一種檢測(cè)口蹄疫o型病毒的試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種可用于檢測(cè)口蹄疫O型病毒的引物，以及用這些引物制備的檢測(cè)試劑盒和制備方法。本發(fā)明的用于檢測(cè)口蹄疫O型病毒的引物基因序列為SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明的引物序列可特異性快速擴(kuò)增口蹄疫O型病毒的核酸，通過核酸電泳檢測(cè)到特異性條帶，并具有特異性。本發(fā)明能夠?qū)谔阋卟《具M(jìn)行高通量的定性、定型和定量檢測(cè)。相比于其他已存在的方法和試劑盒，本發(fā)明在用于港口檢疫、動(dòng)物流通環(huán)節(jié)檢疫以及實(shí)驗(yàn)室診斷均很大的優(yōu)勢(shì)。
【專利說明】一種檢測(cè)口蹄疫0型病毒的試劑盒及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可用于檢測(cè)口蹄疫0型病毒的引物及檢測(cè)試劑盒和制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的動(dòng)物急性、烈性傳染病，主要危害豬、牛、羊痘偶蹄動(dòng)物，發(fā)病 率極高，造成了巨大的政治、經(jīng)濟(jì)損失，因此被世界衛(wèi)生組織（0ΙΕ)列為A類傳染病的首位。 FMDV可以分為7個(gè)血清型，即A型、0型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型， 每個(gè)血清又有許多不同的亞型，且各血清型之間沒有交叉性免疫，同一血清型的各亞型之 間僅有部分交叉免疫。
[0003] 口蹄疫病毒的分型鑒別診斷一直是研究的熱點(diǎn)。由于口蹄疫各血清型之間沒有交 叉保護(hù)，同一血清型的各亞型之間僅有部分交叉免疫，這使得口蹄疫的診斷和控制更加困 難。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)曾被用于口蹄疫診斷和病毒分型，直到1970s該方法仍在一些流行病地 區(qū)使用，但是該方法的靈敏度比較低。Roeder和Le Blanc Smith通過使用兔和豚鼠抗純 化146S 口蹄疫病毒顆粒高滴度抗血清的ELISA方法成功地檢測(cè)了口蹄疫病毒抗原。該方法 的靈敏度比補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)高125倍，并且被用作常規(guī)口蹄疫的診斷和病毒分型。但是ELISA 方法檢測(cè)含病毒的上皮懸浮液只有約70-80%陽性結(jié)果，因此病毒必須在組織培養(yǎng)中進(jìn)行 增殖后，再通過ELISA中進(jìn)行檢測(cè)和血清型分型?；趩慰沟腅LISA也被開發(fā)用于口蹄疫 的診斷和病毒分型（Chen, H, et al.，2012; Morioka K，et al.,2009)。最近，有人研發(fā) 了基礎(chǔ)整聯(lián)蛋白α νβ6和血清特異性單克隆抗體的夾心ELISA方法，并將該方法與普通 的多克隆抗體夾心ELISA方法進(jìn)行了比較。整合蛋白/單克隆抗體的ELISA可以識(shí)別FMDV 的多種抗原和不同的血清型，雖然該方法在同一靈敏度的條件下比常規(guī)的多克隆ELISA具 有更高的特異性，但是仍然有一些FMDVs不能被檢測(cè)出來，（Ferris NP，et al. ,2011)。
[0004] 由于RT-PCR快速，靈敏和可靠性的優(yōu)點(diǎn)，該方法已被廣泛地用于口蹄疫診斷。近 年來各種RT-PCR檢測(cè)方法已用于早期上皮細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)分離和其組織中口蹄疫病毒RNA 的檢測(cè)（Meyer RF，et al.，l991)。Rodriguez等首次可通過RT-PCR對(duì)口蹄疫病毒〇型、 A型和C型進(jìn)行分型檢測(cè)（Rodriguez A，et al.，1992)。自此以后不同血清型特異性 引物RT-PCR方法己被用于口蹄疫病毒7個(gè)血清型份分型檢測(cè)（Callens，et al.，1997; Vangrysperre，et al. ,1996)。這些檢測(cè)引物位于口蹄疫病毒基因組的不同位置，包括5' 非編碼區(qū)、開放閱讀框和3'端非編碼區(qū)。為了提高RT-PCR診斷靈敏度，多組引物結(jié)合的多 重檢測(cè)也被用于口蹄疫的檢測(cè)（Giridharan P, et al.，2〇〇5; Bao H，et al.，2008)，但是 這些RT-PCR方法的靈敏度依然有限，若前期再結(jié)合ELISA方法一起使用必然會(huì)使該過程更 加耗時(shí)費(fèi)力。
[0005] 最近，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒的檢測(cè)，該方法不需要PCR 后期處理(例如凝I父分析)且通過應(yīng)信號(hào)來直接監(jiān)視目標(biāo)cDNA的擴(kuò)增。TaqMan實(shí)驗(yàn)的檢測(cè) 效果問抗原結(jié)合ELISA的病毒分罔實(shí)驗(yàn)一樣（Reid SM，et al·，20〇3)。目前，兩種不同的 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR TaqMan實(shí)驗(yàn)已普遍使用，一種針對(duì)5'非編碼區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)（IRES) (Reid SM，et al.，2002)和第二種針對(duì)3D (RNA聚合酶）的編碼序列。實(shí)時(shí)熒 光定量RT-PCR方法的速度和準(zhǔn)確性可以從樣品核酸提取到實(shí)驗(yàn)建立的計(jì)算機(jī)操作的偶聯(lián) 進(jìn)一步提高。這使得該檢測(cè)適合于主要指示病例診斷和在持續(xù)疫情中的檢測(cè)。實(shí)時(shí)/定量 RT-PCR試驗(yàn)?zāi)壳霸谠S多發(fā)達(dá)國(guó)家作為一種口蹄疫病毒診斷和定量的常規(guī)測(cè)試。但是，這些 實(shí)驗(yàn)不是專門設(shè)計(jì)用于的區(qū)分口蹄疫病毒血清型。已經(jīng)證明5'端非編碼區(qū)檢測(cè)在A血清 型病毒的檢測(cè)中更敏感，而在3D檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)SAT病毒具有更高的靈敏度（King DP，et al.，2006)。另外，由于探針靶向區(qū)域的核苷酸錯(cuò)配，這些檢測(cè)方法不能檢測(cè)少量的FMDVs。 因此，任何一種單獨(dú)的檢測(cè)方法不能100%的檢測(cè)FMDV。最近，Tam等報(bào)道了用于口蹄疫病 毒檢測(cè)和病毒分型熒光多重rRT-PCR檢測(cè)方法，該方法具有更高的檢測(cè)靈敏度，但卻不能 區(qū)分某些血清型之間的交叉反應(yīng)性（Tam S，et al·，2009)。
[0006] rRT-PCR便攜式設(shè)備使得FMDV野外樣品的檢測(cè)成為可能，然而這種設(shè)備比較昂 貴、比較脆弱且精密度要求比較高。因此，其他的方法，如環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增的方法被用來進(jìn)行野 外樣品的檢測(cè)。LAMP在一個(gè)恒定的溫度擴(kuò)增特異性核苷酸序列，因此不需要熱循環(huán)儀。該 方法基于DNA序列通過一自動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)擴(kuò)增的原理，使用一組兩個(gè)特別設(shè)計(jì)的內(nèi)引 物和兩個(gè)外引物和具有鏈置換高活性的DNA聚合酶進(jìn)行該測(cè)定法et al.，2000)。引物在初 始階段識(shí)別6個(gè)獨(dú)立的靶序列和在LAMP反應(yīng)的后期階段識(shí)別4個(gè)獨(dú)立的序列，使用標(biāo)準(zhǔn)的 水浴或加熱塊進(jìn)行該反應(yīng)少于一個(gè)小時(shí)，然后對(duì)結(jié)果用肉眼進(jìn)行可視化觀察。其優(yōu)點(diǎn)為其 簡(jiǎn)單操作，反應(yīng)快速且結(jié)果直觀，這使得該方法已被許多疾病流行國(guó)家進(jìn)行野外樣品檢測(cè)。 已有口蹄疫病毒高通量的RT-LAMP的建立，然而該方法由于容易污染造成假陽性，就尚未 得廣范的認(rèn)可（Dukes JP, et al·，2006)。
[0007] ELISA和RT-PCR結(jié)合的口蹄疫檢測(cè)方法具有很高的可靠性和準(zhǔn)確性，但樣品從采 樣點(diǎn)到實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)輸問題成為口蹄疫病毒早期診斷的最大障礙。因此，在疑似疫情點(diǎn)急需 一種可以用于疾病快速診斷和特異性檢測(cè)的方法。由Reid等人建立一種基于單克隆抗體 的口蹄疫層析試紙條技術(shù)（Reid SM，et al·，2001)。該試紙條檢測(cè)上皮懸浮液測(cè)試中的口 蹄疫病毒抗原靈敏性與常規(guī)抗原ELISA靈敏性一樣，且對(duì)口蹄疫病毒血清型0、A、C和Asia 1在細(xì)胞培養(yǎng)上清有著100%等效的敏感性，但是卻不能夠?qū)@些血清型進(jìn)行區(qū)分。因此， 急需一種靈敏度高的能夠特異性區(qū)分不同F(xiàn)MDV型別的高通量的檢測(cè)方法。
[0008] 研究表明，口蹄疫病毒的A、0、Asia 1三種血清型的RNA序列同源性約為7〇%左 右，然而其編碼結(jié)構(gòu)蛋白的P1區(qū)域的差異比較好，該區(qū)域的核苷酸序列也常常被用來進(jìn)行 口蹄疫病毒的分型及進(jìn)化分析。在病毒的這些基因中，VP1蛋白參與病毒的吸附、入侵、免 疫反應(yīng)，并且與病毒的血清型特異性有關(guān)。因此VP1的基因序列通常被用來進(jìn)行FMDV不同 毒株之間的親緣關(guān)系分析，從而研究口蹄疫的分子流行病學(xué)規(guī)律。準(zhǔn)確鑒定分離株種屬和 弄清其來源將有助于口蹄疫的流行病學(xué)分析，具有重要意義。根據(jù)口蹄疫病毒VP1基因組 序列構(gòu)建進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，A型有10個(gè)亞型（I - X);〇型也有10個(gè)亞型，即歐洲-南美洲 型（Euro-SA)、中東-南非型（ME-SA)、東南亞型（SEA)、中國(guó)型（CHY)、西非型（WA)、東非1型 (EA-1)、東非 2 型（EA-2)、東非 3 型（EA-3)、印尼 1 型（ISA-1)和印尼 2 型（ISA-2);Asia 1 有6個(gè)亞型（I -VI)。此外，VP1基因也常被用來進(jìn)行A、0、Asia 1的分型檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不能分型、靈敏度低及耗時(shí)長(zhǎng)等不足的用于檢測(cè) 口蹄疫〇型病毒的檢測(cè)試劑盒。
[0010] 本發(fā)明的用于檢測(cè)口蹄疫0型病毒的引物基因序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、 SEQ ID Νο·3、和 SEQ ID No. 4。
[0011] 本發(fā)明的一種口蹄疫〇型病毒的檢測(cè)試劑盒中包括有四條用于GeXP多重基因分 析系統(tǒng)的擴(kuò)增引物 SEQ ID No. 1、SEQ ID No.2、SEQ ID Νο·3、和 SEQ ID No. 4,其中 SEQ ID No. 3的5'端添加有Cy5熒光標(biāo)簽。
[0012] 本發(fā)明的試劑盒非疾病診斷目的的使用方法是以被檢樣品的RNA為模板，用、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、和SEQ ID No. 4引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，根據(jù) 毛細(xì)管電泳信號(hào)分析圖中280bp處是否出現(xiàn)峰值，且信號(hào)大于2000時(shí)判定被檢樣品的陰陽 性。
[0013] GeXP 多重基因分析系統(tǒng)（GeXP Genetic Analysis System)是美國(guó) Beckman Coulter公司研發(fā)的用于多基因表達(dá)定量分析的平臺(tái)。該系統(tǒng)將毛細(xì)管電泳分離技術(shù)和 高靈敏的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)相結(jié)合，使基因表達(dá)定量分析實(shí)現(xiàn)了更高的靈敏度和更快的速 度。該系統(tǒng)以mRNA為模版，在同一 PCR反應(yīng)體系中由熒光標(biāo)記的通用引物和特異性嵌合引 物引發(fā)的多種PCR反應(yīng)，隨后經(jīng)毛細(xì)管電泳分離技術(shù)進(jìn)行分析。該方法具有高通量、高準(zhǔn)確 性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，目前已被逐步應(yīng)用于各種疾病病原的檢測(cè)中。在我國(guó)已經(jīng)先后建立了 水泡帶狀皰疹病毒、流感病毒、呼吸道病毒、手足口病以及乳頭瘤病毒的GeXP多重PCR檢測(cè) 體系，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無基于GeXP鑒別診斷口蹄疫病毒試劑盒和檢測(cè)方法的報(bào)道，同樣 單獨(dú)或者聯(lián)合使用可以鑒別檢測(cè)口蹄疫0型病毒的GeXP方法也尚無報(bào)道。
[0014] 相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的序列SEQ ID No. 1 (FMDV-0-F)和SEQ ID No. 2 (FMDV-0-R)可特異性快速擴(kuò)增口蹄疫0型病毒的核酸，通過核酸電泳檢測(cè)到特異性條帶， 但同等條件下不能擴(kuò)增口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫病毒A病毒、水皰性口炎病毒和豬水 泡病病毒的核酸。
[0015] 相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提示本發(fā)明的序列可在制備快速鑒別口蹄疫0型病毒的GeXP診斷試 劑盒中的應(yīng)用，并在口蹄疫病毒流行病學(xué)研究中應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明GeXP多重基因分析系統(tǒng)能夠高通量特異性檢測(cè)口蹄疫0型病毒，其靈敏度 達(dá)到10 2拷貝。所涉及的引物具有很高的特異性和唯一性，其構(gòu)成的試劑盒反應(yīng)體系已經(jīng) 過優(yōu)化和驗(yàn)證。本發(fā)明能夠?qū)谔阋卟《具M(jìn)行高通量的定性、定型和定量檢測(cè)。相比于其 他已存在的方法和試劑盒，本發(fā)明在用于港口檢疫、動(dòng)物流通環(huán)節(jié)檢疫以及實(shí)驗(yàn)室診斷均 很大的優(yōu)勢(shì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的口蹄疫0型病毒引物特異性驗(yàn)證的核酸電泳檢測(cè)結(jié)果。其中口蹄 疫0型病毒引物可以特異性地?cái)U(kuò)增出FMDV-0型的基因組片段，而口蹄疫A型病毒、口蹄疫 Asia 1型病毒、水皰性口炎病毒和豬水泡病病毒均無特異性條帶產(chǎn)生，說明本發(fā)明的口蹄 疫0型病毒的GeXP引物的特異性非常高。
[0018] 圖2為本發(fā)明的口蹄疫0型病毒引物PCR靈敏性驗(yàn)證的核酸電泳檢測(cè)結(jié)果。其中 Μ為DL2000 Marker ; 1為109個(gè)拷貝；2為108個(gè)拷貝；3為107個(gè)拷貝；4為10 6個(gè)拷貝；5 為105個(gè)拷貝；6為104個(gè)拷貝；7為103個(gè)拷貝；8為10 2個(gè)拷貝。由圖可見109?1〇4個(gè)拷貝 的模板均由特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條帶變暗。從圖可以看出本發(fā)明所設(shè) 計(jì)的口蹄疫〇型病毒GeXP引物在58°c條件下PCR反應(yīng)最少可以檢出1〇 4個(gè)拷貝的模板。
[0019] 圖3為本發(fā)明的口蹄疫〇型病毒GeXP引物的GeXP-PCR特異性檢測(cè)結(jié)果。從圖可 以看出本發(fā)明的口蹄疫病毒0型286bp處出現(xiàn)峰值，且信號(hào)大于2000時(shí)認(rèn)為是陽性結(jié)果。 同時(shí)用口蹄疫0型病毒的引物對(duì)口蹄疫A型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、水皰性口炎病毒 和豬水泡病病毒基因組進(jìn)行GeXP反應(yīng)時(shí)沒有任何信號(hào)峰出現(xiàn)，這說明口蹄疫0型病毒的 GeXP引物具有非常好的特異性。
[0020] 圖4至圖7為本發(fā)明的口蹄疫0型病毒GeXP引物的GeXP-PCR靈敏性檢測(cè)結(jié)果， 其中圖 4 為 104copies，圖 5 為 103copies，圖 6 為 102copies，圖 7 為 lOcopies。結(jié)果顯不 104c〇pieS/pL~10 2 copies/AL的模板均可以檢測(cè)到特異性的峰值，隨著模板量的檢測(cè)，峰值 的信號(hào)強(qiáng)度也不斷的減弱，在10 copies/KL時(shí)將檢測(cè)不到特異性的信號(hào)峰值。從圖中可 以看出本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的口蹄疫0型病毒GeXP引物在本發(fā)明檢測(cè)體系中可以檢測(cè)出10 2 copies/^L 的模板。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解說. 1.序列的制備 根據(jù)GeXP引物設(shè)計(jì)要求和NCBI公布的FMDV-0型的基因組，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性 引物，并通過添加通用引物形成特異性嵌合引物，而通用引物序列屬于非生物源性的核苷 酸序列，此外合成通用引物序列，并在上游通用引物的5'端添加 Cy5熒光標(biāo)簽。本發(fā)明的 可特異性擴(kuò)增口蹄疫0型病毒核酸的引物序列為：AGGTGACACTATAGAATAGTGACTGAACTGAACT GCTTTACCGCAT，在本發(fā)明中被命名為 FMDV-0-F ;GTACGACTCACTATAGGGAGACATGTCCTCCTGCAT CTG，在本發(fā)明中被命名為FMDV-0-R。用于本發(fā)明的通用引物：Cy5 AGGTGACACTATAGAATA, 在本發(fā)明中被命名為UWD-F ;GTACGACTCACTATAGGGA，本發(fā)明中被命名為UEV-R。
[0022] 2.病毒基因組提取 單層細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上融合后，接種病毒，WC孵育30min后棄去毒液。加入細(xì)胞維持 液，37°C 5% C02培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞病變（CPE)，待90%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后收毒。將病毒 反復(fù)凍融3次，置_ 2〇°C冰箱保存?zhèn)溆?。使用TaKaRa公司DNA提取試劑盒提取細(xì)胞毒株中 的 RNA。
[0023] 3. FMDV-0引物特異性驗(yàn)證 以提取純化的病毒RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)體系如下： PrimeScript One Step Enzyme Mx 2pL 2x〇ne Step Buffer 25pL FMDV-O-F (20pmoL(L) IpL FMDV-O-R (20μιηο1^) 1 μ? _毒RNA板板 Ιμ? ddH2〇 20μ1 " 總體積 50μ1 反應(yīng)條件如下： 5〇1C反轉(zhuǎn)錄30mi^ 94lCRTase 失活 2min 94?：變性 30s 、 5 S^C 退火.30s ·> 35 cycles 延伸.... lmin ^ 72t：再延伸 lOmin ? 4r m 各取5 μ L的PCR產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并拍 照。檢測(cè)結(jié)果表明，口蹄疫〇型病毒的GeXP引物在58°C的條件下能特異性地?cái)U(kuò)增出FMDV-0 基因組片段，而口蹄疫A型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、水皰性口炎病毒和豬水泡病病毒均 無特異性條帶產(chǎn)生，說明口蹄疫0型病毒的GeXP引物的特異性非常高。
[0024] 4. 口蹄疫0型病毒的GeXP引物單重PCR靈敏性驗(yàn)證 利用NanoDrop ND-1〇〇〇紫外分光光度計(jì)測(cè)定FMDV-0型基因組的濃度，根據(jù)FMDV-0型 基因組的分子量和濃度計(jì)算其相應(yīng)的拷貝數(shù)。對(duì)FMDV-0型基因組進(jìn)行梯度稀釋，各取1 μ L 作為模板，檢測(cè)單重PCR的敏感性，PCR反應(yīng)體系為： PrimeScript One Step Enzyme^fe 2μ? 2.X One Step Buffer 25 μ? fMW-OF ￠20卿€￠1) tpL ,'jE%lE)V-0 R 'C '20μι?〇1 〇 ：ljiL 病毒RNA模板 叫 ddHjO 2〇uL ......i 體積 MuL 反應(yīng)條件如下： 5tfC___ 反轉(zhuǎn)錄 Mt^RTase 失活 2miD 變零： |0s ， 58亡退火 30s 35 cycles 7;P:延伸 Imim J 72t!再延伸 lOmin 保存 各取5 μ L的PCR產(chǎn)物樣品核酸電泳，電泳結(jié)果通過紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并拍 照。檢測(cè)結(jié)果表明，1〇9~1〇4個(gè)拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條 帶變暗。從圖可看出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的口蹄疫 0型病毒的GeXP引物在58°C下，可檢出反應(yīng)體 系中104個(gè)拷貝的模板。
[0025] 5. 口蹄疫0型病毒GeXP-PCR的特異性檢測(cè) 根據(jù)Beckman Coulter公司的GenomeLab片段分析策略，建立25 μ L的PCR反應(yīng)體系，

【權(quán)利要求】
1. 用于檢測(cè)口蹄疫0型病毒的引物，其特征在于引物基因序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、和 SEQ ID No. 4。
2. -種口蹄疫0型病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于試劑盒中包括有四條用于GeXP多重 基因分析系統(tǒng)的擴(kuò)增引物SEQIDNo·l、SEQIDNo·2、SEQIDNo·3、和SEQIDNo·4，其中 SEQ ID No. 3的5'端添加有Cy5熒光標(biāo)簽。
3. 權(quán)利要求2所述試劑盒非疾病診斷目的的使用方法，其特征在于以被檢樣品的RNA 為模板，用 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、和 SEQ ID No. 4 引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，根據(jù)毛細(xì)管電泳信號(hào)分析圖中286bp處是否出現(xiàn)峰值，且信號(hào) 大于2000時(shí)判定被檢樣品的陰陽性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104232794SQ201410467843
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】張強(qiáng), 盧昌, 趙志荀, 吳國(guó)華, 顏新敏, 李應(yīng)國(guó), 岳華, 周曉黎, 李健, 朱海霞, 代雪玲, 田波, 蘆曉立, 高順平, 王曼 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所