檢測口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片以及檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)、水泡性口炎（Vesicular stomatitis, VS)分別是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV)、水泡性口 炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV)引起的哺乳動物的急性、高度接觸性傳染病， 其中，口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV)有3種分型，具體是口蹄疫病毒 0型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型?？谔阋卟《竞退菪钥谘撞《径伎梢愿腥矩i， 發(fā)病率極高，并能夠形成大范圍的流行，能引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，均被世界動物衛(wèi)生組 織（OIE)列為法定報(bào)告動物疫病。這兩種疾病均以豬舌、唇、口腔黏膜、乳頭和蹄冠等處上 皮發(fā)生水皰為主要癥狀，因此在臨床癥狀上無法對這兩種疾病進(jìn)行區(qū)分，必須通過病原學(xué) 進(jìn)行鑒別診斷。
[0003] 目前，對這兩種疾病的診斷多采用分離鑒定及常規(guī)的血清學(xué)方法，所需時(shí)間較長， 也有PCR技術(shù)的鑒別方法，但還沒有建立操作性強(qiáng)且能同時(shí)鑒別兩種病毒的方法。因此，有 必要建立能同時(shí)進(jìn)行兩種疫病快速檢測的方法，同時(shí)對口蹄疫病毒進(jìn)行分型檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、可同時(shí)檢測口蹄疫病 毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片和試劑盒。
[0005] 基因芯片，是指指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、CDNA、gen〇mi C DNA、多肽、 抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的 生物分子點(diǎn)陣，其突出的特點(diǎn)是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本發(fā)明檢測口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片，它包括固相載體以及 固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO :1~4所示任意一個(gè)或者任意多個(gè)基 因片段，用于分別檢測口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/或水泡 性口炎病毒。
[0007] 其中，它還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO :13~14所示。
[0008] 本發(fā)明檢測口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的試劑盒，它包括前述的基因芯片 以及擴(kuò)增試劑；其中，擴(kuò)增試劑包括SEQ ID NO :5~6、SEQ ID NO :7~8、SEQ ID NO :9~ 10和/或SEQ ID NO :11~12所示引物對，用于擴(kuò)增口蹄疫病毒0型、口蹄疫病毒A型、口 蹄疫病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒。
[0009] 其中，所述引物對中，上游引物與下游引物的摩爾比為1:1。
[0010] 其中，所述SEQ ID NO :5、7、9、11所示上游引物標(biāo)記有熒光染料。
[0011] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :1~4所示任意一個(gè)或者任意多個(gè)基因片段在制備檢 測口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒的基因 芯片的用途。
[0012] 其中，所述基因芯片還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO :13~14所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :5 ~6、SEQ ID NO :7 ~8、SEQ ID NO :9 ~10 和 / 或 SEQ ID NO :11~12所示引物對以及SEQ ID NO :1~4所示任意一個(gè)或者任意多個(gè)基因片 段所示基因片段在制備檢測口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/ 或水泡性口炎病毒的試劑盒中的用途；其中，引物對為擴(kuò)增試劑，SEQ ID NO :1~4所示基 因片段為檢測探針。
[0014] 本發(fā)明基因芯片和試劑盒可以同時(shí)檢測口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒，而且能對 口蹄疫病毒進(jìn)行分型檢測，特異性強(qiáng)，靈敏度高耗時(shí)短，檢測快速，可以迅速掌握畜禽疫病 的感染情況臨床應(yīng)用前景良好。
[0015] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0016] 圖1芯片矩陣設(shè)計(jì)
[0017] 圖2水化溫度優(yōu)化
[0018] 圖 3 封閉液配比優(yōu)化。1: 0· 5 % BH4Na, 25 % Ethanol ;2: 0· 25 % BH4Na, 25 % Ethanol ;3:0% BH4Na, 25% Ethanol ;4:0. 5% BH4Na, 15% Ethanol ;5:0. 25% BH4Na, 15% Ethanol ；:0 % BH4Na, 15 % Ethanol ；7:0.5 % BH4Na, 0 % Ethanol ；8:0. 25 % BH4Na, 0 % Ethanol ；9:0% BH4Na, 0% Ethanol.
[0019] 圖4探針篩選矩陣設(shè)計(jì)
[0020] 圖5 口蹄疫0型探針篩選
[0021] 圖6 口蹄疫Asia I型探針篩選
[0022] 圖7 口蹄疫A型探針篩選
[0023] 圖8水泡性口炎探針篩選
[0024] 圖 9 口蹄疫 0 型芯片靈敏度。A: 10-3 ;B: 10-4 ;C: 10-5 ;D: 10-6.
[0025] 圖 10 口蹄疫 A 型芯片靈敏度。A: 10-5 ;B: 10-6 ;C: 10-7 ;D: 10-8.
[0026] 圖 11 口蹄疫 Asia I 型芯片靈敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0027] 圖 12 水泡性口炎芯片靈敏度。A: 10-5 ;B: 10-6 ;C: 10-7 ;D: 10-8.
[0028] 圖 13 口蹄疫 0 型引物的特異性實(shí)驗(yàn)。I :FMDV-0 ;2:FMDV-A ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0029] 圖 14 口蹄疫 A 型引物的特異性實(shí)驗(yàn)。1:FMDV-A ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0030] 圖 15 口蹄疫 Asia I 型引物的特異性實(shí)驗(yàn)。：FMDV-Asia I ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0031] 圖 16 水泡性口炎引物的特異性實(shí)驗(yàn)。1:VSV ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ;4:FMDV-Asia I ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0032] 圖17 口蹄疫0型不同廠家芯片檢測比對。A:上海百傲科技有限公司BsiO?丨醛基 基片；B:北京博奧生物有限公司晶芯辦醛基基片
[0033] 圖18 口蹄疫A型不同廠家芯片檢測比對。A:上海百傲科技有限公司BaiOfl簽基 基片；B:北京博奧生物有限公司晶芯M醛基基片
[0034] 圖19 口蹄疫Asia I型不同廠家芯片檢測比對。A:上海百傲科技有限公司BaiO'! 醛基基片；B:北京博奧生物有限公司晶醛基基片
[0035] 圖20水泡性口炎不同廠家芯片檢測比對。A:上海百傲科技有限公司BaiO綱醛基 基片；B:北京博奧生物有限公司晶芯_醛基基片
【具體實(shí)施方式】
[0036] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0037] I. 1材料試劑：
[0038]

[0041] I. 3實(shí)驗(yàn)試劑的配制
[0042] 引物稀釋：根據(jù)合成單，將合成的引物干粉加入適量滅菌超純水，制成100 μΜ的 引物貯存液，使用時(shí)按照1 :4(引物貯存液：滅菌超純水）的體積比將其稀釋成20 μM的引 物使用液；
[0043] 10g/L瓊脂糖凝膠：稱取Ig瓊脂糖凝膠，加入IOOmLl X TAE電泳緩沖液中，微波爐 加熱3min，溶解完全后加入10mg/mL的EB 5 μ L，震蕩混勾，倒入膠槽內(nèi)，待凝固后點(diǎn)樣；
[0044] 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：按照產(chǎn)品說明書，稱取所需質(zhì)量的培養(yǎng)基干粉于三角錐瓶內(nèi)，加 入相應(yīng)比例的去離子水，121°C滅菌20min，備用；
[0045] 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按照產(chǎn)品說明書，稱取所需質(zhì)量的培養(yǎng)基干粉于三角錐瓶內(nèi)，加 入相應(yīng)比例的去離子水，121 °C滅菌20min，備用。
[0046] 20XSSC :稱取 NaCl，175. 2g，檸檬酸三鈉·2Η20，100· 5g，溶解于少量 mini-Q 超純 水中，