油茶良種長林18號的分子特異性標記引物及檢測方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及油茶良種長林18號的分子特異性標記引物及其鑒定方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002]油茶是我國栽植面積最大、分布范圍較廣的木本油料樹種。大力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，對 保障糧油安全，促進農(nóng)民增收，推進山區(qū)綜合開發(fā)和建設社會主義新農(nóng)村，都具有十分重要 的意義。我國油茶產(chǎn)業(yè)方興未艾，發(fā)展?jié)摿薮?。目前，我國油茶林總面積達4500多萬畝， 但產(chǎn)量很低，每畝產(chǎn)茶油僅4公斤左右。其根本原因是，絕大部分油茶林品種品質(zhì)差或嚴重 退化，而大量的國家和省級審（認）定的優(yōu)良品種又未推廣應用。同時，一些地方種苗質(zhì)量 意識淡薄，經(jīng)營管理粗放。為保障油茶產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展，要充分認識油茶良種對發(fā)展油茶 產(chǎn)業(yè)的重要性，必須加快油茶優(yōu)良種苗發(fā)展和強化質(zhì)量管理。
[0003] 我國目前對油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理，主要依靠在管理層面制定的各項制度，而 在技術(shù)層面尚未取得關鍵性突破，特別是缺乏油茶良種的早期快速鑒別技術(shù)體系。目前通 過國家林木良種審定的12個長林品種系列分別為長林3號、長林4號、長林18號、長林21 號、長林23號、長林26號、長林27號、長林40號、長林53號、長林55號、長林56號、長林 166號。這些油茶良種具有早實豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、出籽率高、含油量高、抗性強、適應性廣等特點。 對油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理要著力解決目前生產(chǎn)上油茶種苗的混亂局面，并首先從技術(shù)層 面上對長林油茶良種進行鑒別保護。
[0004] 目前對油茶品種的鑒別主要依據(jù)表觀特征，但由于許多形態(tài)性狀鑒定的周期 長、受環(huán)境影響大，并且品種數(shù)量不斷增多，使得品種鑒定愈來愈困難。自本世紀以來， 一些基于PCR的分子標記技術(shù)如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增 多態(tài)性DNA)、ISSR(Inter_Simple Sequence Repea，簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性）和 SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相關序列擴增多態(tài)性）相繼用于了油 茶的種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳距離研宄，但對于分子標記與油茶性狀的連鎖、油茶品種間 的分子鑒別研宄很少。況且，這些分子標記技術(shù)所采用的均為通用引物，其PCR擴增圖譜不 僅復雜、重復性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種鑒別，只有開發(fā)出某個品種穩(wěn) 定、特異的DNA指紋標記才能真正用于該品種的準確快速鑒定。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的提供一對特異性高的油茶良種長林18號的分子特異性標記引物，以 及一種能對油茶良種長林長林18號進行快速鑒定的方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 油茶良種長林18號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下：
[0008] 上游引物：5' -CATTACACCATCCTCTTGTTGC-3'，
[0009] 下游引物：5' -TGATCAATTACAGGGCTCGT-3 '。
[0010] 該引物對是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選試驗獲得油茶良種長林18號的特異性 DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎設計特異性引物，以該引物對 油茶良種進行PCR擴增，僅長林18號可穩(wěn)定獲得983bp大小的特異性片段，而其他油茶品 種均不能獲得該特異性片段。需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標記引物僅限于油茶良種 的鑒別（鑒別其是否為長林18號），即待測樣品僅限于油茶。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種利用所述的分子特異性標記引物對油茶良種長林18號進行快 速鑒別的方法，所述方法為：提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子 特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn) 983bp大小的DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林18號，反之則否；所述分子特異性 標記引物序列為：
[0012] 上游引物：5' -CATTACACCATCCTCTTGTTGC-3'，
[0013] 下游引物：5' -TGATCAATTACAGGGCTCGT-3'。
[0014] 本發(fā)明方法關鍵在于擴增引物的選擇，DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領域常規(guī)方法進行。
[0015] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述20 μ L PCR反應體系組成如下：
[0016]
[0017] 所述PCR擴增條件如下：94°C預變性7min ;94°C變性45min、63°C退火45s、72°C延 伸2min，共30個循環(huán)；最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0018] 具體的，所述方法如下：
[0019] (1)取待測油茶葉片，加液氮磨碎，提取待測油茶的基因組DNA ;
[0020] 所述基因組DNA提取可利用新型快速植物基因組DNA提取盒
[0021] (DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司）進行；
[0022] (2)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標
[0023] 記引物作為擴增引物，進行PCR擴增：
[0024] PCR反應體系每20 μ L組成如下：
[0025]
[0026] PCR反應條件如下：
[0027] 94°C預變性 7min ;94°C變性 45min、63°C退火 45s、72°C延伸 2min，共 30 個循環(huán)；最 后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0028] (3)取步驟（2)擴增產(chǎn)物5 μ L，與1 μ L0. 25%溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5%的 瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠圖 像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)983bp的DNA條帶，則待測油茶品種為長林18號，反之則 否。
[0029] 本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明分子特異性標記引物可對油茶良種長林18 號進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分 子手段。 (四）
【附圖說明】
[0030] 圖1為對油茶良種進行PCR擴增的結(jié)果；M為DNA分子量標準；編號3為油茶良種 長林18號，擴增出了一條983bp大小的特異DNA條帶；其余編號為其它的長林油茶良種，未 見有900bp多大小的特異DNA條帶產(chǎn)生。 (五）
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0032] 實施例1 :
[0033] (1)油茶良種基因組DNA的提?。?br>[0034] 取待測油茶良種幼嫩葉片0. 03g，加液氮徹底磨碎，基因組DNA的提取利用新型快 速植物基因組DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司），提取獲得油 茶良種的基因組DNA粗提物。DNA粗提物通過1. 5 %的瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA紫外分光 光度計（Nanodrop Technologies，USA)來檢測完整性、純度及濃度。0D26(i/0D28(i>L8 的 DNA 樣品用于后續(xù)PCR擴增。DNA提取物于-20°C冰箱貯藏備用。
[0035] (2)設計特異PCR擴增引物，引物對的序列為：
[0036] 上游引物：5 ' -CATTACACCATCCTCTTGTTGC-3 '和下游引物： 5' -TGATCAATTACAGGGCTCGT-3'，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。
[0037] (3) PCR 擴增：
[0038] PCR反應液組成：2 X Power Taq PCR Master Mix (PR1700，BioTeke，北京百泰克生 物技術(shù)有限公司）1〇 μ L，10 μ M上下游特異引物對各1 μ L，20ng/μ L模板DNA 3 μ L，CldH2O 5 μ L0
[0039] 擴增反應在Life ECO型擴增儀（Bioer，杭州博日科技有限公司）上進行。
[0040] 擴增條件：
[0041] 94°C 預變性 7min;
[0042] 94°C變性 45min、63°C退火 45s、72°C延伸 2min，共 30 個循環(huán)；
[0043] 最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0044] (4)電泳檢測：取步驟（3) PCR擴增產(chǎn)物5 μ L，與1 μ L 0· 25 %溴酚蘭緩沖液混勻， 點樣于I. 5%的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，在含 O.Syg/mL EB的水溶液中染色30分鐘，然后在美國伯樂自動凝膠圖像分析儀（Chemi Doc XRS imaging system，Bi〇-Rad，Hercules，CA，USA)上照相。
[0045] 按照上述方法，分別對多個油茶良種（編號I~12代表油茶良種依次為：1 :長林3 號、2 :長林4號、3 :長林18號、4 :長林21號、5 :長林23號、6 :長林26號、7 :長林27號、8 : 長林40號、9 :長林53號、10 :長林55號、11 :長林56號、12 :長林166號）的特異引物PCR 擴增圖譜進行電泳檢測，結(jié)果見圖1。
[0046] 圖中箭頭所指為僅從編號為3的油茶良種長林18號中擴增出了一條清晰明亮、穩(wěn) 定的分子量分別約為900bp多大小的特異DNA條帶，而其余編號的長林油茶良種，未見有 900bp多大小的特殊DNA條帶產(chǎn)生，也未有其它非目的條帶產(chǎn)生，可見本發(fā)明開分子特異性 標記用于油茶良種長林18號的鑒別，其穩(wěn)定性、特異性非常高。
【主權(quán)項】
1. 油茶良種長林18號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下： 上游引物：5' -CATTACACCATCCTCTTGITGC-3'， 下游引物：5' -TGATCAATTACAGGGCTCGT-3 '。2. -種利用權(quán)利要求1所述的分子特異性標記引物對油茶良種長林18號進行快速鑒 定的方法，所述方法為：提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性 標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)983bp 的特異DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林18號，反之則否；所述分子特異性標記引 物序列為： 上游引物：5' -CATTACACCATCCTCTTGITGC-3'， 下游引物：5' -TGATCAATTACAGGGCTCGT-3 '。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下：94°C預變性7min ; 94°C變性45min、63°C退火45s、72°C延伸2min，共30個循環(huán)；最后于72°C補平7min，終止 溫度為4°C。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： ⑴取待測油茶葉片，加液氮磨碎，提取待測油茶葉片的基因組DNA ; (2) 以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物， 進行PCR擴增： PCR反應體系每20 y L組成如下： 2. Power Taq PCR Master Mix IOuL IOyM上、下游引物 各IyL 20ng/ y L 模板 DNA 3 y L (IdH2O 補足至 20 y L ; PCR反應條件如下： 94°C預變性7min ;94°C變性45min、63°C退火45s、72°C延伸2min，共30個循環(huán)；最后于 72°C補平7min，終止溫度為4°C ; (3) 取步驟（2)擴增產(chǎn)物5 y L，與I y L 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5%的瓊 脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠圖像 分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)983bp的DNA條帶，則待測油茶品種為長林18號，反之則 否。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一對特異性高的油茶良種長林18號的分子特異性標記引物，以及一種能對油茶良種長林18號進行快速鑒定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-CATTACACCATCCTCTTGTTGC-3′，下游引物：5′-TGATCAATTACAGGGCTCGT-3′。本發(fā)明分子特異性標記引物可對油茶良種長林長林18號進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104946642
【申請?zhí)枴緾N201510407976
【發(fā)明人】李海波, 魏海龍, 胡傳久, 王麗玲, 徐梁
【申請人】浙江省林業(yè)科學研究院
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月10日