣一個ORP調(diào)節(jié)機制，即細胞外0RP水平會影響細胞內(nèi)參與電子轉(zhuǎn)移和以金屬離子為活性中心的酶活，進一步引起細胞內(nèi)NAD7NADH比值的變化。當NAD7NADH比值上升會激活NAD+相關(guān)酶的酶活(丙酮酸脫氫酶，甘油脫氫酶、1，3-丙二醇氧化還原酶等)；當NADVNADH比值下降會激活NADH相關(guān)酶的酶活。從而引起細胞內(nèi)代謝流分布的變化。葡萄糖在乳酸桿菌內(nèi)的代謝途徑已經(jīng)研究得比較清楚，圖6是其代謝途徑示意圖。葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸，丙酮酸經(jīng)過不同的途徑生成不同的產(chǎn)物，由表1可以看出其中大部分經(jīng)過乳酸脫氫酶催化生成了乳酸(乳酸得率分別為84%(0RP1)、93%(0RP2)、69%(0RP3))，小部分通過檸檬酸循環(huán)為菌體生長提供能量和各種前體，其余通過其他途徑生成其他副代謝產(chǎn)物(比如乙酸等)。其中TCA循環(huán)途徑為菌體提供能量和各種生長所必需的前體。如果TCA循環(huán)被削弱了，菌體得不到足夠多的能量和前體，其生長必然會受到限制，而不利于乳酸的生成；相反，如果TCA循環(huán)過度加強了，就有過多的葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑生成的丙酮酸進入TCA循環(huán)，造成進入生成乳酸途徑的碳原減少，反而不利于乳酸的生成。圖7是在不同的ORP水平下乳酸發(fā)酵過程各種胞外有機酸濃度，其中主要是涉及TCA循環(huán)的有機酸。從圖中可以看出，涉及TCA循環(huán)的有機酸都是早期比較高，這可能是因為種子在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，TCA循環(huán)被削弱，導(dǎo)致有機酸的積累。而接進發(fā)酵罐后，隨著供氧的改善，TCA循環(huán)得到了加強，TCA循環(huán)中的有機酸被重新利用，又使有機酸濃度降低。在不同的0RP下，種子階段積累下來的有機酸被重新利用的情況是不一樣的，從圖7中可以看出，TCA循環(huán)中的相關(guān)有機酸隨著0RP的升高被重新利用得越快。這可能是因為隨著ORP的升高，細胞外環(huán)境對細胞供氧能力越強，而氧氣是作為TCA循環(huán)中的電子載體，在一定范圍內(nèi)ORP越高，細胞內(nèi)的TCA循環(huán)越強，越能給細胞的生長提供能量和前體。這也可以從丙酮酸的變化曲線可以得到證實，0RP為0RP1時的丙酮酸積累一直要高于ORP為0RP3和0RP2。不同ORP下乳酸對葡萄糖平均得率系數(shù)見圖8，可以看出，當0RP在-170mV時乳酸對葡萄糖的平均得率系數(shù)均要高于0RP1和0RP3，說明葡萄糖的代謝流最大量地流向了乳酸生成途徑。當0RP控制在0RP2左右時，TCA循環(huán)能提供足夠多前體來維持細胞活性的前提下，由葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑生成的丙酮酸最大量地流向了乳酸生成途徑，使乳酸產(chǎn)量提高了。細胞外ORP正是通過影響細胞的生理特性和細胞內(nèi)的代謝流分布，來影響細胞生長和乳酸生成的。由上述實施例可見-(1)、在厭氧或微好氧發(fā)酵中氧化還原電極有足夠的靈敏度來檢測發(fā)酵液中痕量氧濃度，因此氧化還原電位可以作為厭氧或微好氧發(fā)酵的過程參數(shù)用于優(yōu)化發(fā)酵過程。(2)、在乳酸發(fā)酵中，氧化還原電位影響菌體生長和乳酸生成。通過實驗發(fā)現(xiàn)，當ORP在-170mV左右時，菌體最快適應(yīng)外界環(huán)境，一開始就以最高的比生長速率生長，生成的乳酸濃度最高。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種在乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程中提高乳酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述方法包括控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-190～-150mV。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-180-160mV。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，控制發(fā)酵液的氧化還原電位的方法是(1)設(shè)定一發(fā)酵液氧化還原電位控制值，所述的控制值是在-190-150mV之間的數(shù)值；(2)測定發(fā)酵液的氧化還原電位；和(3)根據(jù)(2)的測定結(jié)果，當氧化還原電位低于控制值時向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣，當氧化還原電位高于控制值時停止向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，利用氧化還原電極測定發(fā)酵液的氧化還原電位。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乳酸菌是擬干酪乳桿菌。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵液含有蛋白胨10土2g/L，葡萄糖40土10g/L，酵母膏10土2g/L，牛肉膏6±2g/L，硫酸鎂O.2±0.05g/L，硫酸錳O.2±0.05g/L,氯化鈉0.03±0.01g/L，硫酸亞鐵0.01±0.005g/L，醋酸鈉4±lg/L，檸檬酸二胺2±0.5g/L,磷酸二氫鉀2±0.5g/L，吐溫-801±0.3mL/L。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程中，發(fā)酵液的溫度為37±2°C。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵過程中發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為120士20rpm。9.一種用于生產(chǎn)乳酸的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備中包括一發(fā)酵罐本體，所述發(fā)酵罐中盛有培養(yǎng)乳酸的發(fā)酵液；一個或多個進料口和/或出料口；一個或多個通氣口；以及一個或多個氧化還原電極；所述的氧化還原電極用于檢測發(fā)酵液的氧化還原電位，當還原電位低于控制值時向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣，當氧化還原電位高于控制值時停止向發(fā)酵液內(nèi)通入氧氣；其中，所述的控制值是在-190-150mV之間的數(shù)值。10.如權(quán)利要求9所述的設(shè)備，其特征在于，所述發(fā)酵液含有蛋白胨10土2g/L，葡萄糖40土10g/L，酵母膏10土2g/L，牛肉膏6土2g/L，硫酸鎂O.2±0.05g/L，硫酸錳0.2±0.05g/L，氯化鈉0.03±0.01g/L，硫酸亞鐵0.Ol土O.005g/L，醋酸鈉4±lg/L，檸檬酸二胺2±0.5g/L,磷酸二氫鉀2±0.5g/L，吐溫-801±0.3mL/L。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了一種利用氧化還原電位調(diào)控乳酸發(fā)酵的方法，所述方法包括控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-190～-150mV。本發(fā)明還公開了一種用于生產(chǎn)乳酸的設(shè)備。本發(fā)明的方法可使得菌體較快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，以高的比生長速率生長，可大大提高乳酸菌生產(chǎn)乳酸的產(chǎn)量。文檔編號C12M1/02GK101235397SQ200810034199公開日2008年8月6日申請日期2008年3月4日優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日發(fā)明者炬儲,莊英萍,張嗣良,徐國謙,王永紅,鄭繼岱申請人:華東理工大學