專利名稱：A、o和c型口蹄疫病毒的試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對牛和豬以及相關(guān)牛和豬的產(chǎn)品是否感染特定的傳染病進(jìn)行檢測的試劑盒，以及這種試劑 盒的使用方法。確切講是本發(fā)明是一種檢測牛和豬以及相關(guān)牛和豬的產(chǎn)品是否感染A、0或C型口蹄疫病毒的試劑盒，以及這種試劑盒的使用方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是一種由口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus,FMDV)引起的危害牛、羊等偶蹄動(dòng)物的嚴(yán)重的急性熱性高度接觸性傳染病。由于其傳播速度快，不易控制和消滅，嚴(yán)重危害世界動(dòng)物貿(mào)易，被世界衛(wèi)生組織列為必須上報(bào)傳染病之一。口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科(picornaviridas)中的口蹄疫病毒屬(aphthavirus)。共包括 A、C、O、Asia I、SAT I、SAT II 及 SAT III 型 7 個(gè)血清型，各血清型之間無交叉保護(hù)力。FMDV的病毒粒子直徑20-25nm，為正二十面體結(jié)構(gòu)，近似圓形；基因組為全長8500(nt)的正鏈RNA,包括一個(gè)開放閱讀框(open reading frame, 0RF),5’ -非編碼區(qū)(5，-Untraslated Region, 5，-UTR)和 3，-非編碼區(qū)(3，-Untraslated Region,3’-UTR) ;0RF編碼病毒多聚蛋白，依賴于自身編碼的蛋白酶(L、2A、3C)及少數(shù)的宿主因子，在經(jīng)過3級裂解后，形成4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP4、VP2、VP3和VPl)和9種非結(jié)構(gòu)蛋白(Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D);四種結(jié)構(gòu)蛋白各60分子構(gòu)成病毒顆粒，VPl靠近由五個(gè)原粒組成病毒表面的小洞，VP2和VP3位于遠(yuǎn)端，VP4則完全位于衣殼里面。盡管目前國內(nèi)外對口蹄疫的病原學(xué)、血清分型、診斷做了大量的研究，但口蹄疫病毒幾乎遍及世界各地，口蹄疫對偶蹄類經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的威脅眾所周知，它的發(fā)病率和造成的經(jīng)濟(jì)至今仍為各類傳染病之首。2004年，臺(tái)灣爆發(fā)的口蹄疫導(dǎo)致了 600萬頭豬被屠宰，直接和間接經(jīng)濟(jì)損失到120億美元。在畜牧獸醫(yī)方面，它也威脅著多種家畜和很多野生動(dòng)物的繁衍和生存。0型和A型口蹄疫基本呈世界性分布，Asia I在我國曾經(jīng)流行，到目前已經(jīng)60年沒有發(fā)生，科研人員傾向于其可能已經(jīng)在中國滅絕，SAT I、SAT II及SAT III型主要存在于非洲，C型口蹄疫流行范圍相對較小，但對我國威脅較大。由于口蹄疫血清亞型眾多，毒力相差很大，所以在臨床癥狀差別較大。尤其口蹄疫與豬水泡病、水泡性口炎等類似癥狀的病毒，在臨床上很難區(qū)分，而且臨床癥狀和病理變化因感染動(dòng)物的種類、年齡、病程長短及感染毒株毒力等不同而有所差別，可能缺乏特征病癥，這給口蹄疫的診斷和防治帶來極大困難。因此，單靠臨床診斷難以定性。快速簡單的實(shí)驗(yàn)室診斷方法是確診口蹄疫唯一有效地途徑。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，口蹄疫診斷技術(shù)的研究不斷取得新的進(jìn)展，為口蹄疫病毒核酸序列分析創(chuàng)造了條件。為了確定口蹄疫是否在某一地區(qū)存在，檢測動(dòng)物血清抗體的方法并非完全可靠，還必須通過通過病原學(xué)檢測以確診病原的存在，一般檢測方法為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、血清型診斷技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等診斷技術(shù)，但是這些方法有的敏感性不高、有的特異性不強(qiáng)、有的檢出率較低，即使病毒分離技術(shù)被認(rèn)為是檢測口蹄疫的金標(biāo)準(zhǔn)，但其確認(rèn)結(jié)果至少需要7天，檢測周期太長，并且這些技術(shù)普遍費(fèi)用太高，存在二次散毒的隱患，一般基層很難開展此項(xiàng)工作。同時(shí)，O型和A型口蹄疫近年在我國流行比較普遍，而C型口蹄疫在我國周邊亞洲地區(qū)具有流行史，因此建立一種快速診斷C型、O型和A型口蹄疫的診斷技術(shù)，完成對O型和A型口蹄疫的快速診斷以及對C型口蹄疫病毒進(jìn)行監(jiān)控，防止其傳入我國具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種快速、簡便、靈敏和經(jīng)濟(jì)的檢測試劑盒及使用方法，且這種方法用于檢測臨床樣品時(shí)，可以區(qū)分動(dòng)物所感染的是A、0和C型口蹄疫病毒。本發(fā)明的試劑盒中至少有三對引物組成，其中的兩對引物分別是第一對引物是用于擴(kuò)增A型口蹄疫目的基因的引物，其中上游引物5-CATCTA CGA GGC TGT CAA G-3下游引物5-TAGGGT GGA AAC CGA ACT-3第二對引物是用于擴(kuò)增C型口蹄疫目的基因的引物，其中上游引物5-GAACTA CGG AGG CGA GAC G-3下游引物5-TGGTGC GGT GTA TGG GAG-3第三對引物是用于擴(kuò)增0型口蹄疫目的基因的引物，其中上游引物5-GACCATACAGGAGAAGTT-3下游引物5-CCCATCGCAGGTAAAGTG-3 本發(fā)明中所使用的其他試劑可以從市場中直接購置。本發(fā)明的方法從待檢動(dòng)物的器官拭子或OP液或血液或病死動(dòng)物的組織中提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以試劑盒中的特異性A、0和C型口蹄疫的引物進(jìn)行多重RT-PCR，對得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳圖譜分析被檢動(dòng)物是否感染有A、0和C型口蹄疫病毒。本發(fā)明中從待檢動(dòng)物的器官拭子或OP液或血液或病死動(dòng)物的組織，用生理鹽水稀釋或研磨成I : 5的乳懸液，全基因組RNA提取的方法采用Trizol法。本發(fā)明較經(jīng)典的病毒分離、單RT-PCR和血清型分型方法快捷。本發(fā)明可以相當(dāng)方便地一次性鑒定出屬于A、0型以及C型口蹄疫哪一種病毒感染，可以及時(shí)快捷的對疫病情況及區(qū)域、環(huán)境做出及時(shí)快捷的反應(yīng)，以最短的時(shí)間做出正確的處理辦法，這對及時(shí)撲滅或阻斷傳染病的傳播具有積極的意義。另外，本發(fā)明采取的提取全基因組RNA提取的Trizol法具有快速、簡單、成本低和所需試劑少的特點(diǎn)，特別適于小樣品的提取。因此，本發(fā)明具有廣泛的市場應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明與標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行的特異性檢測的電泳圖，從左至右依次為M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL-2000 (marker 條帶的大小依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)；泳道I為A、0型和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測結(jié)果；泳道2為0型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)樣品RT-PCR檢測結(jié)果；泳道3為C型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)樣品RT-PCR檢測結(jié)果；泳道4為A型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)樣品RT-PCR檢測結(jié)果；泳道5為陰性對照。圖2為臨床樣品評估的電泳圖。從左至右依次為M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000 (marker 條帶的大小依次為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp);泳道1 為
建立的A、0和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測水泡性口炎病毒的結(jié)果；泳道3為建立的A、0和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測豬水泡病病毒的結(jié)果；泳道4為建立的A、0和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測Asial型口蹄疫病毒的結(jié)果；泳道5陰性對照；泳道6為建立的A、O和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測A、O和C型口蹄疫病毒的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例及對比檢測情況。實(shí)施例〈一〉A(chǔ)、0和C型口蹄疫多重RT-PCR檢測試劑盒的使用方法1A、0和C型口蹄疫的核酸提取 無菌采集待檢動(dòng)物的器官拭子或OP液或血液或病死動(dòng)物的組織，制成I : 5的乳懸液，用Trozol法提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以試劑盒中的特異性A、0和C型口蹄疫的引物進(jìn)行多重RT-PCR，對得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳圖譜分析被檢動(dòng)物是否感染有A、0和C型口蹄疫病毒。2 多重 RT-PCR 反應(yīng)本試劑盒參照Genbank登錄的A、0和C型口蹄疫編碼區(qū)基因的序列，設(shè)計(jì)并合成三對引物。引物序列見如下表I:表I本試劑盒涉及多重RT-PCR擴(kuò)增的引物及片段的大小
靶基因引物名稱引物序列產(chǎn)物長度
A 型 FMDVA 型上游5-CAT CTA CGA GGC TGT CAA G-3518bp
A 型下游5-TAG GGT GGA AAC CGA ACT-3
O 型 FMDVO 型上游5-GACCATACAGGAGAAGTT-3136bp
O 型下游5-CCCATCGCAGGTAAAGTG-3
C 型 FMDVC 上游5- GAA CTA CGG AGG CGA GAC G-3319bp
C 下游5-GAG GGT ATG TGG CGT GGT-3以提取的FMDV的RNA為模板，在50 y L反應(yīng)體系中加入FMDV的RNA各2 y L，10 u mol/L 的上下游引物各 I. 2 ii L，2. 5mmol/L 的 dNTP 2u L,5U Taq 聚合酶(NipponGene), 10 X緩沖液5 y L，加無菌的雙蒸水至50 y L。PCR反應(yīng)程序如下94°C，2min，然后是循環(huán)程序94°C 30s, 55°C lmin，72°C 50s，36個(gè)循環(huán)。最后72延伸lOmin。PCR反應(yīng)在BIOMRTRA擴(kuò)增儀中進(jìn)行。實(shí)施例〈二 >FMDV多重RT-PCR方法的特異性和敏感性試驗(yàn)IFMDV多重RT-PCR的敏感性試驗(yàn)I. 1A、0型和C型FMDV的定量
A、0 型和 C 型 FMDV 提取的病毒 RNAl 2、I 4、I 8、I 16 和 I : 32 分別進(jìn)
行稀釋。I. 2結(jié)果檢測PCR產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。然后用溴化乙錠染色，BIO-RAD凝膠成像儀中照相并分析，電泳結(jié)果見圖1，從圖中可以看出A、0型和C型FMDV的多重RT-PCR可以特異的檢出病毒目的基因。2. FMDV多重RT-PCR的特異性試驗(yàn)2. 10型、A型FMDV和豬水泡病病毒的提取和多重RT-PCRT反應(yīng)分別用經(jīng)過RT-PCR鑒定過的0型、A型FMDV和豬水泡病病毒中提取的RNA作為A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR的反應(yīng)模板，以健康豬的血液提取的RNA作為陰性對照模 板。然后程序按照實(shí)施例〈一〉中的A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR體系和條件進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳檢測。 2. 2特異性結(jié)果分析0型、A和C型FMDV與豬水泡病病毒、水泡性口炎病毒等病毒的RT-PCR方法交叉反應(yīng)結(jié)果見圖2。圖中1-4道分別是水泡性口炎病毒、Asia I型FMDV、豬水泡病病毒的核酸和健康豬血清的RNA。從圖中可以看見上述三種病毒與A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR方法無交叉反應(yīng)。健康豬血液中提取的RNA的反應(yīng)結(jié)果也為陰性。上述結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所建立的A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR方法與上述三種在臨床癥狀表現(xiàn)相似的病毒無交叉反應(yīng)。3A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR臨床樣品檢測3. I臨床樣品的準(zhǔn)備共包括137份臨床樣品為單個(gè)PCR和ELISA共同診斷為A、0和C型口蹄疫陽性的血清和組織樣品。3. 2多重RT-OCR檢測結(jié)果對上述142個(gè)A、0和C型口蹄疫陽性的臨床樣品用所建立的多重RT-PCR方法檢測，檢測結(jié)果見表2，從表中可以看出，多重RT-RCR方法對142個(gè)A、0和C型口蹄疫為陽性的臨床樣品的檢出率為96. 8 %，總體上與單個(gè)PCR的檢出率基本相同，尤其檢測0型口蹄疫病毒檢出率與單個(gè)PCR相同，檢出率為100%，同時(shí)比ELISA檢出率要高5個(gè)百分點(diǎn)。4 結(jié)論上述試驗(yàn)證明所建立的A、0和C型口蹄疫的多重PT-PCR方法方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單和操作容易等特點(diǎn)，適合于實(shí)驗(yàn)室和臨床對A、0和C型口蹄疫的快速診斷。表2多重PCR檢測方法的敏感性比較
權(quán)利要求
1.一種用于檢測A、0和C型口蹄疫病毒的試劑盒，其特征是試劑盒至少有三對引物組成，其中的三對引物分別是 第一對引物是用于擴(kuò)增A型口蹄疫目的基因的引物，其中 上游引物5-CAT CTA CGA GGC TGT CAA G-3 下游引物5-TAG GGT GGA AAC CGA ACT-3 第二對引物是用于擴(kuò)增C型口蹄疫目的基因的引物，其中 上游引物5-GAA CTA CGG AGG CGA GAC G-3 下游引物5-TGG TGC GGT GTA TGG GAG-3 第三對引物是用于擴(kuò)增O型口蹄疫目的基因的引物，其中 上游引物5-GACCATACAGGAGAAGTT-3 下游引物5-CCCATCGCAGGTAAAGTG-3。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測牛和豬以及相關(guān)牛和豬的產(chǎn)品是否感染A、O或C型口蹄疫病毒的試劑盒，以及這種試劑盒的使用方法。本發(fā)明的試劑盒中至少有三對用于擴(kuò)增A型口蹄疫目的基因的引物、擴(kuò)增C型口蹄疫目的基因的引物和用于擴(kuò)增O型口蹄疫目的基因的引物組成。
文檔編號C12Q1/70GK102703607SQ20121015697
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者丁耀忠, 劉永生, 周建華, 張 杰, 陳豪泰, 馬麗娜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所