專利名稱：：用于檢測(cè)o型口蹄疫病毒的lamp試劑盒及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)o型口蹄疫病毒的試劑盒及其建立方法和應(yīng)用，特別涉及一種用于檢測(cè)0型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒及其建立方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科B病毒屬，是目前所知病毒中最細(xì)微的一級(jí)，其所導(dǎo)致的口蹄疫病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類動(dòng)物傳染病之首，其主要危害對(duì)象是豬、羊、牛等偶蹄動(dòng)物，發(fā)病率可達(dá)100%,并能形成大范圍的流行，危害嚴(yán)重，是進(jìn)出境檢疫和國(guó)家強(qiáng)制上報(bào)的必檢項(xiàng)目。但是目前的檢測(cè)手段一般是先現(xiàn)場(chǎng)采樣，然后再送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，存在流程長(zhǎng)、耗時(shí)多、成本高等弊端，既影響檢測(cè)速度，更不利于疫病的及時(shí)控制與監(jiān)測(cè)。環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由T.Notomi(2000)發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴4條特異設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列[5]。近年來(lái)，國(guó)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)。MasakiImai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)室確診體系；NobuyukiHayashi等人(2007)針對(duì)四種香酒酵母的ITS序列設(shè)計(jì)了LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測(cè)體系。LAMP還可以檢測(cè)其他與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血病(VHS)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒，人類皰疹病毒8型、造血組織壞死病毒(I冊(cè)NV)、番茄斑萎病毒、番茄黃化曲葉病毒等。但尚未見(jiàn)有該方法在口蹄疫病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供了一種用于檢測(cè)0型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒。本發(fā)明的目的之二在于提供該試劑盒的建立方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該試劑盒的應(yīng)用方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種用于檢測(cè)0型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒，其特征在于該試劑盒由包含有六條LAMP引物的L扁P反應(yīng)液構(gòu)成的檢測(cè)體系；23叱LAMP反應(yīng)液的具體配置為GEPC水rhermoPolbuffer(10X)Mg2'(25mM)Betaine(5M)dNTP(10mM)PrimerF3/B3(50(40PrimerFIP/BIP(50湖)PrimerLF/LB(50湖)4.7HL2.5HL機(jī)5ML3叱各0.1叱各0.8ML各0.4叱Bst酶(8U/ML)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/叱)1PL0.2叱注表中所列各成分濃度為母液濃度-其中，六條LAMP引物為Primernametypelengthsequence(5，to3，)F3ForwardOuter20AGGCTATCCTCTCCTTTGCAB3ReverseOuter19ATTATGCGTCACCGCACACFIPForwardInner38TCTGGTCCAGAGTGGACGGCCCGTGGGACCATACAGGABIPReverseInner41GAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCGTTCACCCAACGCAGGTAALFForwardLoop20GTCCTGCCACGGAGATCAACLBReverseLoop21GAGATTCCAAGCTACAGATCA一種建立上述的用于檢測(cè)0型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.從基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得所有O型口蹄疫病毒基因組序列，通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，找到O型口蹄疫病毒基因的特異性的保守耙序列，該保守靶的DNA序列為CCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGCATAATCCCTCAGb.根據(jù)步驟a所得的保守耙的DNA序列，設(shè)計(jì)出上述的六條LAMP引物；c.根據(jù)步驟b所得的六條LAMP引物配置出LAMP反應(yīng)液，構(gòu)成上述的檢測(cè)體系。一種應(yīng)用上述的用于檢測(cè)0型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒來(lái)檢測(cè)0型口蹄疫病毒的方法，其特征在于該方法的具體步驟為首先配置出23A上述LAMP反應(yīng)液，然后提取待測(cè)樣品中的核酸，取2叱該核酸提取液加到上述已配制好的LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為25叱，10000rpm瞬時(shí)離心30S以混勻反應(yīng)液；最后放于65。C恒溫1小時(shí)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增;取出反應(yīng)管，往反應(yīng)液中添加5叱Picogreen(或SYBRgreen),若反應(yīng)液變成綠色，則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在O型口蹄疫病毒，若為桔黃色，則待測(cè)樣品中不存在0型口蹄疫病毒。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)1)高特異性:6條引物對(duì)靶序列8個(gè)特異區(qū)域的識(shí)別保證了LAMP擴(kuò)增的高度特異性，即LAMP能從相差僅一個(gè)核苷酸的基因標(biāo)本中，找出相應(yīng)得靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，參見(jiàn)圖1。2)高靈敏度LAMP靈敏度可與PCR相媲美或更高，其所需擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少，參見(jiàn)圖2。3)鑒定簡(jiǎn)便向反應(yīng)液中加入picogree(或SYBRgreen)等熒光染料時(shí)，如果有擴(kuò)增，picogreen就會(huì)和DNA結(jié)合，通過(guò)肉眼觀察即可，如果反應(yīng)液變綠，則為陽(yáng)性；如反應(yīng)液為桔黃色，則說(shuō)明呈陰性反應(yīng)，參見(jiàn)圖3。4)操作簡(jiǎn)單:一旦LAMP引物設(shè)計(jì)成功，只要將檢測(cè)樣品(靶核酸)和試劑一起放入65'C恒溫水浴鍋，大約lh，就可以判斷擴(kuò)增與否。5)快速、高效擴(kuò)增整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)一小時(shí)即可完成，且產(chǎn)率可達(dá)到0.5mg/ml。本發(fā)明的檢測(cè)體系可以在等溫條件下，快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測(cè)到O型口蹄疫病毒，不需要復(fù)雜儀器，為食品安全檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好滿足目前對(duì)口蹄疫現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的迫切需要，用于進(jìn)出口檢疫、食品衛(wèi)生部門(mén)、畜牧詞養(yǎng)場(chǎng)等的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。圖1口蹄疫病毒LAMP檢測(cè)體系的特異性，其中M.DNAMarker;19.分別為口蹄疫病毒、豬水泡病病毒、豬皰疹病毒、豬環(huán)狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬傳染性腸胃炎病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒；10.陰性對(duì)照。圖2LAMP(A)、RT-PCR(B)和熒光PCR(C)檢測(cè)口蹄疫病毒靈敏度，其中M.DNAMarker;19.分別為10_1、10—2……10—9稀釋度的口蹄疫病毒核酸；10.陰性對(duì)昭。"、、o圖3本發(fā)明檢測(cè)體系Picogreen熒光檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果圖，陽(yáng)性反應(yīng)呈綠色，陰性反應(yīng)為桔黃色。圖4LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性圖，用HinfI內(nèi)切酶確定產(chǎn)物的特異性，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳圖譜上呈階梯狀(泳道l)，經(jīng)內(nèi)切酶消化，出現(xiàn)128bp和61bp兩條電泳條帶(泳道2)，與理論預(yù)期值相符合，說(shuō)明是特異性擴(kuò)增。具體實(shí)施方式1，特異性DNA序列査找從美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)一GenBank檢索獲得多株0型口蹄疫病毒基因組序列，通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行同源性分析即找到特異性的保守耙序列進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，該特異性保守靶序列為CCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGCATAATCCCTCAG2，LAMP引物設(shè)計(jì)通過(guò)專門(mén)的LAMP引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物PrimerdesignV3(http:〃primerexplorer.jp/elamp3.0.0/index.html)設(shè)計(jì)的具體LAMP引物為:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3，檢測(cè)體系建立設(shè)置不同終濃度的Mg2+(2,4，6,8，10,12mM)、dNTP(0，0.2,0.4,0.6,0.8，1.0.1.2mM)、內(nèi)外引物濃度比例(1:1，1:2，1:4，1:8,1:10)，分別在不同反應(yīng)時(shí)間(15，30，45,60min)和溫度(60°C，63°C,65°C)下反應(yīng)，最終獲得最佳反應(yīng)參數(shù)，從而建立口蹄疫病毒LAMP檢測(cè)體系。優(yōu)化的檢測(cè)體系(23U1)如下lXThermoPolbuffer,6mMMg2+，1Mbetaine，1.2mMdNTP,0.2uM外引物(F3和B3)，L6yM內(nèi)引物(FIP和BIP)，0.8uM環(huán)引物(LF和LB)，2iU模板RNA，1UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶，8UBst聚合酶。檢測(cè)反應(yīng)條件65°C恒溫lh。注Mg2+終濃度=(母液濃度25mMX4ul+ThermoPolbuffer中含20mMX2.l)/25u14，檢測(cè)體系靈敏性、特異性分析以豬水泡病病毒、豬皰疹病毒、豬環(huán)狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬傳染性腸胃炎病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒八種病毒核酸為模板檢測(cè)體系的特異性。LAMP檢測(cè)體系的特異性測(cè)試良好，可以在眾多病毒中特異性的檢測(cè)到0型口蹄疫病毒。以10—'、10—2……l(T稀釋度的口蹄疫病毒核酸為模板分別進(jìn)行LAMP、RT-PCR和熒光PCR，比較三種檢測(cè)方法的靈敏度。LAMP靈敏度比普通RT-PCR法高100倍，比熒光PCR法高10倍。其檢測(cè)程序?yàn)?1)反應(yīng)體系(23A)配制GEPCThermoPolMgS04BetaindNTPPrimerF3/BPritnerFIP/BPriraerLF/水buffer(10X)(25mM)e(5M)(10mM)3(50MM)IP(50PM)LB(50MM)4.7ML2.5叱祉5叱3叱各0.1叱各0.8叱各0.4叱Bst酶(8UMJAMV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/叱)1叱0.2叱(2)LAMP擴(kuò)增用Trizon或RNeasyMiniKit等商品化RNA提取試劑盒提取待測(cè)樣品中的核酸。取核酸提取液加到上述已配制好的LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為25化，10000rpm，瞬時(shí)離心30S以混勻反應(yīng)液。然后放于65。C恒溫1小時(shí)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。(3)結(jié)果判斷取出反應(yīng)管，往反應(yīng)液中添加5吣Picogreen(或SYBRgreen),若反應(yīng)液變成綠色，則說(shuō)明反應(yīng)呈陽(yáng)性，若為桔黃色，則反應(yīng)為陰性，參見(jiàn)圖3。8為驗(yàn)證本發(fā)明效果的可靠性，進(jìn)行以下鑒定1、LAMP擴(kuò)增特異性確認(rèn)用HinfI內(nèi)切酶判定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，確定其為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)內(nèi)切酶消化，出現(xiàn)128bp和61bp兩條電泳條帶(泳道2)，與理論預(yù)期值相符合，說(shuō)明是特異性擴(kuò)增。參見(jiàn)圖4。2、口蹄疫病毒LAMP檢測(cè)體系的特異性，以豬水泡病病毒、豬皰疹病毒、豬環(huán)狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬傳染性腸胃炎病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒八種病毒核酸為模板檢測(cè)體系的特異性，參見(jiàn)圖1。口蹄疫LAMP檢測(cè)法只能擴(kuò)增口蹄疫病毒核酸而不能檢測(cè)到其他非目標(biāo)病毒核酸，故所建立的LAMP具有良好的檢測(cè)特異性。3、口蹄疫病毒LAMP檢測(cè)體系的靈敏度及與普通RT-PCR、熒光PCR的比較以10—'、10—2……1(T稀釋度的口蹄疫病毒核酸為模板分別進(jìn)行LAMP、RT-PCR和熒光PCR，比較三種檢測(cè)方法的靈敏度，參見(jiàn)圖2。北京索奧生物科技有限公司生產(chǎn)的口蹄疫核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒RT-PCR法和PCR熒光探針?lè)ǚ謩e只能檢測(cè)到l(T和10—4濃度核酸。故所建立的口蹄疫LAMP檢測(cè)法比RT-PCR靈敏度高100倍，比熒光PCR高10倍。序列表<110>上海大學(xué)<120>用于檢測(cè)0型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒及其建立方法和應(yīng)用<140><141><160>7<210>1<211>200<212>DNA<213>0型口蹄疫病毒基因的特異性保守序列<220><222><223><400>1CCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGCATAATCCCTCAG<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><222><223><400>2AGGCTATCCTCTCCTTTGCA20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><222><223><400>3ATTATGCGTCACCGCACAC19<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><222><223><400>4TCTGGTCCAGAGTGGACGGCCCGTGGGACCATACAGGA38210>5<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><222><223><400>5GAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCGTTCACCCAACGCAGGTAA41210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><222><223><400>6GTCCTGCCACGGAGATCAAC20210>7<21>21<212>DNA<213>人工序列<220><222><223><400>7GAGATTCCAAGCTACAGATCA2權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)O型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒，其特征在于該試劑盒由包含有六條LAMP引物的LAMP反應(yīng)液構(gòu)成的檢測(cè)體系；23μLLAMP反應(yīng)液的具體配置為<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>其中，六條LAMP引物為<tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>2.—種建立上述的用于檢測(cè)O型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.從基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得所有O型口蹄疫病毒基因組序列，通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，找到O型口蹄疫病毒基因的特異性的保守耙序列，該保守耙的DNA序列為CCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGCATAATCCCTCAGb.根據(jù)步驟a所得的保守靶的DNA序列，設(shè)計(jì)出上述的六條LAMP引物；c.根據(jù)步驟b所得的六條LAMP引物配置出LAMP反應(yīng)液，構(gòu)成上述檢測(cè)體系。3.—種應(yīng)用上述的用于檢測(cè)0型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒來(lái)檢測(cè)0型口蹄疫病毒的方法，其特征在于該方法的具體步驟為首先配置出23叱上述LAMP反應(yīng)液，然后提取待測(cè)樣品中的核酸，取2化該核酸提取液加到上述已配制好的LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為25叱，10000rpm瞬時(shí)離心30S以混勻反應(yīng)液；最后放于65。C恒溫1小時(shí)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；取出反應(yīng)管，往反應(yīng)液中添加5PLPicogreen或SYBRgreen,若反應(yīng)液變成綠色，則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在0型口蹄疫病毒，若為桔黃色，則待測(cè)樣品中不存在O型口蹄疫病毒。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)O型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒及其建立方法和應(yīng)用。該試劑盒由包含有六條LAMP引物的LAMP反應(yīng)液構(gòu)成的檢測(cè)體系；23μLLAMP反應(yīng)液的具體配置如右，該檢測(cè)體系可以在等溫條件下，快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測(cè)到O型口蹄疫病毒，不需要復(fù)雜儀器，為食品安全檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好滿足目前對(duì)口蹄疫現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的迫切需要，用于進(jìn)出口檢疫、食品衛(wèi)生部門(mén)、畜牧飼養(yǎng)場(chǎng)等的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101294225SQ20081003412公開(kāi)日2008年10月29日申請(qǐng)日期2008年2月29日優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日發(fā)明者方雪恩,沁陳申請(qǐng)人:上海大學(xué)