一種雙標(biāo)記熒光激活型探針及其檢測(cè)dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分子及基因標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙標(biāo)記熒光激活 型探針，以及應(yīng)用該探針在核糖核酸酶H(RNase H)輔助下高靈敏度分析檢測(cè)DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA是生命體重要的遺傳物質(zhì)，對(duì)特定序列DNA進(jìn)行準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)對(duì)于遺傳疾 病、病原性疾病的早期診斷以及對(duì)食物、環(huán)境樣品中病原菌檢測(cè)都具有十分重要的意義。 DNA的含量檢測(cè)通常是通過(guò)DNA雜交反應(yīng)，結(jié)合各種信號(hào)標(biāo)記技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。如常用的 Southern印跡雜交方法，需要經(jīng)過(guò)電泳分離結(jié)合放射性同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記，利用放射自 顯影或酶反應(yīng)顯色實(shí)現(xiàn)特定序列DNA的定量分析。該方法存在放射性危害等弊端，且檢 測(cè)信號(hào)無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，需要復(fù)雜的操作步驟才能實(shí)現(xiàn)信號(hào)的讀出。近年來(lái)，基于熒光標(biāo)記 的DNA雜交檢測(cè)方法由于設(shè)計(jì)靈活、操作簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)而獲得了廣泛的應(yīng)用。分子信標(biāo) (Molecular Beacon，簡(jiǎn)稱MB)探針技術(shù)是該類(lèi)方法的突出代表。MB探針是一種莖-環(huán)結(jié)構(gòu) 的短鏈DNA，其環(huán)狀部分大約為20個(gè)堿基長(zhǎng)度，和靶標(biāo)DNA互補(bǔ)，其莖部雙鏈兩端分別標(biāo)記 熒光分子和猝滅基團(tuán)。無(wú)靶標(biāo)DNA時(shí)，MB以發(fā)卡結(jié)構(gòu)存在，熒光猝滅。靶標(biāo)DNA存在時(shí)會(huì)與 MB的環(huán)狀部分雜交從而打開(kāi)MB的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，使熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，熒光得以恢復(fù)， 產(chǎn)生靶標(biāo)DNA的特異性熒光信號(hào)。基于分子信標(biāo)的DNA檢測(cè)方法能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)體系DNA的 含量信息，已獲得了廣泛的應(yīng)用。但需要指出的是每個(gè)靶標(biāo)DNA分子只能與一個(gè)MB探針?lè)?應(yīng)而僅激活一個(gè)熒光分子的熒光，缺乏信號(hào)放大機(jī)制，使得檢測(cè)靈敏度受到了極大的制約。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的雙標(biāo)記熒光激活型探針，該 探針在RNase H輔助下能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物樣品以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中DNA分子的快速、高 靈敏檢測(cè)。
[0004] 解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：所述雙標(biāo)記熒光激活型探針是與待測(cè) DNA序列堿基互補(bǔ)的5~40個(gè)堿基長(zhǎng)度的單鏈RNA，或者是與待測(cè)DNA序列堿基互補(bǔ)的5~ 40個(gè)堿基長(zhǎng)度的單鏈DNA，且該DNA序列中有1/5~4/5的堿基是RNA堿基，該探針的一個(gè) 末端修飾熒光基團(tuán)，另一個(gè)末端修飾猝滅基團(tuán)。
[0005] 上述雙標(biāo)記熒光激活型探針優(yōu)選與待測(cè)DNA序列堿基互補(bǔ)的10~30個(gè)堿基長(zhǎng)度 的RNA，或者優(yōu)選與待測(cè)DNA序列堿基互補(bǔ)的10~30個(gè)堿基長(zhǎng)度的單鏈DNA，且該DNA序 列中有1/2~4/5的喊基是RNA喊基，該探針的兩個(gè)末端分別標(biāo)記5^光基團(tuán)和粹滅基團(tuán)。
[0006] 上述的熒光基團(tuán)為熒光標(biāo)記物為熒光素類(lèi)、羅丹明類(lèi)、香豆素類(lèi)及它們的衍生 物中的任意一種或花青染料，具體如：6-羧基熒光素（FAM)、羧基四甲基羅丹明、2, 7-二 甲基-4, 5-二氯_6_羧基焚光素（JOE)、四氯_6_羧基焚光素（TET)、六氯-6-甲基焚光 素（HEX)、德克薩斯紅、3H-吲哚菁染料中的任意一種；上述的猝滅基團(tuán)為黑洞猝滅基團(tuán) (BHQ)、4- (4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（Dabcy 1)、[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯 胺（Eclipse)及它們的衍生物中的任意一種。
[0007] 采用本發(fā)明雙標(biāo)記熒光激活型探針檢測(cè)DNA的方法為：將雙標(biāo)記熒光激活型探 針、核糖核酸酶H、不同濃度待測(cè)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品混合，在30~40°C下反應(yīng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體 系的熒光信號(hào)，反應(yīng)完全后，根據(jù)不同濃度待測(cè)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線；然后按照上述方法測(cè)試待測(cè)DNA樣品對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)待測(cè)DNA 的定量檢測(cè)。
[0008] 上述檢測(cè)方法中，優(yōu)選反應(yīng)體系中雙標(biāo)記熒光激活型探針的初始濃度為0. 6~ L 2 μ mol/L，核糖核酸酶H的初始活性為2~5U〇
[0009] 本發(fā)明的雙標(biāo)記熒光激活型探針結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，探針一末端修飾熒光基團(tuán)，另一末端 修飾猝滅基團(tuán)，由于兩末端距離接近，熒光被完全猝滅。該探針與待測(cè)DNA雜交形成DNA/ RNA雜合雙螺旋結(jié)構(gòu)后，RNase H會(huì)高選擇性水解DNA/RNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的RNA，使得熒光 分子遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)，熒光信號(hào)得以恢復(fù)，而對(duì)單鏈RNA及DNA無(wú)影響。在此基礎(chǔ)上，游離的 探針會(huì)進(jìn)一步與待測(cè)DNA雜交、被RNase H水解并產(chǎn)生熒光信號(hào)，如此循環(huán)反復(fù)，使得體系 熒光信號(hào)得到顯著放大，從而可實(shí)現(xiàn)待測(cè)DNA的快速、高靈敏度檢測(cè)，克服了基于分子信標(biāo) 等熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA雜交檢測(cè)方法缺乏有效信號(hào)放大機(jī)制這一顯著缺點(diǎn)，且基于該探針 的信號(hào)放大機(jī)制只需要在常溫條件下即可進(jìn)行，檢測(cè)信號(hào)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，大大簡(jiǎn)化了 DNA檢 測(cè)的操作步驟。除用于直接檢測(cè)生物樣品中的待測(cè)DNA外，該探針還可以進(jìn)一步與各種核 酸擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合，用于擴(kuò)增產(chǎn)物中特定DNA序列的定量檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1是雙標(biāo)記熒光激活型探針信號(hào)放大體系用于DNA檢測(cè)的原理圖。
[0011] 圖2是實(shí)施例1中的雙標(biāo)記熒光激活型探針檢測(cè)不同濃度待測(cè)DNA的實(shí)時(shí)熒光監(jiān) 測(cè)圖。
[0012] 圖3是實(shí)施例1中的雙標(biāo)記熒光激活型探針檢測(cè)待測(cè)DNA的熒光信號(hào)與DNA濃度 的線性關(guān)系圖。
[0013] 圖4是實(shí)施例2中的雙標(biāo)記熒光激活型探針檢測(cè)待測(cè)DNA的實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)圖。
[0014] 圖5是實(shí)施例2中的雙標(biāo)記熒光激活型探針檢測(cè)待測(cè)DNA的熒光信號(hào)與DNA濃度 的線性關(guān)系圖。
[0015] 圖6是雙標(biāo)記熒光激活型探針用于滾環(huán)擴(kuò)增（RCA)產(chǎn)物檢測(cè)的原理圖。
[0016] 圖7是實(shí)施例3中的雙標(biāo)記熒光激活型探針檢測(cè)RCA產(chǎn)物的實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于 這些實(shí)施例。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 針對(duì)待測(cè)DNA序列TAAATGATAGTAGAGTTATGCTAA (由生工生物工程（上海）股份有 限公司提供），設(shè)計(jì)與其堿基互補(bǔ)的14個(gè)堿基長(zhǎng)度的RNA，其堿基序列為AUAACUCUACUAUC， 3' -末端標(biāo)記黑洞猝滅基團(tuán)（BHQl)、5' -末端標(biāo)記6-羧基熒光素（FAM)，得到雙標(biāo)記熒光 激活型探針（由Integrated DNA Technologies(USA)提供），由于距離接近，F(xiàn)AM的焚光信 號(hào)被BHQl所猝滅。在I XRNase H緩沖介質(zhì)中加入雙標(biāo)記熒光激活型探針、RNase H、待測(cè) DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，混合均勻，在37°C下反應(yīng)，控制反應(yīng)體系中雙標(biāo)記熒光激活型探針的初始濃 度為0. 8 μ mol/L、RNase H的初始活性為2. 5U，并控制反應(yīng)體系中待測(cè)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的初 始濃度分別為〇、1、5、10、20nmol/L，利用St印One實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng) 度（F)，檢測(cè)原理如圖1所示，熒光強(qiáng)度隨待測(cè)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度（C dna)變化的熒光光譜圖 見(jiàn)圖2,并繪制反應(yīng)120分鐘后熒光強(qiáng)度隨待測(cè)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度變化的線性曲線圖，結(jié)果 見(jiàn)圖3。由圖2可見(jiàn)，隨待測(cè)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度在0~20nmol/L范圍內(nèi)逐漸升高，反應(yīng)體系 熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。由圖3可見(jiàn)，熒光強(qiáng)度與待測(cè)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度呈線性關(guān)系，線性方程 為：
[0020] F = 357. 9+1740. 2 X Cdna
[0021] 相關(guān)系數(shù)!為0. 9985,由相關(guān)系數(shù)可