因型數(shù)據(jù)。母本基因型記為A，父本的基因型記為B，F(xiàn) 1雜合基因型記為H，模 糊或缺失數(shù)據(jù)記為U。用x2test對數(shù)據(jù)進行比例適合性檢驗分析，采用JoinMap4.0軟件 (Staml993 ;Van 0oijen2001)構(gòu)建連鎖圖譜，設(shè)置軟件LOD閥值為4. 0以及選取Kosambi公 式（Kosambil944)，對黃瓜抗靶斑病基因初步定位在6號染色體的530kb(Indell6624801 和 Indel 17156286)區(qū)間內(nèi)，根據(jù) Li 等（RNA-Seq improves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome. BMC genomics，2011，12:540)對黃瓜基因組的注釋和通過 Softberry在線軟件進行預(yù)測，該區(qū)間存在一個由多個NBS-LRR抗病基因組成的NBS-LRR串 聯(lián)抗病基因（NBS-LRR為抗病基因保守結(jié)構(gòu)域），難以預(yù)測和選擇候選基因。所以需要進一 步擴大群體進行精細定位研究。
[0035] D、黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的精細定位：
[0036] 經(jīng)過構(gòu)建超過2000株的F2大群體繼續(xù)對抗靶斑病基因進行精細定位，同時，本 實驗室對所用抗感親本進行了基因組重測序，經(jīng)過生物信息比對分析，在雙親間開發(fā)Indel 和SNP分子標記，在初定位區(qū)間的530kb范圍內(nèi)選擇設(shè)計了 19對Indel分子標記（參見表 1序列號為9-27的引物信息）進行群體分析，經(jīng)過驗證后利用這19對Indel標記對抗靶斑 病基因進行了精細定位研究，其中引物的合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成， 最終在2000株的F 2大群體中精細定位到80kb (Indel 16874230和Indel 16953846)的范圍 內(nèi)，參見圖1。在精細定位區(qū)間內(nèi)近2200株的試驗材料中存在4個交換單株。
[0037] 采用上述19對Indel分子標記進行精細定位時的各PCR反應(yīng)體系（10 μ L)如下： 25ng 基因組模板 DNA，0. 5 μ M 上游引物，0. 5 μ M 下游引物，0. 2mM 的 dNTP mix ;0. 5U Taq DNA 聚合酶，I X PCR Buffer (Fermentas) 2 μ L，ddH20 補足到 10 μ L。
[0038] PCR 反應(yīng)程序為：階段 I :95 °C 預(yù)變性 3min ;階段 2 :94 °C 30s，60 °C lmin， 72°C lmin，退火溫度每個循環(huán)降1°C，共8個循環(huán)；階段3 :94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin， 共32個循環(huán)；階段4 :72 °C延伸5min ;階段5:4 °C保存；其中，PCR儀為購自Applied Biosystems 公司的 Veriti96well Thermal Cycler。
[0039] 表1Cca基因定位部分分子標記信息
[0040]
[0042] E、抗靶斑病基因預(yù)測分析：
[0043] 在精細定位的80kb區(qū)間內(nèi)，有3個基因，經(jīng)過NCBI Blast在線比對分析，第1個 基因為NB-ARC基因，第2個基因為BM2-like的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，第三個基因為33-like 肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因。NB-ARC是NBS-LRR類抗病基因中常見的保守結(jié)構(gòu)域，因此 定位該NB-ARC基因是抗靶斑病的重要候選基因 Cca。精細定位的結(jié)果排除了初定位區(qū)間 中NBS-LRR串聯(lián)抗病基因的干擾。Cca基因在抗/感材料間存在一個SNP，在基因的第1481 位，抗病基因堿基為G，而感病基因堿基為T。推測該SNP可能導致抗病力的改變，可用于開 發(fā)抗靶斑病緊密連鎖分子標記，該NB-ARC基因為靶斑病的抗病候選基因。
[0044] 二、黃瓜靶斑病抗病基因 Cca全長DNA序列的獲得
[0045] A、供試材料：
[0046] 所述的供試材料為抗病材料WF2757,以感病材料新泰密刺作為對照。
[0047] B、黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的DNA全長的擴增：
[0048] 黃瓜基因組DNA的提取采用CTAB法，以供試抗/感材料基因組DNA為模板，利用 Cca基因全長擴增上下游引物SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6進行基因全長PCR擴增，經(jīng)過序 列拼接分別得到Cca基因在抗/感材料上的基因全長SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8,全長均 計3255bp。利用DNAMN軟件對抗/感材料的Cca基因全長進行比對分析，發(fā)現(xiàn)在抗/感材 料間Cca基因的第1481位存在一個SNP，抗病材料中堿基為G，而感病材料中堿基為T。該 SNP可做為抗靶斑病緊密連鎖的分子標記，應(yīng)用于世界范圍內(nèi)的黃瓜靶斑病抗病育種。
[0049] 所述的PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系（20 μ L)中含有：25ng模板DNA，0. 5 μ M 上游弓丨物，0·5μM下游弓丨物，0·2mM的dNTPmix;0·5UTaqDNA聚合酶，lXPCR Buffer (Fermentas) 2 μ L，ddH20 補足到 20 μ L。
[0050] 所述的 PCR 反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性 3min ;94°C 30s，60°C lmin，72°C 4min，共 42 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ;PCR 儀為購自 Applied Biosystems 公司的 Veriti96well Thermal Cycler。
[0051] 所述的擴增產(chǎn)物用滅菌的去離子水稀釋至80μ L，放入Caliper核酸自動分析儀 進行分析。
[0052] 上下游引物SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6，DNA全長序列的PCR產(chǎn)物測序和序列拼接 均在上海生工公司進行合成和分析。測序結(jié)果表明黃瓜靶斑病抗病基因 Cca的全長DNA序 列如序列表中SEQ ID N0:7所示，共3255bp。
[0053] 三、黃瓜祀斑病抗病基因 Cca的功能驗證
[0054] 待測材料：以WF2757和長春密刺為親本，構(gòu)建F2遺傳群體，從中隨機選取120個 單株進行靶斑病抗病鑒定和測序。其中，父本長春密刺和母本W(wǎng)F2757購自北京市農(nóng)作物種 質(zhì)庫。
[0055] 將上述待測材料的種子用紗布包裹，溫水浸種，28°C恒溫催芽后播于50孔穴盤 中，在空調(diào)溫室育苗，育苗基質(zhì)為滅菌的珍珠巖或營養(yǎng)土，然后采用CTAB法從幼苗中提取 各待測材料的基因組DNA，并以各基因組DNA為模板，利用上下游引物SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6進行Cca基因全長PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物測序并進行序列拼接，最終確認上述120 份待測材料中有34株幼苗具有SEQ ID NO: 7所示的Cca基因。所述PCR擴增參見本實施例 第二部分步驟B。
[0056] 3、對具有SEQ ID NO: 7所示的Cca基因的幼苗進行靶斑病抗性檢測
[0057] 采用本實施例第一部分步驟B的方法對上述34株具有SEQ ID NO: 7所示的Cca基 因的黃瓜材料進行田間靶斑病抗性檢測。
[0058] 通過病情統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，上述具有SEQ ID NO: 7所示的Cca基因的黃瓜苗中，病情 均在2級以下，其中12株0級，13株1級、9株2級，由此說明，Cca基因的存在與黃瓜抗靶 斑病性狀具有一致性。
[0059] 實施例2 :與黃瓜靶斑病抗病基因 Cca共分離的dCAPs標記CcaSNPl的獲得及功 能驗證
[0060] 一、dCAPs 標記 CcaSNPl 的獲得
[0061] 通過實施例1可知，Cca基因在抗/感材料間的第1481位間存在一個SNP，抗病 材料中堿基為G，而感病材料中堿基為T，利用此SNP位點，依據(jù)dCAPs引物在線設(shè)計網(wǎng)站 http://helix. wustl. edu/dcaps/dcaps. html，開發(fā)設(shè)計與抗 / 感祀斑病緊密連鎖的 dCAPs 分子標記，命名為CcaSNPl，其上下游引物如序列表中SEQ IDN0:1和SEQ ID NO:2所示。
[0062] 通過上述引物對（序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2)以雙親材料（抗病材料 WF2757和感病材料新泰密刺）的基因組DNA作為模板進行PCR擴增，并結(jié)合MaeII內(nèi)切酶對 PCR產(chǎn)物酶切，分別獲得抗/感病特異條帶，其中抗病條帶為165bp，而感病條帶為135bp。
[0063] 二、與靶斑病抗病基因 Cca共分離的dCAPs標記CcaSNPl的驗證
[0064] 利用上述引物對（序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2)對實施例1第一部分步 驟A構(gòu)建的150株F2:3群體株系和2000株F2遺傳群體中的早期黃瓜材料進行PCR和酶切 分析，即以150株F 2:3群體株系和2000株F2遺傳群體中的早期黃瓜材料的基因組DNA作為 模板，利用上述引物進行PCR反應(yīng)，然后對PCR產(chǎn)物進行MaeII內(nèi)切酶酶切鑒定，酶切產(chǎn)物 用2%的瓊脂糖凝膠電泳，如酶切產(chǎn)物中有165bp的抗病條帶則該株系為候選的抗病植株， 如酶切產(chǎn)物中有135bp的感病條帶則該株系不具有黃瓜靶斑病抗性，部分電泳結(jié)果參見圖 2 ;同時按照實施例1第一部分步驟B的方法對這2150株黃瓜材料的抗病性進行田間鑒定， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用上述dCAPs分子標記CcaSNPl的引物對輔助鑒定與田間鑒定結(jié)果抗病吻合 率達到100 %，即Cca基因中的dCAPs分子標記與2150株黃瓜材料抗病表型緊密連鎖，一致 性達100%，達到共分離的水平。充分證實了由該SNP位點開發(fā)的dCAPs分子標記能夠應(yīng)用 與革巴斑病抗/感病篩選和分子輔助育種研究。
[0065] 本實施例中的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序同實施例1中第一部分的步驟D。
[0066] 酶切體系（30 μ 1)中含有：PCR擴增產(chǎn)物10 μ 1，IOXBuffer R(購自Thermo公 司）2 μ I，MaeII (購自Thermo公司）L 0 μ 1，滅菌雙蒸水補足到30 μ