黃瓜靶斑病抗病連鎖分子標(biāo)記及其專用引物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標(biāo)記，特別涉及與黃瓜靶斑病抗病基因 Cca 連鎖的分子標(biāo)記及其在黃瓜種質(zhì)資源選擇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜（Cucumis Sativus. L)在世界上廣泛栽培，中國(guó)是世界上黃瓜栽培面積最大、 總產(chǎn)量最高的國(guó)家。
[0003] 黃瓜棒孢葉斑病，又稱祀斑病，是一種世界性分布的病害。目前已成為危害黃瓜露 地和保護(hù)地栽培的重要病害之一，尤以越冬溫室、冬春溫室、春大棚等保護(hù)地內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重。 主要危害葉部，病斑初呈淡褐色后變褐綠色，嚴(yán)重時(shí)葉片枯死。該病導(dǎo)致落葉率低于5 %時(shí)， 病情擴(kuò)展慢，約2周，而后一周內(nèi)發(fā)展快，落葉率可由5 %發(fā)展至90 %。棚室內(nèi)反季節(jié)種植黃 瓜在冬春季節(jié)和初夏均易流行發(fā)病。田間發(fā)病率一般在10% -25%，嚴(yán)重時(shí)為60% -70%， 造成損失達(dá)30%以上。靶斑病采用化學(xué)防治效果不理想，不僅使生產(chǎn)投入增加且會(huì)造成環(huán) 境安全隱患，倒茬嫁接使技術(shù)困難和勞動(dòng)成本增加。因此選育抗病品種是解決靶斑病危害 的最佳途徑。
[0004] 黃瓜靶斑病抗病基因影響黃瓜對(duì)靶斑病的抗性，它的研究將會(huì)推動(dòng)抗病育種進(jìn) 程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中十分有效。分 子標(biāo)記是在DNA水平上對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)， 可在苗期進(jìn)行選擇，加快育種進(jìn)程。因此，開發(fā)用于輔助鑒定黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的分 子標(biāo)記十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種黃瓜靶斑病抗病連鎖分子標(biāo)記 及其專用引物和應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0007] -種黃瓜靶斑病抗病連鎖分子標(biāo)記，是用以下引物自黃瓜總DNA中擴(kuò)增出來(lái)的核 苷酸序列之一：序列表中SEQ IDN0:1和SEQ ID NO: 2、序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4。
[0008] 獲得上述黃瓜靶斑病抗病連鎖分子標(biāo)記的引物如下：1)獲得黃瓜靶斑病抗病連 鎖分子標(biāo)記CcaSNPl的引物為序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 ;2)獲得黃瓜靶斑病抗 病連鎖分子標(biāo)記CcaSNP2的引物為序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
[0009] 利用上述引物對(duì)，通過(guò)常規(guī)PCR法可得到上述分子標(biāo)記。
[0010] 本發(fā)明涉及的與黃瓜抗靶斑病共分離的dCAPs標(biāo)記CcaSNPl，是利用抗/感遺傳 群體（母本:WF2757,抗靶斑??；父本：新泰密刺，感靶斑?。┻M(jìn)行精細(xì)定位和克隆獲得的。 通過(guò)利用150株的F2:3群體對(duì)靶斑病抗病基因 Cca進(jìn)行初步定位，然后利用2000株的F2群 體對(duì)Cca基因進(jìn)行精細(xì)定位到80kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間內(nèi)含3個(gè)基因，分別是NB-ARC抗病 基因、BHC-Iike轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因和33-like肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因，其中NB-ARC 基因經(jīng)過(guò)驗(yàn)證分析，被證實(shí)為靶斑病抗病基因 Cca的重要候選基因。通過(guò)對(duì)比研究Cca基 因在抗/感黃瓜材料中的序列差異，發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)，依據(jù)http://helix, wustl. edu/ dcaps/dcaps. html，在線設(shè)計(jì)軟件，開發(fā)設(shè)計(jì)了與抗/感祀斑病緊密連鎖的dCAPs分子標(biāo)記 CcaSNPl。同時(shí)利用CcaSNPl標(biāo)記分析2000多株遺傳群體材料，結(jié)合田間靶斑病接種鑒定 研究，發(fā)現(xiàn)CcaSNPl標(biāo)記與抗感靶斑病緊密連鎖，達(dá)到共分離。
[0011] 本發(fā)明涉及的另一個(gè)黃瓜抗靶斑病SNP2關(guān)鍵位點(diǎn)，其在抗病基因 Cca中導(dǎo)致了氨 基酸編碼的變化。該SNP位點(diǎn)是通過(guò)對(duì)不同遺傳背景的黃瓜靶斑病抗感材料進(jìn)行基因組重 測(cè)序獲得的，通過(guò)對(duì)多個(gè)黃瓜抗感材料進(jìn)行重測(cè)序，利用BWA-Samtools(vO. I. 12a，mpileup 按照默認(rèn)參數(shù)）軟件分析Cca基因在不同材料中的SNP位點(diǎn)，結(jié)合黃瓜基因組9930-V2和基 因組注釋，發(fā)現(xiàn)Cca基因的210位存在單堿基差異SNP2位點(diǎn)（由G到A)。并利用該SNP2 位點(diǎn)設(shè)計(jì)標(biāo)記，獲得CcaSNP2分子標(biāo)記，通過(guò)分析上述黃瓜材料的基因型，結(jié)合田間靶斑病 接種鑒定材料抗感病表型，發(fā)現(xiàn)CcaSNP2標(biāo)記分析的基因型與抗感表型一致，證明CcaSNP2 可作為靶斑病緊密連鎖分子標(biāo)記，篩選黃瓜材料。
[0012] 上述分子標(biāo)記或引物在選育抗黃瓜靶斑病品種中的應(yīng)用。
[0013] 在上述應(yīng)用中，優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記CcaSNPl在選育抗黃瓜靶斑病品種中的應(yīng) 用的具體方法為：以待測(cè)黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQ ID NO: 1和序列 表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸組成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用MaeII內(nèi)切酶對(duì) PCR產(chǎn)物酶切，如果得到165bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為抗病材料；如果得到135bp的酶 切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為感病材料；更優(yōu)選地，所述待測(cè)黃瓜材料為WF2757或者長(zhǎng)春密刺，或 者以WF2757和/或長(zhǎng)春密刺作為親本得到的子代；
[0014] 在上述應(yīng)用中，優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記CcaSNP2在選育抗黃瓜靶斑病品種中的應(yīng) 用的具體方法為：以待測(cè)黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQ ID N0:3和序 列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸組成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用XbaI內(nèi)切 酶對(duì)PCR產(chǎn)物酶切，如果得到164bp的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為抗病材料；如果得到134bp 的酶切產(chǎn)物，則待測(cè)黃瓜為感病材料；更優(yōu)選地，所述待測(cè)黃瓜材料為BANNA HUANGGUA， 或者 CUCUMIS HARDWICKII，或者 DI HUANGGUA，或者以 BANNA HUANGGUA 和 / 或者 CUCUMIS HARDWICKII作為親本得到的子代，或者以DI HUANGGUA作為親本得到的子代，或者DI HUANGGUA和CUCUMIS HARDWICKII作為親本得到的子代，或者以BANNA HUANGGUA和DI HUANGGUA作為親本得到的子代。
[0015] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0016] 本發(fā)明的dCAPs標(biāo)記CcaSNPl和CcaSNP2與黃瓜靶斑病抗病存在緊密連鎖關(guān)系 (共分離），可鑒定目的基因黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的存在，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗病植株的間接選擇， 由于不受其他基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，可用于早代選擇，縮短育種年限，提高育種效 率，為進(jìn)行黃瓜靶斑病抗病育種提供技術(shù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是黃瓜靶斑病抗病基因 Cca定位連鎖圖譜，其中左圖黃瓜靶斑病基因初定位 示意圖，中間兩個(gè)圖為靶斑病抗病基因精細(xì)定位示意圖，右圖為80kb區(qū)間范圍內(nèi)基因分布 情況及基因注釋；
[0018] 圖2是Cca基因 CcaSNPl分子標(biāo)記在某一群體中酶切驗(yàn)證結(jié)果示意圖；
[0019] 圖3是Cca基因 CcaSNP2分子標(biāo)記在某一群體中酶切驗(yàn)證結(jié)果示意圖；
[0020] 圖4是Cca基因 CcaSNPl分子標(biāo)記在未知另一群體中的酶切鑒定結(jié)果示意圖；
[0021] 圖5是Cca基因 CcaSNP2分子標(biāo)記在另一未知群體中的酶切結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于此。
[0023] 實(shí)施例1 :黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的獲得
[0024] -、黃瓜靶斑病抗病基因 Cca初步定位和精細(xì)定位
[0025] 具體的定位方法包括以下步驟：
[0026] A、黃瓜靶斑病抗病基因定位研究親本及遺傳群體：
[0027] 分別選擇WF2757 (母本）和新泰密刺（父本）為抗感親本，構(gòu)建150株的F2:3群 體和超過(guò)2000株的F2大群體。其中，父本新泰密刺和母本W(wǎng)F2757購(gòu)自北京市農(nóng)作物種質(zhì) 資源庫(kù)。
[0028] B、黃瓜靶斑病抗病基因定位研究病情指數(shù)調(diào)查：
[0029] 將親本及各群體的種子用紗布包裹，溫湯浸種，28°C恒溫催芽后播于50孔穴盤 中，在空調(diào)溫室育苗，育苗基質(zhì)為滅菌的珍珠巖或營(yíng)養(yǎng)土。
[0030] 黃瓜棒抱葉斑病病原菌多主棒抱菌[Corynespora cassiicola(Berk. Curt.) Wei.]是通過(guò)高葦?shù)仍谖墨I(xiàn)（河北青縣黃瓜棒孢葉斑病病原菌種群分化的研究，華北農(nóng)學(xué) 報(bào)，2011,26(5) :9-15)中記載的分離方法獲得的。采用闞琳娜等（黃瓜褐斑病防治藥劑的 活體篩選，中國(guó)蔬菜，2007 (4) : 22~24)的方法制備黃瓜靶斑病菌液，濃度為I X IO5個(gè)孢子 /mL，血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度。于黃瓜幼苗期進(jìn)行懸浮菌液噴霧接種，用小型手持噴霧器 將制備好的懸浮菌液均勻地噴灑于黃瓜葉片上，以葉片有水滴流淌為度。接種后置于25°C 光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)30株。
[0031] 按上述方法接種后7~IOd進(jìn)行病情調(diào)查。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)： 病斑面積占整個(gè)葉面積的5%以下；2級(jí)：病斑面積占5%~25% ;3級(jí)：病斑面積占26%~ 50% ;4級(jí)：病斑面積占51 %~75% ;5級(jí)：病斑面積達(dá)75%以上。其中2以下為抗病，3以 上為感病類型。
[0032] 對(duì)親本及各群體的病情進(jìn)行精確統(tǒng)計(jì)。
[0033] C、黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的初步定位：
[0034] 利用 Cavagnar 等（Genome-wide characterization of simple sequence repeats in cucumber. BMC Genomics，2010, 11:569)發(fā)表的黃瓜高密度遺傳圖引物信息和和本實(shí) 驗(yàn)室開發(fā)的Indel和SNP引物信息（參見(jiàn)表1中序號(hào)為1-8的引物信息），結(jié)合150株的 F2群體病情指數(shù)的精確統(tǒng)計(jì)，對(duì)親本和后代群體進(jìn)行分子標(biāo)記分析，編碼采集親本及群 體單株的基