一種基于ercc8基因檢測(cè)胃癌易感性的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)療研究領(lǐng)域，涉及一種疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒，具體涉及 一種基于ERCC8基因檢測(cè)胃癌易感性的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中飲食習(xí)慣，生活環(huán)境以及幽門(mén)螺桿菌的感染等 均是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的高危因素。遺傳因素也是一項(xiàng)重要的方面。基因的多態(tài)性是導(dǎo)致疾病 發(fā)生遺傳以及疾病發(fā)生遺傳易感性的重要方面。其中以單核苷酸多態(tài)性最為常見(jiàn)。
[0003] 單核苷酸多態(tài)性由于是人類(lèi)基因組中最為常見(jiàn)的多態(tài)形式，因此其可以作為人類(lèi) 疾病的一種特有基因。某一個(gè)或者幾個(gè)的單核苷酸多態(tài)性可以代表某個(gè)單體區(qū)域的單核苷 酸多態(tài)性稱(chēng)之為標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性。
[0004] DNA修復(fù)基因的主要作用是為了保持基因組中DNA的完整性以及其相關(guān)的穩(wěn)定 性。當(dāng)DNA出現(xiàn)損傷時(shí)DNA可以有自身的修復(fù)能力。但不同個(gè)體其DNA修復(fù)能夠存在有一 定的差異。目前有研究表明，DNA修復(fù)基因的序列會(huì)影響DNA的修復(fù)能力。
[0005] ERCC8是轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的核心基因，其主要是參與DNA修復(fù)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修 復(fù)，并且修復(fù)氧化損傷以及與多種的重要蛋白質(zhì)有著相對(duì)交互作用。ERCC8基因啟動(dòng)子區(qū)、 編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)均存在多個(gè)SNPs，這些SNPs可能影響到基因轉(zhuǎn)錄水平、剪接方式、翻譯效 率和蛋白質(zhì)的功能等，從而影響不同個(gè)體的DNA修復(fù)的能力。因此研究ERCC8基因是有重 要意義。
[0006] DNA修復(fù)基因ERCC8Tag SNPs與胃癌及其癌前疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)研究（景晶晶，中國(guó) 醫(yī)科大，2012)中對(duì)遼寧莊河胃癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，攜帶ERCC8_rsl58572位點(diǎn)GG/AG基 因型者罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增高，尤其是50歲以上男性具有更高的胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)胃癌患者進(jìn)行ERCC8基因SNPs的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了與上文報(bào)道不一致的 結(jié)論。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于ERCC8基因檢測(cè)胃癌易感性的試劑盒及 其用途。
[0009] 第一方面，本發(fā)明提供了一種基于ERCC8基因檢測(cè)胃癌易感性的試劑盒，包括：檢 測(cè)ERCC8基因上rsl58572號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物和/或檢測(cè)ERCC8基因上rsl58916號(hào) SNP位點(diǎn)的特異性引物。
[0010] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)ERCC8基因上rsl58572號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物為：
[0011] 3￡〇10勵(lì):5及5￡〇10勵(lì):6組成的引物對(duì)；或5￡〇10勵(lì):7及5￡〇10勵(lì):8組 成的引物對(duì)。
[0012] 優(yōu)選地，檢測(cè)ERCC8基因上rsl58916號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物為：
[0013] SEQ ID N0:11 及 SEQ ID N0:12 組成的引物對(duì)。
[0014] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)ERCC8基因上rsl58572號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物和檢測(cè)ERCC8 基因上rsl58916號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物為用于多重PCR反應(yīng)的多重PCR引物組，所述的 多重？〇?引物組為5￡0 10勵(lì):5、5￡0 10勵(lì):6、5￡0 10勵(lì)：11及5￡0 10勵(lì)：12組成的多重 PCR引物組。
[0015] 優(yōu)選地，所述胃癌易感性的檢測(cè)為針對(duì)云南省（優(yōu)選為文山州）地區(qū)人群進(jìn)行的 胃癌易感性檢測(cè)。
[0016] 第二方面，本發(fā)明提供了一種評(píng)估人群胃癌易感性的方法，包括如下步驟：
[0017] 1)采用如第一方面所述的試劑盒對(duì)待測(cè)人群的ERCC8基因rsl58572號(hào)和/或 rsl58916號(hào)SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)；
[0018] 2)檢測(cè)待測(cè)人群是否感染幽門(mén)螺桿菌；
[0019] 3)對(duì)步驟1)和2)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對(duì)ERCC8基因rsl58572號(hào)和/或 rsl58916號(hào)SNP位點(diǎn)與幽門(mén)螺桿菌感染交互作用進(jìn)行分析，獲得人群胃癌易感性的評(píng)估結(jié) 果。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟1)中，采用如第一方面所述的試劑盒中的多重PCR引物組進(jìn)行 多重PCR反應(yīng)檢測(cè)待測(cè)人群的ERCC8基因rsl58572號(hào)和rsl58916號(hào)SNP位點(diǎn)的基因型。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選地，每個(gè)多重PCR反應(yīng)體系中采用的多重PCR引物組總濃度為12uM。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0023]
[0024] 優(yōu)選地，所述的待測(cè)人群為云南省（優(yōu)選為文山州）地區(qū)人群。
[0025] 第三方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的基于ERCC8基因檢測(cè)胃癌易感性 的試劑盒在檢測(cè)ERCC8基因上的rsl58572號(hào)和/或rsl58916號(hào)SNP位點(diǎn)中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明提供的基于ERCC8基因檢測(cè)胃癌易感性的試劑盒可用于準(zhǔn)確ERCC8基因的 rsl58572和rsl58572號(hào)SNP位點(diǎn)的基因型的檢測(cè)。
[0027] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)：對(duì)比觀(guān)察組和對(duì)照組兩組受試者rsl58572關(guān)于A(yíng)A，GA和GG的基因； 以及和rsl58916關(guān)于TT，CT和CC的基因。觀(guān)察組和對(duì)照組兩組受試者在rsl58572的基 因位點(diǎn)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 〇. 05)，同時(shí)rsl58916兩組的基因位點(diǎn)也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0. 05)；
[0028] 本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)：幽門(mén)螺桿菌感染發(fā)病與兩個(gè)tag SNPs有一定的相關(guān)性。攜帶 ERCC8基因的rsl58572和rsl58572同時(shí)感染幽門(mén)螺桿菌，導(dǎo)致胃癌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大大增加。
【附圖說(shuō)明】 圖 1 是本發(fā)明實(shí)施例提供的SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12 的多重？〇?結(jié)果以及5￡0 10勵(lì)：7、5￡0 10勵(lì):8和5￡0 10勵(lì)：11、5￡0 10勵(lì)：12的多重 PCR結(jié)果； 圖 2是本發(fā)明實(shí)施例提供的SEQIDN0:5、SEQIDN0:6和SEQIDN0:11、SEQIDN0:12 的多重PCR結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方 法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0030] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031] 儀器與試劑。所有的DNA引物均喲上海的英駿生物公司提供，采用酚氯仿法抽提 基因組。DNA Marker:東勝生物，Low ladder/marker，M1031。具體步驟如下：
[0032] 實(shí)施例1 SNP篩選
[0033] 采用Haploview的軟件進(jìn)行ERCC8基因的tagSNP篩選。然后再采用FastSNP對(duì) 候選的tagSNPs進(jìn)行功能和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，從而能夠挑選一種具有潛在功能效應(yīng)的SNPs。其中 對(duì)tagSNPs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估依據(jù)主要是采用遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方案進(jìn)行評(píng)分。通過(guò)篩選，本文捕獲 兩個(gè)潛在的tagSNPs(rsl58572以及rsl58916)。同時(shí)需要進(jìn)行基因型檢測(cè)。
[0034] 實(shí)施例2DNA樣品提取
[0035] 將采集的凝血塊500 y 1大小并且將其置于離心管中，加入800 y 1的TE，混勻后進(jìn) 行DNA的提取?；靹蚝筮M(jìn)行離心操作，10000rpm/min，離心5分鐘。然后依次加入400 y 1 的LTE，25 y 1的10%的SDS和5 y 1濃度為20mg/ml的PK液，過(guò)夜消化。消化結(jié)束后將其 上清液吸取并且同時(shí)加入等體積的酚，渦旋15分鐘后再次離心。吸取上清液后加入1 :1的 氯仿和酚，再次渦旋離心。再吸取上清液，加入2倍的無(wú)水乙醇和3M的乙酸鈉，在-20°C的 條件下進(jìn)行沉淀反應(yīng)。沉淀接受后棄去上清液，然后加入75%的乙醇再次離心。取出上清 液后將離心后的沉淀物質(zhì)干燥，待用。
[0036] 實(shí)施例3引物設(shè)計(jì)
[0037] 采用MassAssayDesign3. 1 (美國(guó)sequenom公司）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò) 增引物及延伸引物。
[0038] PCR擴(kuò)增引物：
[0039] 針對(duì)rsl58572號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物設(shè)計(jì)4對(duì)：
[0040] 第 1 對(duì)：
[0041] (SEQID N0:1)
[0042] 正義引物：5 ' -GGATCAITTGAGCCTGGAAA-3 '（Tm 值為 60 °C )，
[0043] (SEQIDNO:2)
[0044] 反義引物：5' -TGCCACTGTCACTTCCTCTG-3'（Tm 值為 60°C );
[0045] 第 2 對(duì)：
[0046] (SEQID NO:3)
[0047] 正義引物：5 ' -GCCCTTGAGATAAACCCACA-3 '（Tm 值為 59 °C )，
[0048] (SEQIDNO:4)
[0049] 反義引物：5' -CGGGAGAGAGITGTTGGAAG-3'（Tm 值為 59°C );
[0050] 第 3 對(duì)：
[0051] (SEQIDNO:5)
[0052] 正義引物：5'-AAGGCAGGAGGATCACTTCA-3'（Tm值為 59°C)，
[0053] (SEQIDNO:6)
[0054] 反義引物：5' -ACAATCAGCATGITCCCACA-3'（Tm值為 59°C);
[0055] 第 4 對(duì)：
[0056] (SEQIDNO:7)
[0057] 正義引物：5' -GGTGAITGGTCACTGTGCAT-3'（Tm值為 59. 5°C)，
[0058] (SEQIDNO:8)
[0059] 反義引物：5' -TGCCACTGTCACTTCCTCTG-3'（Tm值為 60°C);
[0060] 針對(duì)rsl58916號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物設(shè)計(jì)3對(duì)：
[0061] 第 1對(duì)：
[0062] (SEQIDNO:9)
[0063] 正義引物：5' -CTATGGCCAAGCACTCACAC-3'（Tm值為 59. 5°C)，
[0064] (SEQIDNO: 10)
[0065] 反義引物：5' -TTACCTTCCCACCAGGAGTG-3'（Tm值為 60°C);
[0066] 第 2 對(duì)：
[0067] (SEQIDNO: 11)
[0068] 正義引物：5' -TGTGGGACAGTCTCAAATGG-3'（Tm值為 59. 5°C)，
[0069] (SEQIDNO: 12)
[0070] 反義引物：5' -TCCCACCAGG