歐當(dāng)歸的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種歐當(dāng)歸的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 歐當(dāng)歸（Levisticum officinale Koch)，又名保當(dāng)歸，系傘形科歐當(dāng)歸屬多年生 草本植物。1957年，當(dāng)歸緊缺時(shí)從保加利亞引種，在我國(guó)河北、北京、山東、河南、內(nèi)蒙古、遼 寧、陜西、山西及江蘇等地均有栽培。歐當(dāng)歸以干燥的根入藥，早為德國(guó)藥典所收載，香氣特 異而渾濁，性甘、味微辣、微甘而有麻舌感，具有利尿、健胃、祛痰、治療婦科病等功效，是正 品當(dāng)歸常見的偽品。
[0003] 由于歐當(dāng)歸的藥效不及當(dāng)歸，而且藥理上也有較大的不同，因而不能作為當(dāng)歸使 用，但是其本身有藥效，而且栽培容易，生長(zhǎng)期短，因此，有效鑒別歐當(dāng)歸，對(duì)其進(jìn)合理使用 是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的、方便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)歐當(dāng) 歸的試劑盒和方法。
[0005] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 1所示的種核苷酸序列。
[0006] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的試劑在制備歐當(dāng)歸檢測(cè)試劑 中的用途。
[0007] 所述檢測(cè)SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的試劑包括擴(kuò)增SEQ ID NO. 1所示核苷酸 序列的試劑。
[0008] 所述歐當(dāng)歸是傘形科植物歐當(dāng)歸Levisticum officinalis Koch所述擴(kuò)增的試劑 包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物對(duì)。
[0009] 本發(fā)明檢測(cè)歐當(dāng)歸的試劑盒，包括檢測(cè)SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的相關(guān)試劑。
[0010] 所述試劑包括擴(kuò)增SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的試劑。
[0011] 所述擴(kuò)增的試劑包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物對(duì)。
[0012] 本發(fā)明一種歐當(dāng)歸的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0013] a，DNA提?。禾崛〈龣z樣本中的DNA ;
[0014] b，檢測(cè)：用前述的試劑盒檢測(cè)待檢樣本，即可。
[0015] 本發(fā)明SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列為歐當(dāng)歸特異性序列，通過(guò)檢測(cè)這些序列可 以準(zhǔn)確區(qū)分歐當(dāng)歸與當(dāng)歸、日本當(dāng)歸，從而有效鑒定待檢樣本是否為歐當(dāng)歸，為藥材的合理 使用提供指導(dǎo)，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，具有良好的應(yīng)用前景。
[0016] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限 制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，都是本發(fā)明保護(hù)的內(nèi) 容。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1.歐當(dāng)歸的改良RAPD擴(kuò)增。箭頭為A23的RPAD片段，用于膠回收和克隆。
[0018] 圖2陽(yáng)性克隆的菌落PCR鑒定。藍(lán)色所指通道的陽(yáng)性克隆用于Sanger測(cè)序。通道 "M"顯示有分子重量（bp)的DL2000 DNA標(biāo)記。泳道1-4分別代表不同陽(yáng)性克隆的菌落。
[0019] 圖3不同物種及當(dāng)歸品種的鑒定。通道1-18號(hào)分別為甘肅岷縣當(dāng)歸，日本當(dāng)歸， 四川阿壩當(dāng)歸，甘肅平?jīng)霎?dāng)歸，湖北當(dāng)歸，四川九寨當(dāng)歸，歐當(dāng)歸，云南麗江當(dāng)歸，四川綿陽(yáng) 當(dāng)歸，銀杏，荔枝，龍眼，青果，金銀花，梔子花，靈芝，龍荔，趕黃草。藍(lán)色所指的通道2為日 本當(dāng)歸，通道7為歐當(dāng)歸。通道"M"顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA標(biāo)記。
[0020] 圖4不同歐當(dāng)歸品種的鑒定。通道1、2和3是日本當(dāng)歸，分別來(lái)自重慶，四川峨眉， 延吉吉林；通道4和5是歐當(dāng)歸，來(lái)自長(zhǎng)春吉林和四川甘孜；6是正常岷縣當(dāng)歸；通道"M"顯 示有分子重量（bp)的DL2000DNA標(biāo)記。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1 RAPD技術(shù)擴(kuò)增歐當(dāng)歸特異SCAR標(biāo)記
[0022] 一、CTAB法提取植物DNA
[0023] 取歐當(dāng)歸0. 2g置于I. 5mL EP管中，加入液氮約半分鐘后用研缽棒碾碎成細(xì)粉，立 即加入 500 μ 1 的 CTAB 提取緩沖液[CTAB2%，Tris-HCl (ρΗ8· 0) IOOmmol · L-1，EDTA20mmol mmol · L-1，NaCL I. 4mol · L-SO. 4%的β -巰基乙醇]，60°C水浴保溫1小時(shí)后，加入等體 積的氯仿-異戊醇（24 :1)抽提，輕顛倒混勻，10000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘，吸取上清液，取 上清加入2/3體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻；12000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘，棄上 清，小心傾去上清液，沉淀用70 %乙醇和無(wú)水乙醇各輕洗一次，棄洗液，留沉淀，空氣干燥。 用100 μ 1的IXTE溶液溶解備用。將樣品用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量， 用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，稀釋至濃度IOng/μ 1，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｔ斠姟毒庒t(yī)學(xué)分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》（中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，主編：傅俊江）。
[0024] 二、RAPD 技術(shù) PCR 擴(kuò)增
[0025] 利用 RAPD 技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增（參照 Fu J, Yang L, Khan MA, Mei Z (2〇I3) Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by using improved RAPD analysis. Mol Biol Repj40(10):5993-9)：
[0026] 以步驟一提取的核酸作為模板，用RAH)引物SBA-Al和SBS-A2進(jìn)行擴(kuò)增（序列見 表2,北京賽百盛公司合成），PCR擴(kuò)增采用10 μ 1反應(yīng)體系包括μ 1的引物（2.5 μπιο?/ L)，1. 5 μ I (15ng)模板 DNA，5 μ 1 的 2 X PCR Taq Mastermix (天根生物公司，北京）和 2. 5 μ 1的滅菌雙蒸水。充分混勾后，于離心機(jī)12000rpm離心15s，置于PCR儀（Applied Biosystems Veriti?96-Well Thermal Cycler，Life Technology, USA)。PCR 反應(yīng)條件是： 95°C I分30秒，94°C 40秒，36度60秒，72°C I分30秒，40個(gè)循環(huán)，最后72°C 5分鐘，其中 RAMP為5%。然后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，曝光顯色。
[0027] 表 1
[0028]
[0029] 瓊脂糖凝膠電泳（參見《精編醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 主編：傅俊江）：
[0030] (1)制備1. 5%的瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物按順序全部點(diǎn)樣到凝膠孔內(nèi)，同時(shí)點(diǎn)樣 一個(gè)DNA分子大小標(biāo)記（DL2000, TIANGEN公司，北京）。注意：不需要加載樣緩沖液，PCR擴(kuò) 增用的2Xmix就預(yù)加了相關(guān)成分。
[0031] (2)電泳（電泳儀由北京百晶生物有限公司生產(chǎn)，BG-subMID Icell)，常選擇電壓 110V，電泳時(shí)間30min即可，
[0032] 三、RAPD擴(kuò)增條帶的分離
[0033] 1.片段回收
[0034] 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下剪切圖正品歐當(dāng)歸品種的特異片段A1-0,用 DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生物公司）回收RAH)擴(kuò)增的DNA片段。
[0035] 2.克隆
[0036] 接著利用pGEM-T載體（Promega Corporation)和回收RAPD擴(kuò)增的DNA片段在 T4-DNA連接酶作用下連接（16°C連接8小時(shí)）。連接后加入30 μ 1活化的DH5 α細(xì)菌，冰 浴30分鐘，接著42 °C激活45秒，然后冰浴2分鐘，再加入300 μ 1無(wú)氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 基（配制方法：12. 5克LB粉加500ml水高溫滅菌）200轉(zhuǎn)每分鐘搖動(dòng)45分鐘，然后將液體 均勻涂抹在含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)15小時(shí)[固體培養(yǎng)基配制方法： 12. 5克LB粉，7. 5克瓊脂粉和500毫升水高溫滅菌后，在50°C時(shí)加入500 μ 1的氨芐青霉素 (100mg/ml)，使用前在固體培養(yǎng)基表面涂抹40 μ 1的20mg/ml的X-GAL (5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-半乳糖苷）和20 μ 1的24mg/ml的IPTG (異丙基硫代半乳糖苷）]進(jìn)行藍(lán)白篩選， 篩選白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。
[0037] 3.陽(yáng)性克隆鑒定
[0038] 每個(gè)皿挑選多個(gè)白色菌落，分別加入到300 μ 1含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 220轉(zhuǎn)每分鐘搖2-4小時(shí)，取0. 2~0. 5 μ 1培養(yǎng)基進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)。10 μ 1體積的反應(yīng) 體系是：2XPCR Taq Mastermix 5yl，DNA 0·5μ1，通用引物（SP6+T7)lyl(2.5ymol/L)， 水3. 5 μ 1。PCR反應(yīng)條件是：95 °C 1分30秒，94°C 40秒，58 °C 30秒，72 °C 40秒，30個(gè)循環(huán)， 最后72°C 5分鐘。然后用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色、曝光顯色。
[0039] 4.結(jié)果
[0040] 改良RAro擴(kuò)增見圖1。陽(yáng)性克隆的菌落PCR擴(kuò)增和電泳鑒定結(jié)果如圖2。
[0041] 五、測(cè)序分析
[0042] 1.測(cè)序
[0043] 挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序的核苷酸序列如下（SEQ ID NO. 1所示）：
[0044] GCCGAGCTGTATGAACAACTTGTCGAGTTCATCTTCAACTGATCAAAAGGTCCTGTCCTTGACTCGCCG TGTTGTATGAACAACTCATAGAGTTCATCTTCATCCATAAGAAGATTGCCTTAGACTCGCCGAGTCTGCTCATGCAC TCGCTG