本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種ERCC1基因突變檢測特異性引物和液相芯片試劑盒。
背景技術(shù)：
：核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1(ExcisionRepairCrossComplementinggroup1，ERCC1)位于人類染色體19q13.2，長度為15kb，編碼由297個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是核酸外切修復(fù)家族中重要成員，為NER系統(tǒng)關(guān)鍵成員，參與DNA鏈切割和損傷識別。同時(shí)，ERCC1基因多態(tài)性不僅與腫瘤的化療療效有關(guān)，對預(yù)后也有影響。在腫瘤的治療過程中，DNA修復(fù)能力增強(qiáng)影響了抗腫瘤藥物療效的發(fā)揮，易產(chǎn)生抗藥性；DNA修復(fù)能力下降有助于有抗腫瘤活性的鉑-DNA加合物功能的持續(xù)存在，從而對預(yù)后產(chǎn)生好的影響。已有很多文獻(xiàn)報(bào)道ERCC1的SNP與鉑類藥物化療敏感性存在明顯關(guān)系。目前，ERCC1基因多態(tài)性的檢測技術(shù)主要有：基于PCR技術(shù)的Real-timePCR、PCR-RFLP等技術(shù)，基質(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)以及免疫組化技術(shù)(IHC)。PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的改變，如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點(diǎn)改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)的基因突變檢測?；|(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)是一種軟電離技術(shù)，在蛋白質(zhì)等生物大分子的檢測中有著強(qiáng)大而成熟的功能，但是在核酸檢測領(lǐng)域，由于核酸分子本身的特殊性，檢測受到一定的限制。免疫組化雖具有特異性、敏感性強(qiáng)及操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但其抗體使用、操作步驟、結(jié)果判斷等沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，從而影響其在臨床上的推廣與應(yīng)用。液相芯片，又稱流式熒光技術(shù)、懸浮陣列，具有檢測速度快、結(jié)果準(zhǔn)確性高、操作簡便、功能強(qiáng)大、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)。然而，要液相芯片實(shí)現(xiàn)基因突變檢測，其檢測結(jié)果的影響參數(shù)較多，包括引物的設(shè)計(jì)、與tag序列的組合，與PCR引物之間的交叉反應(yīng)、與其它位點(diǎn)的多條序列的交叉反應(yīng)、整個檢測平臺的Tm值的協(xié)調(diào)等等，在針對目標(biāo)基因突變檢測的液相芯片的設(shè)計(jì)時(shí)，其關(guān)鍵的考慮因素是除了能單獨(dú)進(jìn)行檢測，還必須能與其它位點(diǎn)進(jìn)行同步檢測。而目前，急需開發(fā)一種既然單獨(dú)檢測，又能實(shí)現(xiàn)并行檢測的ERCC1基因突變檢測液相芯片試劑盒。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供ERCC1基因突變檢測液相芯片試劑盒，該液相芯片試劑盒可用于單獨(dú)或并行檢測ERCC1基因五種常見基因型T354C、G262T、G197T、T931G和A1187G的野生型和突變型。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種ERCC1基因突變檢測液相芯片試劑盒，包括有：(A).針對ERCC1基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對：每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列選自以下至少一對：針對T354C位點(diǎn)的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12、針對G262T位點(diǎn)的SEQIDNO.13及SEQIDNO.14、針對G197T位點(diǎn)的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16、針對T931G位點(diǎn)的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、和針對A1187G位點(diǎn)的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20；所述tag序列選自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對；(C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、與所述ASPE引物具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。在其中一些實(shí)施例中，所述擴(kuò)增引物選自以下至少一對：針對T354C位點(diǎn)的SEQIDNO.31及SEQIDNO.32、針對G262T位點(diǎn)的SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、針對G197T位點(diǎn)的SEQIDNO.35及SEQIDNO.36、針對T931G位點(diǎn)的SEQIDNO.37及SEQIDNO.38、和針對A1187G位點(diǎn)的SEQIDNO.39及SEQIDNO.40。在其中一些實(shí)施例中，所述ASPE引物對選自以下至少一對：針對T354C位點(diǎn)的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.11組成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.12組成的序列；針對G262T位點(diǎn)的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.13組成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.14組成的序列；針對G197T位點(diǎn)的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.15組成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.16組成的序列；針對G197T位點(diǎn)的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.17組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.18組成的序列；和針對G197T位點(diǎn)的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.19組成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.20組成的序列。本發(fā)明的另一目的是提供用于ERCC1基因突變檢測的特異性引物。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：用于ERCC1基因突變檢測的特異性引物，選自以下至少一對：針對T354C位點(diǎn)的SEQIDNO.11及SEQIDNO.12、針對G262T位點(diǎn)的SEQIDNO.13及SEQIDNO.14、針對G197T位點(diǎn) 的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16、針對T931G位點(diǎn)的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18、和針對A1187G位點(diǎn)的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：1.本發(fā)明所提供的ERCC1基因突變檢測液相芯片試劑盒的檢測結(jié)果與測序法吻合率高達(dá)100％，且檢測所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合實(shí)際應(yīng)用需要。所制備的ERCC1基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，特異性引物、tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取，構(gòu)建了一個檢測參數(shù)統(tǒng)一的檢測平臺，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個突變位點(diǎn)的單獨(dú)和并行檢測。2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和大量的實(shí)驗(yàn)操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合，本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標(biāo)檢測的突變位點(diǎn)，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測特異性好，交叉反應(yīng)率低于3％；除了能夠檢測單個位點(diǎn)突變情況，也能夠同時(shí)并行檢測多個突變位點(diǎn)的突變情況，檢測效果一致。3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，5種突變位點(diǎn)檢測可通過一步PCR即可完成5條含有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片試劑盒敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時(shí)對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。具體實(shí)施方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目 的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。實(shí)施例1本實(shí)施例所述ERCC1基因突變檢測液相芯片試劑盒，主要包括有：三、ASPE引物針對ERCC1基因五種常見基因型T354C、G262T、G197T、T931G和A1187G的野生型和突變型，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示：表1ERCC1基因的ASPE引物序列(tag序列+特異性引物序列)每條ASPE引物包括兩個部分，5’端為針對相應(yīng)微球上anti-tag序列的特異性tag序列，3’端為突變型或野生型特異的引物片段(如上述表1所示)。其中，使用“框”標(biāo)出的堿基為目標(biāo)檢測突變位點(diǎn)的野生型和突變型堿基，所有ASPE引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。二、anti-tag序列包被的微球根據(jù)所設(shè)計(jì)的ASPE特異性引物片段，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級結(jié)構(gòu)，選擇的10種微球編號與微球上相應(yīng)的anti-tag序列如表2所示：表2微球編號與微球上相應(yīng)的anti-tag序列選擇的10種微球購自美國Luminex公司，將anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列與微球之間連接有5－10個T的間隔臂序列，即在每個anti-tag序列前加上一段5－10個T的間隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的 anti-tag序列用滅菌ddH2O配成100nmol/ml的貯存液。所述間隔臂為用于將anti-tag與微球表面間隔開來或是將anti-tag置于親水性環(huán)境中的序列。通過在anti-tag序列與微球之間設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5－10個T，微球包被的過程如下：分別取5×106個上述編號的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(購自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02％的Tween-20洗滌一次，再用0.1％的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有anti-tag序列的微球重懸于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。一、擴(kuò)增出含有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物針對ERCC1基因五種常見基因型T354C、G262T、G197T、T931G和A1187G，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對(見表3)，一次性并行擴(kuò)增出5條含有5個突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列。表3擴(kuò)增出具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。實(shí)施例2運(yùn)用實(shí)施例1所述的ERCC1基因突變檢測液相芯片試劑盒對樣本的檢測所述各種溶液的配方如下：50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml)：2×Tm雜交緩沖液過濾后貯存于4℃。ExoSAP-IT試劑盒購自美國USB公司。生物素標(biāo)記的dCTP購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。一、樣本的DNA提?。簠⒄铡斗肿涌寺　逢P(guān)于DNA提取的相關(guān)方法，得到待檢測的DNA。二、待測樣品的PCR擴(kuò)增運(yùn)用5對引物，多重PCR一步擴(kuò)增出5條分別含ERCC1基因五種目標(biāo)檢測突變位點(diǎn)T354C、G262T、G197T、T931G和A1187G的目標(biāo)序列，產(chǎn)物大小分別為347bp、326bp、301bp、332bp、322bp，引物序列(SEQIDNO.31-40)見上述表3所示。首先配制多重PCR引物工作液：分別各取SEQIDNO.31-40的引物貯存液50ul于1.5ml微量離心管中，使用10mmol/LTrisBuffer配制成終濃度各為10pmol/mL的多重PCR引物工作液。多重PCR反應(yīng)體系如下：PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30個循環(huán)；72℃10min；4℃保存?zhèn)溆?。三、PCR產(chǎn)物的酶切處理1.取7.5ulPCR反應(yīng)后的產(chǎn)物，加入1ul10×SAP緩沖液、1ulSAP酶和0.5ulExo-I酶；2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，滅活多余的酶。酶切處理后的產(chǎn)物直接用于后續(xù)的ASPE引物延伸反應(yīng)。四、位點(diǎn)特異的引物延伸反應(yīng)(ASPE)利用實(shí)施例1中設(shè)計(jì)的ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記。首先配制混合的ASPE引物工作液：分別取待檢測基因相應(yīng)的野生型和突變型ASPE引物貯存液10ul于1.5ml微量離心管中，加入10mmol/LTrisBuffer補(bǔ)至200ul，混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應(yīng)的體系如下：反應(yīng)程序?yàn)椋?6℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；4℃保存?zhèn)溆谩Ｎ?、雜交反應(yīng)1.根據(jù)設(shè)計(jì)的ASPE引物，每組選擇相應(yīng)的10種包被的微球(如實(shí)施例1所述)，每種微球濃度均為2.5×105個/ml；2.分別取1ul每種編號的微球于1.5ml的微量離心管中；3.微球于≥10000g離心1-2min；4.棄去上清，微球重懸于100ul的2×Tm雜交緩沖液中，渦旋混勻；5.取25ul上述微球懸液于96孔濾板相應(yīng)的孔中，對照孔加25ul的ddH2O；6.取5-25ul的ASPE反應(yīng)液于相應(yīng)的孔中，用ddH2O補(bǔ)足至50ul；7.用錫箔紙包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育雜交；8.雜交后的微球于≥3000g離心2－5min；9.去上清，將微球重懸于75ul的1×Tm雜交緩沖液中；10.微球于≥3000g離心2－5min；11.將微球重懸于75ul的1×Tm雜交緩沖液中，加入15ul濃度為10ug/ml的鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE)；12.37℃孵育15min，于Luminex儀器上檢測。六、結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測。檢測結(jié)果如表4、表5和表6所示。對熒光值(MFI)和數(shù)據(jù)處理有以下要求：1.每個位點(diǎn)需至少有一個等位基因MFI大于300而且大于10×PCR陰性對照MFI；2.NETMFI＝樣品MFI－PCR陰性對照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；3.滿足以上兩個條件的數(shù)據(jù)，按下列公式計(jì)算突變比值：突變比值＝突變型NETMFI÷(突變型NETMFI+野生型NETMFI)4.根據(jù)經(jīng)驗(yàn)對每個檢測位點(diǎn)的突變比值確定閾值(cut-off值)，以劃分野生型純合子、雜合子和突變型純合子。使用本方法檢測20份樣本的ERCC1基因SNP位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合上述要求，因此可計(jì)算得它們的突變比值。閾值(cut-off值)的設(shè)置如下：突變比值范圍在0％-20％視為野生型純合子；30％-70％視為雜合子；80％-100％視為變異型純合子。以測序法檢測與液相芯片結(jié)果作對照，計(jì)算本發(fā)明所提供的分型方法檢測結(jié)果的吻合率。本方法檢測20份樣本的ERCC1基因型檢測結(jié)果與測序結(jié)果吻合率達(dá)到100％?？梢姳景l(fā)明所提供的ERCC1基因SNP檢測液相芯片能夠準(zhǔn)確地檢測出ERCC1的SNP類型，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。表4樣本檢測結(jié)果(MFI)表5樣本ERCC1基因突變比值(％)樣品號T354CG262TG197TT931GA1187G12％1％1％2％1％23％2％3％2％1％32％2％2％2％2％453％1％2％2％2％52％1％1％2％2％62％98％2％2％1％72％1％2％2％1％83％1％2％1％52％92％2％2％2％1％102％1％2％1％2％111％1％98％2％2％122％1％2％2％3％132％3％1％1％1％142％2％2％3％2％151％2％2％1％2％162％2％2％1％2％172％2％1％2％2％181％2％2％93％2％192％2％2％3％2％201％1％2％2％2％表6樣本ERCC1基因突變類型分析結(jié)果樣本號液相芯片檢測結(jié)果測序結(jié)果1野生型野生型2野生型野生型3野生型野生型4354TC354TC5野生型野生型6262TT262TT7野生型野生型81187AG1187AG9野生型野生型10野生型野生型11197TT197TT12野生型野生型13野生型野生型14野生型野生型15野生型野生型16野生型野生型17野生型野生型18931GG931GG19野生型野生型20野生型野生型實(shí)施例3不同的ASPE引物的液相芯片試劑盒對ERCC1基因SNP位點(diǎn)的檢測一、液相芯片制備的設(shè)計(jì)(Tag序列及Anti-Tag序列的選擇)以ERCC1基因T354C、G262T、G197T和T931G位點(diǎn)突變檢測液相芯片為例，分別針對T354C、G262T、G197T和T931G的野生型和突變型設(shè)計(jì)ASPE引物3’端的特異性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列則選自SEQIDNO.1-SEQIDNO.10，相應(yīng)的，包被于微球上的與對應(yīng)tag序列互補(bǔ)配對的anti-tag序列選自SEQIDNO.21-SEQIDNO.30。具體設(shè)計(jì)如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、擴(kuò)增引物、檢測方法等如實(shí)施例1和實(shí)施例2所述。表7液相芯片制備的設(shè)計(jì)三、樣品檢測采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對樣品21-40進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如下：表8樣本ERCC1基因T354C檢測結(jié)果與基因多態(tài)性分析表9樣本ERCC1基因G262T檢測結(jié)果與基因多態(tài)性分析表10樣本ERCC1基因G197T檢測結(jié)果與基因多態(tài)性分析表11樣本ERCC1基因T931G檢測結(jié)果與基因多態(tài)性分析從上述實(shí)施例可見，其它針對不同突變位點(diǎn)的液相芯片，ASPE引物運(yùn)用不同的tag序列，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠。而ASPE引物選用實(shí)施例1中tag序列與特異性引物序列搭配時(shí)，效果更佳(信噪比更好)，參見本實(shí)施例試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組5、試驗(yàn)組7和試驗(yàn)組11。其它不同tag序列與特異性引物序列搭配，與實(shí)施例2和本實(shí)施例的結(jié)果相同，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例4ERCC1基因突變檢測特異性引物序列的選擇一、液相芯片制備的設(shè)計(jì)(野生型和突變型特異性引物序列的選擇)以ERCC1基因T354C和G262T的多態(tài)性位點(diǎn)檢測液相芯片為例，以該突變位點(diǎn)所在目標(biāo)序列的正向或反向互補(bǔ)序列為模板，分別針對T354C和G262T的野生型和突變型設(shè)計(jì)ASPE引物3’端的特異性引物序列，包括本發(fā)明實(shí)施例1中優(yōu)選的特異性引物序列和選擇的2條備選的特異性引物序列，如表12所示。其中，框內(nèi)堿基為多態(tài)性位點(diǎn)。表12特異性引物序列以ERCC1基因T354C和G262T的多態(tài)性位點(diǎn)檢測液相芯片試劑盒為例，針對T354C和G262T選用不同的特異性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列則固定為實(shí)施例1中的最佳效果序列，并選用與之相對應(yīng)的anti-tag序列，具體設(shè)計(jì)如下表(表13)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、擴(kuò)增引物、檢測方法等如實(shí)施例1和實(shí)施例2所述。表13液相芯片制備的設(shè)計(jì)之二二、樣品檢測采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對樣品41-60進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如下：表14樣本ERCC1基因T354C檢測結(jié)果與基因多態(tài)性分析表15樣本ERCC1基因G262T檢測結(jié)果與基因多態(tài)性分析由本實(shí)施例可見，ASPE引物選用實(shí)施例1中特異性引物序列與tag序列搭配時(shí)，效果更佳(信噪比更好)，參見本實(shí)施例試驗(yàn)組13和試驗(yàn)組16。其它來源于目標(biāo)檢測位點(diǎn)所在序列的正向或反向互補(bǔ)序列的不同特異性引物序列與tag序列搭配，與實(shí)施例2和本實(shí)施例的結(jié)果相同，即依然是實(shí)施例2中所述的特異性引物序列與不同的tag序列搭配效果更佳，具體數(shù)據(jù)省略。其它針對不同的SNP位點(diǎn)的多種特異性引物序列與tag序列搭配，與實(shí)施例2和本實(shí)施例的結(jié)果相同，即實(shí)施例1所選擇的特異性引物，具有更好的信噪比，檢測效果也更好，具體數(shù)據(jù)省略。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3