豬口蹄疫病毒非結構蛋白3abc抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。它包括口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶聯(lián)反應板和酶標記抗抗體；所述口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗原表位多肽為序列表中序列1所示的多肽。本試劑盒使用化學合成非結構蛋白3ABC抗原肽包被反應板，抗原用量少、靈敏性和特異性高，可以高效地檢測是否存在口蹄疫病毒感染。本發(fā)明試劑盒特異性好、敏感、高效，具有良好的市場前景。
【專利說明】豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒非結構蛋白抗 體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，特別是豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

【背景技術】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth diseasevirus, FMDV)感染引起的偶蹄動物共患的一種烈性傳染病?？谔阋叩闹滤缆屎艿?， 但是感染率很高。發(fā)病的主要癥狀為：口腔粘膜、舌、唇、鼻鏡、蹄叉、乳頭等部位發(fā)生水皰， 破潰形成爛斑，病畜蹄痛臥地、嚴重者蹄殼邊緣潰裂或脫殼。不同動物的癥狀稍有不同，妊 娠母?？赡芰鳟a，而后導致繁殖力降低；豬則以破蹄為最主要癥狀；山羊和綿羊的癥狀通 常比牛溫和?？谔阋邆魅拘愿撸瑐鞑パ杆?，感染豬、牛、羊等牲畜常導致幼畜死亡，成年動物 生產能力急劇下降，嚴重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和畜產品的生產供應。由于其在世界范圍內廣 泛分布，能感染70多種家養(yǎng)和野生動物，且發(fā)病率極高（約為100% )，嚴重影響畜牧業(yè)生 產和國際貿易，因而受到各國的高度重視。國際獸醫(yī)局（OIE)在1984年修訂的動物傳染病 分類中將口蹄疫列為A類傳染病之首。
[0003] 口蹄疫病毒（FMDV)是小RNA病毒科（picornavi-ridae)，口蹄疫病毒屬 (aphthovirus)的成員，由一條長約8500個核苷酸的單股、正鏈RNA和衣殼蛋白組成。病毒 衣殼由4種結構蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60個拷貝組成，其中VPl和VP3是主要免疫 性抗原?？谔阋卟《荆‵MDV)具有多型性、易變性等特點，具有7個血清型，分別為A、0、C、 SATI、SATII、SATIII及AsiaI型，每個型又可分為若干個亞型，目前發(fā)現的亞型有70多個。 由于不斷發(fā)生抗原漂移，因此并不能嚴格區(qū)分亞型。血清型間幾乎無交叉免疫反應，同一型 內部不同毒株之間抗原性也有一定變化，這就給口蹄疫的診斷和防治工作帶來很大難度。
[0004] 口蹄疫病毒基因所編碼產生的非結構蛋白有L、2A、2BC、3AB、3ABC、3D等，其中L蛋 白的免疫原性比其他非結構蛋白弱，感染動物不一定能產生抗體，即使產生抗體，維持的時 間也比較短。病毒感染動物可產生抗2B抗體，但這種抗體在ELISA反應中重復性不好，不 能作為檢測抗體。2C抗體由于消退的比3ABC快，且免疫牛中可檢測到2C抗體，因此也不能 作為檢測指標。3D又稱病毒感染相關抗原，沒有型特異性，檢測其抗體水平是評價動物是否 接觸過抗原的重要指標，也是國際貿易必檢項目。目前認為僅檢測3D抗體不能區(qū)分感染動 物與免疫動物，因為疫苗中往往含有痕量的非結構抗原，經過多次免疫后，在免疫動物體內 也能檢測到3D抗體。3ABC聚蛋白中，3A免疫原性最強，3C免疫原性較弱。許多資料認為 3ABC作為感染的標志可信度較大。檢測3ABC抗體是確診感染的重要指標。現在各國學者 已達成共識，檢測非結構蛋白3ABC或者3AB抗體是確認疫苗免疫動物是否感染FMD的最佳 方法。
[0005] 口蹄疫的防控主要是疫苗免疫及屠宰感染和可疑畜群。我國對口蹄疫施行強制性 免疫，每年春秋進行一次集中免疫，兩次之間對新補欄家畜及時進行補免。在實際生產中如 何鑒別診斷易感動物是進行了疫苗免疫還是感染了口蹄疫病毒對口蹄疫防疫體系的建立、 檢驗檢疫都是十分重要的。用于口蹄疫診斷的血清學技術有補體結合試驗（CFT)、酶聯(lián)免疫 吸附試驗（ELISA)、病毒中和試驗（VNT)、間接血凝試驗（IHA)等，其中ELISA是最常用的方 法。ELISA的基本原理是將抗原或者抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶反應，通過 底物顯色后用肉眼或者分光光度計判定結果。ELISA方法具有特異、敏感、快速、簡便、可靠 性好等特點，且能自動化操作，并能迅速的檢測大量樣品，在FMD的診斷中日益受到人們的 重視，現已成為國際上檢測易感動物豬、牛等是否疫苗免疫或感染病毒的常規(guī)方法之一。
[0006] 間接ELISA方法過程簡單易于操作，并且有較高的敏感性。1997年意大利的De 等建立了基于FMDV3ABC非結構蛋白的間接捕獲ELISA技術，這種ELISA用單抗來捕獲在大 腸桿菌中表達的FMDV3ABC非結構蛋白。用此ELISA檢測了大量疫苗免疫動物和感染動物， 所有經過攻毒試驗的動物其ELISA試驗的OD值都大于0. 2,超過99%的經過疫苗免疫動物 ELISA結果為陰性（即小于0. 2)，因此將OD值小于0. 2的樣品判為陰性。以上數據顯示該 方法敏感性很高。后經特異性試驗證實，該方法的特異性超過99. 5%。此方法可在免疫后8 天測出3ABC非結構蛋白抗體，1年后仍能測出此抗體。2003年朱彩珠等建立了一種用于區(qū) 分FMDV感染動物和疫苗免疫動物的間接ELISA，這種ELISA利用大腸桿菌表達的FMDV3ABC 非結構蛋白作為抗原。試驗結果證明，該ELISA方法的準確性比病毒感染相關抗原瓊脂糖 凝膠免疫擴散試驗（VIAAAGID)高。2010年張潤祥等為建立?？谔阋呖贵w的檢測方法，將 FMDV的VP2基因通過pPROEXTMHTb表達載體在大腸桿菌DH5 α中表達，獲得大小為35ku的 重組VP2蛋白（rVP2)。以純化rVP2為抗原建立了 FMDV-rVP2間接ELISA方法。重復性實 驗證實批內、批間變異系數均小于10%。檢測非免疫無口蹄疫國家牛陰性血清的特異性為 100%;檢測感染血清敏感性為97. 3%;檢測O-Asia I二價苗免疫牛血清，與4種商品化試 劑盒比較，其符合率分別為69. 0%、95. 0%、90. 4%和86. 8%，符合率較高，說明這種ELISA 有良好的應用價值。
[0007] 口蹄疫是關系到國家經濟安全的重大動物疫病，相關關鍵技術應該牢牢掌握在自 己手里。一旦我們擁有自主知識產權，將利于保障我國的經濟安全。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種新的用于口蹄疫易感動物豬疫苗免疫與病毒感染的鑒 別診斷的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括豬口蹄 疫病毒非結構蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶聯(lián)反應板和酶標記抗抗體；所述豬口蹄疫 病毒非結構蛋白3ABC抗原表位多肽為序列表中序列1所示的多肽。
[0010] 所涉及的包被抗原采用固相化學合成的方法生產，包被抗原含有豬口蹄疫病毒非 結構蛋白3ABC的主要抗原位點多肽，可與口蹄疫病毒感染后產生的非結構蛋白3ABC抗體 特異結合。
[0011] 所述酶標記抗抗體的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶；所述酶標記抗抗體 為酶標記兔抗豬IgG ;所述酶標記抗抗體優(yōu)選為辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆 抗體。
[0012] 所述酶聯(lián)反應板為可拆卸96孔酶標板；所述豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗原 表位多肽為化學人工合成得到。
[0013] 本發(fā)明通過以下方式實現：采用豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的人工化學合成 多肽包被的可拆96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應板。同時，試劑盒中含有以辣根過氧化物酶標記的 兔抗豬的IgG多克隆抗體酶結合物，陰性對照血清，陽性對照血清，樣品稀釋液，TMB底物溶 液，20 X濃縮洗滌液和終止液等組分。以間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)方法檢測樣品中 的3ABC蛋白抗體。
[0014] 所涉及的酶聯(lián)反應板的最佳制備條件是：包被時將多肽抗原溶于pH9. 6的碳酸鹽 溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應板，每孔50ng抗原，在37°C放置2?4h，再4?8°C 下放置過夜（8?12h)使多肽抗原與酶聯(lián)反應板充分結合。然后按照300 μ 1/孔加入含 1% (g/ml)牛血清白蛋白（BSA)的PBS緩沖液（pH = 7. 4)，37°C封閉處理2?3h，洗滌后 甩干，待酶聯(lián)反應板干燥后密封4°C保存。
[0015] 所述試劑盒中含有顯色液和終止液；當標記酶為辣根過氧化物酶時顯色液由顯色 液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為含0. 06% (g/ml)過氧化氫尿素的梓檬酸磷 酸鹽緩沖液，所述顯色液B液為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺溶液；使用時兩者以1 :1的比例 混合。當標記酶為堿性磷酸酶時，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。所述終止液為2mol/ L的硫酸溶液。
[0016] 所述試劑盒還包括陰性對照血清、陽性對照血清；所述陰性對照血清為用無口蹄 疫抗體的正常豬血清；所述陽性對照血清為以所述口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗原表位 多肽為免疫原免疫豬得到的血清；
[0017] 所涉及的陽性對照血清具體是以人工化學合成的非結構蛋白3ABC抗原表位多肽 作為免疫原，免疫25?35日齡無特定病源體（SPF)豬，制備高免血清，加入lOOOU/ml鏈霉 素和青霉素，過濾徑為〇. 2 μπι的濾膜除菌，作為試劑盒的陽性對照血清。
[0018] 所涉及的陰性對照血清具體是用無口蹄疫抗體的正常豬血清，加入lOOOU/ml鏈 霉素和1000U/ml青霉素，過濾徑為0. 2 μπι的濾膜除菌，作為試劑盒陰性血清。
[0019] 所述試劑盒還包括樣品稀釋液和濃縮洗滌液；樣品稀釋液為含有0. 5% (g/ml)酪 蛋白的0. 01M、pH為7. 4的PBS緩沖液（過濾徑為0. 45 ym濾膜）；所述濃縮洗滌液為0. 01M， pH7. 4,含有0. 5 % (ml/ml) Tween-20的磷酸鹽緩沖液（經過濾徑為0. 2 μ m的濾膜除菌）。
[0020] 本發(fā)明試劑盒的檢測程序為：
[0021] 1.平衡：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置室溫平衡30min后使用，液體試劑用前混 勻。
[0022] 2.配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋備用。
[0023] 3.設定：留1個空白孔，3個陰性對照孔，和2個陽性對照孔，其余為待測樣本孔。
[0024] 4.待測標本預稀釋：往稀釋板孔內每孔加100 μ 1樣本稀釋液，分別加入5 μ 1待 測樣本。
[0025] 5.加樣：空白孔不加樣；3個陰性對照孔各加100 μ 1陰性對照，2個陽性對照孔各 加100 μ 1陽性對照；其余孔分別按預先設定加100 μ 1稀釋的待測樣本。加樣過程時間跨 度應盡量短。
[0026] 6.溫育：震蕩混勾，置37°C溫箱或水浴鍋中，反應30min。
[0027] 7.洗板：棄去反應液，每孔加入稀釋后的洗滌液300 μ 1，浸泡15s，甩棄洗液。連 續(xù)洗板4次后拍干。
[0028] 8.加酶：空白孔不加酶；其余各孔加100 μ 1辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG抗體 (艷紅色）。
[0029] 9.溫育：置37°C溫箱或水浴鍋中，反應30min。
[0030] 10.洗板：棄去反應液，每孔加入稀釋后的洗滌液300 μ 1，浸泡15s，甩棄洗滌液。 連續(xù)洗板5次后拍干。
[0031] 11.顯色：每孔（包括空白對照孔）依次加入顯色底物液A、顯色底物液B各 50 μ 1，震蕩混勻，置37°C溫箱或水浴鍋中，顯色15min。
[0032] 12.終止：每孔（包括空白對照孔）加入顯色終止液各50 μ 1，振蕩混勻終止反應。
[0033] 13.測定：用空白對照孔調零后測定各孔450nm的OD值。也可用雙波長 450nm/630nm測定各孔OD值。
[0034] 本發(fā)明試劑盒的檢測結果的判定：
[0035] 1.陰性對照OD平均值應該< 0. 2，否則無效。
[0036] 2.陽性對照每個檢測值應該在0. 5到2. 0之間，否則無效。
[0037] 3.臨界值的計算：臨界值=0. 17X陽性對照平均OD值。
[0038] 4.結果判定：樣本測定OD值多臨界值者判為陽性；樣本測定OD值〈臨界值者判 為陰性（建議對OD值〈臨界值，多0. 5倍臨界值的樣本跟蹤觀察）。
[0039] 本發(fā)明的上述試劑盒，可以用于檢測所述口蹄疫病毒病，具體可以為豬口蹄疫病 毒引起的豬口蹄疫病毒病。
[0040] 本發(fā)明的積極效果在于：本發(fā)明采用生物信息學方法對非結構蛋白的抗原表位進 行精確分析，從3ABC蛋白上的主要抗原表位上篩選出適合ELISA檢測用的肽段。該肽段集 中了抗原表位，具有靈敏性高、特異性強的優(yōu)點。
[0041] 同時，采用先進的固相合成肽技術合成多肽抗原用于包被酶標反應板以及制備試 劑盒中的陽性對照血清。
[0042] 另外，由于試劑盒中使用的包被抗原是化學合成多肽，不含雜蛋白，純度高，進一 步提高檢測口蹄疫非結構蛋白抗體的效率，以判斷被檢動物是否感染口蹄疫病毒。
[0043] 總之，本試劑盒采用化學合成3ABC抗原肽包被反應板，抗原用量少、靈敏性和特 異性高，可以高效地鑒別口蹄疫易感動物豬是感染了病毒還是接受了疫苗免疫。同時可以 根據結果進行免疫效果的評價。本發(fā)明試劑盒特異性好、敏感、高效，具有良好的市場前景。 實驗結果表明，試劑盒重復性好，特異性強，靈敏度高?？梢杂行У貦z測口蹄疫病毒感染后 產生的非結構蛋白抗體，以判斷被檢動物是否感染口蹄疫病毒。能滿足不同層次人員的需 要，具有廣闊的市場前景和良好的經濟、社會效益。
[0044] 本發(fā)明所涉及的豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒用于口 蹄疫易感動物豬、牛等疫苗免疫與病毒感染的鑒別診斷，有利于減少我國口蹄疫爆發(fā)所帶 來的損失，也有利于我國口蹄疫防控體系的建立。

【具體實施方式】
[0045] 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0046] 實施例1、豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包被抗原制備
[0047] 本發(fā)明采用生物信息學方法對非結構蛋白的抗原表位進行精確分析，從3ABC蛋 白上的主要抗原表位上篩選出適合ELISA檢測用的肽段，即口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗 原表位多肽，其序列如序列表中序列1所示。將該多肽作為本發(fā)明試劑盒的包被原制備豬 口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0048] 本發(fā)明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自動多肽合成儀（型號433A)制 備。運用 Merrif ield 固相合成法，米用的是 Fmoc (9_f luorenylmethyIoxycarbony 1，9-荷甲 氧羰基）修飾的氨基酸，使用Rink Amide MBHA樹脂做為固相載體。生產過程包括多肽抗 原固相合成、多肽裂解和鑒定、抗原純化、冷凍干燥以及保存五部分。以下分別進行說明：
[0049] -、包被抗原固相合成
[0050] 1、合成試劑的準備
[0051] 合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0052] 依據包被抗原序列以及合成規(guī)模準備合適的Fmoc修飾的氨基酸（購自NOVA公 司），加入至相應的Cartridge中。同樣按要求合成規(guī)模稱取樹脂5g，放入反應腔，將上下蓋 子擰緊，貼標簽，記錄所合成肽的名稱，批號，反應腔的TARE及所稱樹脂的重量。將反應腔 裝入合成儀。配制適量的合成試劑包括100 %的NMP、3 %的AM (已酰咪唑）、35 %的PIP (哌 啶）、100%的MeOH(甲醇）等放置到相對應的試劑瓶中。
[0053] 2、合成儀狀態(tài)的檢測
[0054] 檢查433A多肽合成儀器是否正常運行，開機后，運行Run Self Test程序，儀 器自檢各項指標是否正常。另外檢查氮氣是否充足，系統(tǒng)表壓是否正常（433A正常表壓 10. 2psi)。合成前應對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進行測定。433A 合成儀：發(fā)送Flow Ratel-18到合成儀，選擇Main Menu-Module Test一按Prer或next找 Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A) -按 Start-按 more 進行測量或觀察，若 流量不合適，則調節(jié)下閥門壓力，直至達到要求（具體檢測要求見下表1)。
[0055] 表1.多肽合成儀流速檢測標準表
[0056]

【權利要求】
1. 一種多肽，為序列表中序列1所示。
2. -種豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括豬口蹄疫病毒 非結構蛋白3ABC抗原表位多肽包被的酶聯(lián)反應板和酶標記抗抗體；所述豬口蹄疫病毒非 結構蛋白3ABC抗原表位多肽為序列表中序列1所示。
3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述酶標記抗抗體的標記酶為辣根過 氧化物酶或堿性磷酸酶；所述酶標記抗抗體為酶標記兔抗豬IgG，所述酶標記抗抗體優(yōu)選 為辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG多克隆抗體。
4. 根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于：所述酶聯(lián)反應板為可拆卸96孔酶 標板；所述口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗原表位多肽為化學人工合成得到。
5. 根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于：所述豬口蹄疫病毒非結構蛋白 3ABC抗原表位多肽包被的酶聯(lián)反應板的獲得方法是將所述豬口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC 抗原表位多肽溶于100 y 1的pH 9. 6的碳酸鹽溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應板， 每孔50ng抗原，在37°C放置2?4小時，再4-8°C下放置8?12小時使多肽抗原與酶聯(lián)反 應板充分結合，然后按照300 y 1/孔加入含有l(wèi)g/100ml牛血清白蛋白pH7. 4的PBS緩沖液， 37°C封閉處理2?3小時，洗滌后甩干，待酶聯(lián)反應板干燥后4°C密封保存。
6. 根據權利要求1-5中任意一項所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有顯 色液和終止液；當標記酶為辣根過氧化物酶時顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，所述 顯色液A液為含0. 06% (g/ml)過氧化氫尿素的梓檬酸磷酸鹽緩沖液，所述顯色液B液為 0. 2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺溶液；當標記酶為堿性磷酸酶時，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖 液；所述終止液為2mol/L的硫酸溶液。
7. 根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括陰性對照血清、陽性 對照血清；所述陰性對照血清為用無口蹄疫抗體的正常豬血清；所述陽性對照血清為以所 述口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗原表位多肽為免疫原免疫豬得到的血清。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括樣品稀釋液和濃縮 洗滌液；樣品稀釋液為含有〇? 5% (g/100ml)酪蛋白的0? 01M、pH為7. 4的PBS緩沖液；所 述濃縮洗滌液為0. 01M，pH 7. 4,含有0. 5% (ml/ml)Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
9. 權利要求1所述的多肽在制備檢測是否感染動物口蹄疫病毒病的試劑盒中的應用； 其中，動物口蹄疫病毒病為豬口蹄疫病毒病。
【文檔編號】G01N33/569GK104478998SQ201410747655
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權日:2014年12月9日
【發(fā)明者】齊鵬, 董春娜, 王楠, 肖進, 趙洪濤, 張君, 張艷賓, 張欣 申請人:中牧實業(yè)股份有限公司