專利名稱：突變aox1啟動(dòng)子的制作方法
突變A0X1啟動(dòng)子本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年02月23日、申請(qǐng)?zhí)枮?00680005888. 1(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/AT2006/000079)、發(fā)明名稱為“突變AOXl啟動(dòng)子”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及突變巴斯德畢赤酵母AOXl啟動(dòng)子。釀酒酵母(S. cerevisiae)作為真核模式生物和產(chǎn)生體系一直以來(lái)在科學(xué)和生物 技術(shù)使用上占據(jù)重要地位(并且目前仍然占據(jù)重要地位)。上世紀(jì)另一種酵母獲得了很大 的關(guān)注裂殖酵母(fission yeast)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。由于 其只依靠裂殖的繁殖特性，粟酒裂殖酵母作為模式生物獲得了極大的關(guān)注，并且時(shí)至今日 在分子遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方面，它連同釀酒酵母一起是最徹底研究的酵母菌種。在目前 已知的超過(guò)700種不同的酵母菌種里，上述兩種酵母僅能夠?yàn)榧夹g(shù)和科學(xué)應(yīng)用提供有限的 感興趣的特性。自二十世紀(jì)七十年代或八十年代以來(lái)，將越來(lái)越多具有突出特性的酵母菌 種研究用于生物技術(shù)和研究。這些所謂的非常規(guī)酵母(non-conventional yeast ；NCY)或 非酵母屬酵母(non-Saccharomyces yeast)(在這種情況下術(shù)語(yǔ)酵母屬包括酵母粟酒裂殖 酵母)的開(kāi)發(fā)出于幾種理由它們擁有醫(yī)學(xué)重要性如白念珠菌(Candida albicans)或技術(shù) 相關(guān)性(technologicalrelevance)如具有在特殊底物(例如n_烷烴、乳糖)上的生長(zhǎng)能 力的Yarrowialipolytica和乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)。例如大量地研究 最普遍的人真菌病原體白念珠菌以揭示涉及病理的毒力因子的本質(zhì)，因此白念珠菌成為致 病酵母的模式生物。另一組良好建立的NCY是甲基營(yíng)養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵 母(Hansenula polymorpha) (Pichia angusta)，其在重組蛋白產(chǎn)生和過(guò)氧化物酶體生物發(fā) 生的研究方面優(yōu)于釀酒酵母。這些僅是仍然具有技術(shù)或?qū)W術(shù)吸引力的非常規(guī)酵母中最突出 的成員。到目前為止幾個(gè)其它的菌種也是特別感興趣的，而這個(gè)組將在今后幾年迅速地成 長(zhǎng)。糖，自然界中種類最豐富的分子，為所有已知的酵母利用。盡管種與種之間的底物 接受度(acceptance)存在巨大差異(參見(jiàn)表1)，葡糖_6_磷酸或果糖_6_磷酸到丙酮酸 的轉(zhuǎn)化是它們新陳代謝中共同的主題?？傊?，用于糖酵解途徑的酶設(shè)備在不同的酵母之間 存在巨大的變化。雖然釀酒酵母中大多數(shù)酶是，至少是部分地已知并表征的，而在NCY中僅 描述了少數(shù)酶。在一些酵母中糖酵解所需的一些功能通過(guò)幾種基因/酶介導(dǎo)，特別是那些 在新陳代謝控制或調(diào)節(jié)中扮演額外角色和/或處于分支點(diǎn)的基因/酶，如葡糖激酶/己糖 激酶、磷酸果糖激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶。通常，差別調(diào)節(jié)的同工酶說(shuō)明在變化的環(huán)境 先決條件下的不同的功能。一些編碼糖酵解酶的基因是組成性和高表達(dá)的，例如釀酒酵母 PGKl (磷酸甘油酸激酶)或巴斯德畢赤酵母GAP基因(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)，而其它酶 是嚴(yán)格調(diào)節(jié)的如釀酒酵母的ENOl (烯醇化酶)基因。表1 選擇的引起生物技術(shù)方面興趣的具有葡萄糖和果糖以外相關(guān)商業(yè)底物的酵 母
0006]
權(quán)利要求
野生型巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(AOX1)啟動(dòng)子(SEQ ID No.1)的突變巴斯德畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子，其包含Seq ID No.1的核苷酸694至723( 260至 231)中的至少一個(gè)突變用于在去阻抑條件下高表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子還包含SeqID No. 1的核苷酸170 至239 (-784至-719)和/或核苷酸729至763 (-225至-191)的突變和/或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 位點(diǎn)(TFBS)的突變和/或選自下組的至少一個(gè)突變核苷酸170至191 (-784至-763)、核 苷酸 192 至 213 (-762 至-741)、核苷酸 192 至 210 (-762 至-744)、核苷酸 207 至 209 (-747 至-745)、核苷酸214至235 (-740至-719)、核苷酸304至350 (-650至-604)、核苷酸364至 393 (-590 至-561)、核苷酸 434 至 508 (-520 至-446)、核苷酸 509 至 551 (-445 至-403)、核 苷酸 552 至 560 (-402 至-394)、核苷酸 585 至 617 (-369 至-337)、核苷酸 621 至 660 (-333 至-294)、核苷酸 625 至 683 (-329 至-271)、核苷酸 736 至 741 (-218 至-213)、核苷酸 737 至 738 (-217 至-216)、核苷酸 726 至 755 (-228 至-199)、核苷酸 784 至 800 (-170 至-154 或核苷酸823至861 (-131至-93)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子，其特征在于所述突變是缺失、取代、插入和/或倒位。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的啟動(dòng)子，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)選自下 組Hapl、Hsf、Hap234、abaA、Stre、Rapl、Adrl、MatIMC、Gcrl 和 QA-1F，其中所述轉(zhuǎn)錄因子 結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)Hapl優(yōu)選包含Seq ID No. 1的核苷酸54至58，Hsf包含Seq ID No. 1的 核苷酸142至149和517至524，Hap234包含Seq ID No. 1的核苷酸196至200、206至210 和 668 至 672，abaA 包含 Seq ID No. 1 的核苷酸 219 至 224，Stre 包含 Seq ID No. 1 的核 苷酸 281 至 285，Rapl 包含 Seq ID No. 1 的核苷酸 335 至 339，Adrl 包含 Seq ID No. 1 的 核苷酸 371 至 377，Mat IMC 包含 Seq ID No. 1 的核苷酸 683 至 687，Gcrl 包含 Seq ID No. 1 的核苷酸702至706和QA-IF包含Seq ID No. 1的核苷酸747至761。
5.核酸分子，包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的突變巴斯德畢赤酵母醇氧化 酶I(AOXl)啟動(dòng)子和編碼蛋白質(zhì)(肽)或功能性核酸的至少一個(gè)核酸，其特征在于所述啟 動(dòng)子和所述核酸可操作地連接在一起形成單或多拷貝表達(dá)盒。
6.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1(AOXl) 啟動(dòng)子或根據(jù)權(quán)利要求5的核酸分子。
7.細(xì)胞，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶 1 (AOXl)啟動(dòng)子、至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求5的核酸分子或至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求6的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，特別是酵母細(xì)胞，優(yōu)選甲 基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞，優(yōu)選選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬，特別是 巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
9.用于表達(dá)所選蛋白的試劑盒，所述試劑盒包含i)根據(jù)權(quán)利要求6的載體，和 )能夠在根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的啟動(dòng)子控制下表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑盒，其特征在于所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì) 胞，優(yōu)選選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬，特別是巴斯德畢赤酵 母細(xì)胞。
11.用于在細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白、肽或功能性核酸的方法，所述方法包括以下步驟-提供根據(jù)權(quán)利要求5的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求6的載體，所述核酸分子和載體包含 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的醇氧化酶1啟動(dòng)子和編碼蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的核酸，將 所述啟動(dòng)子與所述核酸可操作地連接，-將所述細(xì)胞用所述載體或所述核酸分子轉(zhuǎn)化，-在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，-任選地誘導(dǎo)所述蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的表達(dá)和-分離所述表達(dá)的蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì) 胞，優(yōu)選選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬，特別是巴斯德畢赤酵 母細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求5的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求6的載體或根據(jù)權(quán)利要求7或8任一項(xiàng) 的細(xì)胞用于表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或功能性核酸的用途。
14.用于分離超表達(dá)克隆的方法，所述方法包括以下步驟a)將包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的突變巴斯德畢赤酵母醇氧化酶 1 (AOXl)啟動(dòng)子和至少一個(gè)編碼蛋白質(zhì)(肽)或功能性核酸的核酸和標(biāo)記抗性基因的核酸 分子或包含所述核酸分子的載體引入細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子和所述核酸可操作地連接在一 起形成單或多拷貝表達(dá)盒，b)將步驟a)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含合適的選擇標(biāo)記、無(wú)甲醇的非阻抑 碳源，用于在去阻抑條件下超表達(dá)克隆的選擇性生長(zhǎng)，c)在所述培養(yǎng)基上培育來(lái)自步驟b)的細(xì)胞，d)分離獲得自步驟c)的細(xì)胞的菌落，和e)通過(guò)測(cè)定所述細(xì)胞的表達(dá)率檢測(cè)超表達(dá)克隆。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于選擇標(biāo)記是抗生素，優(yōu)選Zeocin或遺傳霉素。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其特征在于選擇標(biāo)記是Zeocin，并且標(biāo)記抗性基因 是sh ble基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選甲 基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞，優(yōu)選選自下組念珠菌屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬，特別是 巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至17中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述非阻抑碳源選自下組丙 氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖、乳糖和它們的組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求11至18任一項(xiàng)的方法，其特征在于將核酸分子或載體通過(guò)轉(zhuǎn)化，優(yōu) 選電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)化，或通過(guò)原生質(zhì)體融合，或通過(guò)粒子轟擊來(lái)引入細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變AOX1啟動(dòng)子，具體地，本發(fā)明涉及野生型巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)醇氧化酶1(AOX1)啟動(dòng)子(SEQ ID No.1)的突變巴斯德畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子包含選自下組的至少一種突變a)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)，b)Seq ID No.1的核苷酸170至235(-784至-719)、核苷酸170至191(-784至-763)、核苷酸192至213(-762至-741)、核苷酸192至210(-762至-744)、核苷酸207至209(-747至-745)、核苷酸214至235(-740至-719)、核苷酸304至350(-650至-604)、核苷酸364至393(-590至-561)、核苷酸434至508(-520至-446)、核苷酸509至551(-445至-403)、核苷酸552至560(-402至-394)、核苷酸585至617(-369至-337)、核苷酸621至660(-333至-294)、核苷酸625至683(-329至-271)、核苷酸736至741(-218至-213)、核苷酸737至738(-217至-216)、核苷酸726至755(-228至-199)、核苷酸784至800(-170至-154)或核苷酸823至861(-131至-93)，和它們的組合。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101935657SQ201010173878
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2006年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者安東·格利德, 弗朗茲·哈特納 申請(qǐng)人:格拉茨科技大學(xué);Vtu控股有限責(zé)任公司