專利名稱：改進(jìn)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用，尤其是那些對其進(jìn)行了改進(jìn)以在轉(zhuǎn)化株構(gòu)建過程中不進(jìn)行甲基化的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在構(gòu)建所需的轉(zhuǎn)化株植物時(shí)，一個(gè)重要因素是高表達(dá)的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子序列是決定基因在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平的主要因素，因此一般選用具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子序列來增強(qiáng)靶外源基因的表達(dá)水平。此外，由于通過增強(qiáng)標(biāo)記基因表達(dá)水平來獲得轉(zhuǎn)化株植物變的相當(dāng)容易，所以，高表達(dá)啟動(dòng)子在表達(dá)藥物抗性基因以生產(chǎn)轉(zhuǎn)化株植物過程中也是很重要的。
在這種情況下，已經(jīng)有很多報(bào)道說在植物中獲得了高表達(dá)啟動(dòng)子。典型的啟動(dòng)子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動(dòng)子，以及土壤桿菌屬細(xì)菌異戊烯轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因和胭脂堿合成酶基因(nos)的啟動(dòng)子。此外，人們也觀察到一些情況，其中包括從一個(gè)作為轉(zhuǎn)化株宿主對象的植物的基因組中獲得了高表達(dá)基因啟動(dòng)子，并對它進(jìn)行了利用(Genschik et al.，Gene，148(1994)195-202)。最近幾年，已經(jīng)證明從結(jié)合了多種啟動(dòng)子的嵌合啟動(dòng)子中可獲得具有顯著提高的啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子。利如，Min Ni等證明通過將土壤桿菌屬細(xì)菌章魚堿合成酶(ocs)基因啟動(dòng)子和甘露堿(man)合成酶基因啟動(dòng)子進(jìn)行結(jié)合就可獲得在煙草中表現(xiàn)高表達(dá)的啟動(dòng)子(Plant Joumal，7(1995)661-676)。
然而，即使使用這些高表達(dá)啟動(dòng)子，也不一定能在各種植物中獲得具有所需的外源基因表達(dá)水平的植物。原因之一可能是特異性的存在，而這種特異性是建立在每種植物細(xì)胞中存在的RNA聚合酶的差異基礎(chǔ)之上的。此外，據(jù)推測，另一個(gè)原因是植物具有一種抑制外源基因表達(dá)的機(jī)制。在這種基因失活或表達(dá)抑制機(jī)制中基因組中的胞嘧啶甲基化被看作其中的一個(gè)重要因素。(Meyer and Saedler，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，47(1996)23-48)。
已經(jīng)知道這種胞嘧啶甲基化較為顯著的發(fā)生在雙鏈DNA序列中，而這個(gè)雙鏈DNA序列中的CG和CNG(N代表任一核苷酸序列)核苷酸序列形成回文結(jié)構(gòu)(Matzke and Matzke，Plant Physiol.107(1995)679-685)。已經(jīng)知道，甲基化甚至也發(fā)生在其他DNA序列的胞嘧啶中(Meyer et al.，EMBO loumal，13(1994)2084-2088)。當(dāng)胞嘧啶甲基化后，許多生物體中的基因表達(dá)就受到了抑制(Razin、EMBO lournal，17(1998)4905-4908)。此外，因?yàn)榕c其他生物體相比較，植物體基因組中甲基化胞嘧啶的比率要高，所以有報(bào)道說甲基化與基因失活有著密切的聯(lián)系(Meyer and Saedler，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，47(1996)23-48)。尤其是對于通過基因操作等手段導(dǎo)入的外源基因抑制現(xiàn)象，也就是“基因沉默”的原因來講，DNA甲基化導(dǎo)致的基因失活可能是其中之一。
然而，到目前為止沒有報(bào)道說對啟動(dòng)子的甲基化進(jìn)行控制能提高基因表達(dá)。只有一個(gè)關(guān)于通過體外強(qiáng)制性甲基化使一個(gè)基因構(gòu)建物出現(xiàn)基因表達(dá)瞬時(shí)下降的報(bào)道，其中的這個(gè)基因構(gòu)建物是通過將CaMV 35S啟動(dòng)子連接到β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)基因上制備得到的(Hohn et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，93(1996)8334-8339)。然而，在上述報(bào)道的試驗(yàn)中并沒有證實(shí)體內(nèi)哪個(gè)核苷酸序列遭到了甲基化，以及甲基化結(jié)果是否導(dǎo)致了表達(dá)下降。此外，Hohn等觀察到不僅是啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致Gus基因表達(dá)的下降，結(jié)構(gòu)基因部分的甲基化也導(dǎo)致Gus基因表達(dá)的下降，他們得到結(jié)論說使結(jié)構(gòu)基因部分不遭受甲基修飾對高表達(dá)來講是很重要的。因此，他們并不贊同通過去甲基化啟動(dòng)子來獲得高基因表達(dá)的觀點(diǎn)。
因此，沒有已知的特定方法可通過避免啟動(dòng)子甲基化來提高基因表達(dá)水平。在上述情況下，為了利用避免甲基化的方法來獲得較高表達(dá)的轉(zhuǎn)化株宿主，需將啟動(dòng)子部分或包含有啟動(dòng)子部分的DNA鏈中的哪個(gè)CG或CNG序列特異性修飾成其他何種核苷酸也是未知的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一個(gè)啟動(dòng)子，當(dāng)將其安插到結(jié)構(gòu)基因的5′端時(shí)就能夠活化結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含這個(gè)啟動(dòng)子的DNA鏈。另外，本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供利用DNA鏈轉(zhuǎn)化過的宿主以及利用宿主進(jìn)行的結(jié)構(gòu)基因的高表達(dá)方法。
鑒于以上提到的種種問題，發(fā)明者們想到可以在不損失啟動(dòng)子活性的前提下，通過對由啟動(dòng)子DNA雙鏈中的CG和CNG組成的DNA回文序列進(jìn)行修飾，使之成為不含有CG和CNG序列的其他核苷酸，這樣進(jìn)行甲基化作用的可能性就很小。在這個(gè)觀點(diǎn)基礎(chǔ)之上，大量研究的結(jié)果是發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)通過將一個(gè)新設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子連接到一個(gè)組成元件如翻譯增強(qiáng)子、結(jié)構(gòu)(報(bào)告)基因、翻譯終止密碼子和終止子之上，并利用這個(gè)啟動(dòng)子來轉(zhuǎn)化菊科(Chrysanthemum)植物，菊科植物中的外源基因的表達(dá)水平就能得到顯著提高。利用這一發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
因而，本發(fā)明提供了下面(a)或(b)表示的DNA
(a)包含有由SEQ ID NO1中第7到272個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(b)包含有由SEQ ID NO1中第7到272個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
此外，本發(fā)明提供了下面(c)或(d)表示的DNA(c)包含有由SEQ ID NO1所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(d)包含有由SEQ ID NO1所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
此外，本發(fā)明提供了下面(e)或(f)表示的DNA(e)包含有由SEQ ID NO2中第7到272個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(f)包含有由SEQ ID NO2中第7到272個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列(此處核苷酸NO.185到186和197到198是單個(gè)CG)。
此外，本發(fā)明提供了下面(g)或(h)表示的DNA(g)包含有由SEQ ID NO2所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(h)包含有由SEQ ID NO2所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列(此處核苷酸NO.185到186和197到198是單個(gè)CG)。
此外，本發(fā)明提供了下面(i)或(j)表示的DNA(i)包含有由SEQ ID NO3中第7到322個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(j)包含有由SEQ ID NO3中第7到322個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
此外，本發(fā)明提供了下面(k)或(1)表示的DNA(k)包含有由SEQ ID NO3所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(1)包含有由SEQ ID NO3所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
此外，本發(fā)明提供了下面(m)或(n)表示的DNA(m)包含有由SEQ ID NO4中第7到422個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(n)包含有由SEQ ID NO4中第7到422個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
此外，本發(fā)明提供了下面(o)或(p)表示的DNA(o)包含有由SEQ ID NO4所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(p)包含有由SEQ ID NO4所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
此外，本發(fā)明提供了包含有上述任一DNA的DNA鏈。這樣的DNA鏈優(yōu)選的包含一個(gè)結(jié)構(gòu)基因DNA和上述任一DNA，而上述的DNA是以一種能令其表達(dá)的方式結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因DNA 5′端的。這些DNA鏈可包括選自以下的組成元件翻譯增強(qiáng)子、翻譯終止密碼子、終止子及其組合。另外，本發(fā)明提供了利用上述DNA鏈轉(zhuǎn)化過的宿主。這種宿主優(yōu)選植物細(xì)胞。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了在植物中表達(dá)結(jié)構(gòu)基因的方法，其特征在于可對上述DNA鏈轉(zhuǎn)化后的宿主進(jìn)行培養(yǎng)或培育以保證結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。在這種方法中，結(jié)構(gòu)基因可以是外源基因。此外，本發(fā)明提供了利用上述DNA鏈轉(zhuǎn)化的宿主來生產(chǎn)蛋白的方法，這種蛋白是結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)產(chǎn)物，而這個(gè)外源基因是通過具有啟動(dòng)子活性的DNA來活化其轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)其表達(dá)的。
此外，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化株直物，而這些轉(zhuǎn)化株植物是通過對上述DNA鏈轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞進(jìn)行再生獲得的。
此外，本發(fā)明提供了包含有選擇性標(biāo)記基因DNA和上述任一DNA的DNA鏈，而上述DNA是以一種令選擇性記基因表達(dá)的方式結(jié)合到選擇性標(biāo)記基因DNA5′端的。另外，本發(fā)明提供了選擇轉(zhuǎn)化株宿主的方法，它包括利用DNA鏈轉(zhuǎn)化宿主，以及在特定條件下培養(yǎng)這個(gè)宿主的步驟，在這樣的特定條件下選擇性標(biāo)記基因可進(jìn)行表達(dá)，并且可對其進(jìn)行鑒定來確定宿主表達(dá)了選擇性標(biāo)記基因與否。優(yōu)選的宿主是植物細(xì)胞。
本說明書包括日本專利申請NO.2000-59276的說明書和/或圖表中公開內(nèi)容的部分或全部，日本專利申請NO.2000-59276是本申請的優(yōu)先權(quán)申請。
序列表說明SEQ ID NO14包含啟動(dòng)子序列的合成DNASEQ ID NO5-24引物


圖1A和1B展示了本發(fā)明中的啟動(dòng)子MF-48的DNA序列(圖.1A)和MF-18(圖.1B)的DNA序列(分別是上面的線)，與pBI121的35S啟動(dòng)子DNA序列(下面的線)間的比較。
圖2圖示了質(zhì)粒pKT81(A)、pKT83(B)、pMF-28(C)和pKT11(D)的部分結(jié)構(gòu)。
圖3圖示了質(zhì)粒pMF-48-Gus及其衍生物pMF-48-2和pMF-48-4.
圖4展示了由4種載體轉(zhuǎn)化過的菊科植物葉子中Gus基因平均表達(dá)水平(10種或更多種植物)的相對值，而這些相對值是建立在以pBI121轉(zhuǎn)化過的重組煙草Gus基因的表達(dá)水平為比較之上的。
圖5展示了具有不同Gus基因表達(dá)水平相對值的植物(以pBI121轉(zhuǎn)化過的重組煙草做化較)的分布，而此Gus基因是存在于經(jīng)由3種載體轉(zhuǎn)化過的菊科直物葉子中的。
具體實(shí)施例方式
(1)啟動(dòng)子本發(fā)明中的DNA是包含有SEQ ID NO1-4表示的核苷酸序列或其部分核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA。這些DNA是通過對CaMV35S啟動(dòng)子核苷酸序列中的部分核苷酸進(jìn)行修飾而制備得到的。
從CaMV35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起始的250bp上游區(qū)域內(nèi)含有13個(gè)CG或CNG，據(jù)推測CG甲基化酶或CNG甲基化酶分別對這些核苷酸序列進(jìn)行了甲基化作用。因此，含有由未遭受甲基化作用的序列替代的這些序列的DNA就是包含有SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列的DNA。在SEQ ID NO1中，具有啟動(dòng)子活性的部分是NO.7-272位核苷酸部分。
此外，利用包含有SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列的DNA(啟動(dòng)子)無甲基化這一特性，可對一個(gè)含有大約20個(gè)核苷酸、稱做ocs區(qū)域或as-1區(qū)域的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，這種修飾具有顯著的效用。于是，雖然ocs區(qū)域仍然保留有CG序列，對其進(jìn)行修飾就能形成具有6個(gè)核苷酸(GACGTC)的回文結(jié)構(gòu)，從而得到含有SEQ ID NO2所表示核苷酸序列的DNA。SEQ ID NO2表示的核苷酸序列中具有啟動(dòng)子活性的部分是NO.7-272位核苷酸部分。
對SEQ ID NO1所表示核苷酸序列和SEQ ID NO2所表示核苷酸序列(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游)與包含在pBI121載體(Clontech公司制備)中的35S啟動(dòng)子序列進(jìn)行的比較如圖1A和圖1B所示，其中的pBI121載體是植物基因操作中最常用的載體。
此外，據(jù)認(rèn)為，對ocs區(qū)域進(jìn)行的修飾可用來進(jìn)行啟動(dòng)子中重復(fù)的ocs區(qū)域的合成，并且，據(jù)認(rèn)為這可增強(qiáng)啟動(dòng)子活性。因此，對ocs區(qū)域進(jìn)行重復(fù)使得SEQ IDNO1中有兩個(gè)ocs區(qū)域，從而得到包含有SEQ ID NO3所表示的核苷酸序列的DNA。在SEQ ID NO3中，7-322位核苷酸部分具有啟動(dòng)子活性。進(jìn)一步，在SEQIDNO1中，對ocs區(qū)域進(jìn)行重復(fù)以至其中含有4個(gè)ocs區(qū)域，這樣就得到了含有SEQ ID NO4所表示的核苷酸序列的DNA。SEQ ID NO4中具有啟動(dòng)子活性的是7422位的核苷酸部分。
依照核酸生物合成方法，我們可對上述本發(fā)明中的DNA進(jìn)行化學(xué)合成。
此外，本發(fā)明中的DNA包括具有啟動(dòng)子活性并含有特定核苷酸序列的DNA，相對于上述的任何核苷酸序列，這些特定核苷酸序列中缺失、添加或插入了一到多個(gè)核苷酸。在這里，缺失、添加或插入的核苷酸數(shù)目沒有特別的限制，但優(yōu)選的是一到多個(gè)，更優(yōu)選的是1-3個(gè)，最優(yōu)選的是1個(gè)。此外，本發(fā)明中的DNA可包括具有啟動(dòng)子活性，并包含有與上述任何DNA的核苷酸序列具有80％或更多，優(yōu)選90％或更多，更優(yōu)選94％或更多，以及最優(yōu)選99％或更多同源性的DNA(變體)。此處的這些同源性數(shù)值是通過利用核苷酸序列對比程序DNASIS-macv3.7、使用缺省參數(shù)進(jìn)行計(jì)算得到的。
因此，這些變體包含有與SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列部分不同的核苷酸序列，但在這種情況下卻要求保留上述CaMV 35S啟動(dòng)子的重排位點(diǎn)。換句話說，在SEQ ID NO1中，NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位核苷酸是不變的。同樣的，在SEQ ID NO2中，NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位核苷酸是不變的。此外，在SEQ ID NO3中，NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位核苷酸是不變的。進(jìn)一步，在SEQ ID NO4中，NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位核苷酸是不變的。
此外，上述變體的核苷酸序列要求不含有CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)核苷酸序列，但SEQ ID NO2中，NO.185到186及197到198位核苷酸例外的卻是CG。
只要包含有SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列或其變體的DNA具有啟動(dòng)子活性，其啟動(dòng)子活性水平并沒有特別的限制，但是優(yōu)選的是基本上保留包含有SEQ ID NO14所表示的核苷酸序列的DNA的啟動(dòng)子活性或其部分DNA的啟動(dòng)子活性。在應(yīng)用啟動(dòng)子活性的實(shí)例中，此處的“基本保留這些DNA的啟動(dòng)子活性或其部分DNA的啟動(dòng)子活性”表示在與這些DNA及其部分相同的應(yīng)用條件下幾乎保留有相同的有用活性水平。此外，此處描述的啟動(dòng)子活性優(yōu)選的定義為在植物細(xì)胞中的活性，更優(yōu)選的是在菊科植物細(xì)胞中，最優(yōu)選的是在菊花品種Reagan(chrysanthemum morifolium cv Reagan或chrysanthemum grandiflorum cv Reagan)中。
很明顯，只要是本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員，參考SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列，依照文獻(xiàn)如分子克隆(Sambrook等編.(1989)Cold Spring Harbor Lab.Press，New York)的描述進(jìn)行操作，在篩選和制備這些變體時(shí)就不會有任何特別的困難。此外，依照Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)5662-5666、WO85/00817、Nature316(1985)601-605、Gene 34[198S]315-323、Nucleic Acids Res.13(1985)4431-4442、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)6409-6413、Science 224(1984)I431-1433等所描述的技術(shù)，參照對與上述SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列相關(guān)的核苷酸序列進(jìn)行人工替代、缺失、插入或添加一或多個(gè)核苷酸(突變的位點(diǎn)特異性衍生)的技術(shù)，本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員就可獲得并利用這些變體。
利用下文描述的一種確定啟動(dòng)子活性的方法，我們就可證明上面獲得的變體是否具有啟動(dòng)子活性，并進(jìn)一步確定他們是否基本保留含有SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列的任一DNA的或部分DNA的啟動(dòng)子活性。
可對上述變體的啟動(dòng)子活性進(jìn)行計(jì)算，優(yōu)選的方法是通過制備含有多種報(bào)告基因，如β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)、蟲熒光素酶(Luc)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)、β-半乳糖苷酶(Gal)、胭脂堿合成酶(nos)、章魚堿合成酶(ocs)等的、連接到新穎啟動(dòng)子下游區(qū)域上的載體(″植物基因轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)；試驗(yàn)手冊″，Draper，J.等編輯，Blackwell Scientific Publication，1988)；利用多種常規(guī)的、眾所周知并普遍使用的轉(zhuǎn)化方法(下文有描述)將載體插入植物細(xì)胞基因組中；測定報(bào)告基因的表達(dá)水平；但啟動(dòng)子活性水平的計(jì)算方法不局限于此種。在這種方法的一個(gè)實(shí)例中，報(bào)告基因是Gus，宿主細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性測定是依照(i)組織化學(xué)Gus染色法和/或( )使用熒光底物的方法(這兩種方法可在Gelvin和Schilperoort編著的、Kluwer Academic Publishers出版的植物分子生物學(xué)手冊C2(1994)I-32(版)中查到)進(jìn)行的。此外，蛋白量是依照如Bradford法進(jìn)行測定的(Anal.Biochem 72(1976)248-254)，并將Gus活性轉(zhuǎn)化為單位蛋白量含有的值(例如以pmoleMU/min/mg蛋白來計(jì)算)來確定啟動(dòng)子的活性。
多種植物細(xì)胞如包括水稻、MUGI(小麥、大麥、黑麥和燕麥的通用名)、玉米、洋蔥、百合、蘭花等在內(nèi)的單子葉植物細(xì)胞，以及包括大豆、油菜籽、番茄、馬鈴薯、菊花、玫瑰、康乃馨、牽?；āypsophila、櫻草屬植物等在內(nèi)的雙子葉植物細(xì)胞優(yōu)選的用做本發(fā)明中的DNA的示范性宿主細(xì)胞。尤其優(yōu)選的示范性宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞如具有高染色體多倍體的菊花細(xì)胞。這樣優(yōu)選的原因在于一般認(rèn)為植物可使基因甲基化而導(dǎo)致同源基因失活，由于高多倍體的植物含有多個(gè)同源基因，所以預(yù)期這些基因?qū)欢喾N更強(qiáng)的甲基化機(jī)制失活(Leitch and Bennett，Trendsin Plant Sci.，2(1997)470-476)。化外，由于基因組中含有大量的CG(Thomas andSherratt，Biochem.J.，62(1956)1-4)，所以含有大量甲基化反應(yīng)靶序列的植物細(xì)胞也是優(yōu)選對象。
(2)DNA鏈按照本發(fā)明，此處提供了包含有本發(fā)明中的DNA的DNA鏈。這樣的DNA鏈可用于轉(zhuǎn)錄任何基因，而在對其進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，待轉(zhuǎn)錄DNA是以一種可表達(dá)的形式結(jié)合到這個(gè)DNA鏈中的。代表性基因是結(jié)構(gòu)基因。從而，本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)構(gòu)基因DNA和含有本發(fā)明中的DNA的DNA，而本發(fā)明中的DNA是以利于表達(dá)結(jié)構(gòu)基因DNA的方式結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因的5′端的。
按照本發(fā)明，DNA鏈的特定實(shí)例為，如將本發(fā)明中的DNA作為部分組成元件插入到質(zhì)?；蚴删wDNA中。
當(dāng)將結(jié)構(gòu)基因DNA結(jié)合到這樣的DNA鏈中時(shí)，本發(fā)明中的DNA或結(jié)構(gòu)DNA就進(jìn)行排列以便使結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)。結(jié)構(gòu)基因DNA實(shí)例包括β-葡聚糖elicitor受體(Umemoto et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)1029-1034)、pacl(Sano etal.，Biotechnol.15(1997)1290-1294)及編碼2-SAase or RnaseL的DNA(Ogawa et al，Natl.Biotechnol.14(1996)1566-1569)，但并不局限于此。
本發(fā)明中的DNA鏈可進(jìn)一步包括組成元件如翻譯增強(qiáng)子、翻譯終止密碼子、終止子等。對翻譯增強(qiáng)子、翻譯終止密碼子和終止子來講，可對已知的這些元件進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)合應(yīng)用。源自病毒的翻譯增強(qiáng)子包括煙草花葉病毒序列、紫花苜?；ㄈ~病毒RNA4、bromomosaic病毒RNA3、馬鈴薯病毒X、煙草腐蝕病毒等(Gallie etal.，Nuc.Acids Res.，15(1987)8693-8711)。此外，源自植物的翻譯增強(qiáng)子實(shí)例包括源自大豆S-1，3-葡聚糖酶(Glu)的序列(Isao ISHIDA，Norihiko MISAWA，KodanshaScientific編，″Saibo-kogaku-jikkenn-sousa-nyumon″(細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)論)，Kodansha Ltd.，p.119，1992)，及源自煙草鐵氧還蛋白親和性亞單位的序列(PsaDb)(Yamamoto et al.，J.Biol.Chem.，270(1995)12466-12470)。終止子實(shí)例包括nos基因終止子、ocs基因終止子等(Annu.Rev.Plant Physiol Plant Mol.Biol.，44(1993)985-994，″植物基因轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)；前述的“一種實(shí)驗(yàn)手冊”)。此外，有報(bào)道說通過識別作為啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的35S增強(qiáng)子并將多個(gè)35S增強(qiáng)子相互進(jìn)行串聯(lián)可提高啟動(dòng)子活性。(Plant Cell，1(1989)141-150)。35S增強(qiáng)子可作為DNA鏈的一部分。這多種組成元件優(yōu)選的以可依照其性質(zhì)進(jìn)行作用的方式結(jié)合到DNA鏈中去。本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員可恰當(dāng)?shù)倪M(jìn)行這樣的操作。
本發(fā)明中的DNA(啟動(dòng)子)包括源自大豆Glu基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后的翻譯曾強(qiáng)子(在SEQ ID NO1和2中是NO.279之后的，在SEQ ID NO3中是NO.329之后的，在SEQ ID NO4中是NO.429之后的)。雖然這個(gè)序列與由無甲基化導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)沒有直接聯(lián)系，但它能進(jìn)一步促進(jìn)靶基因的表達(dá)。翻譯增強(qiáng)子并不局限于本發(fā)明中用到的、源自大豆Glu基因的翻譯增強(qiáng)子，但要有相同的預(yù)期效果，甚至在被其他翻譯增強(qiáng)子如上述目前已經(jīng)報(bào)道的增強(qiáng)子替代的情況下也要有相同的效果。此外，在本發(fā)明中，翻譯增強(qiáng)子的CG序列可用其他核苷酸替代。此外，當(dāng)其他翻譯增強(qiáng)子含有CNG序列，而不是CG序列時(shí)，此CNG序列可被其他核苷酸替代，方式與被CG序列替代相同。本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員可恰當(dāng)?shù)倪M(jìn)行這樣的修飾。
應(yīng)用基因工程領(lǐng)域中常用的方法，本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員就可以很容易的制得上述DNA鏈。此外，本發(fā)明中的DNA鏈并不局限于人工構(gòu)建物，只要它具有上述的結(jié)構(gòu)，就能從天然源中分離到?？衫檬熘⒊Ｓ玫暮怂嵘锖铣煞椒ㄍㄟ^合成手段來獲得DNA鏈。
(3)轉(zhuǎn)化包含有本發(fā)明中具有啟動(dòng)子活性的DNA的DNA鏈可對宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，對獲得的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行培育或培養(yǎng)，從而對結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)或?qū)Y(jié)構(gòu)基因進(jìn)行高效表達(dá)。此處的結(jié)構(gòu)基因可以是外源基因。
在進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，本發(fā)明中的DNA鏈就以結(jié)合到質(zhì)粒、噬菌體或基因組DNA中的形式存在于微生物體(尤其是細(xì)菌)、噬菌體顆?；蛑参镏辛恕４颂?，細(xì)菌的典型實(shí)例包括，但并不局限于大腸桿菌、土壤桿菌等。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，本發(fā)明中的DNA鏈?zhǔn)且阅撤N形式存在于植物中，從而本發(fā)明中的DNA(啟動(dòng)子)、翻譯增強(qiáng)子、結(jié)構(gòu)基因DNA、翻譯終止密碼子、終止子等全部連接并結(jié)合到基因組中，這樣那些試圖表達(dá)某種蛋白的結(jié)構(gòu)基因就能穩(wěn)定的在植物中進(jìn)行表達(dá)了。
優(yōu)選的宿主實(shí)例包括單子葉植物細(xì)包如水稻、MUGI(小麥、大麥、黑麥和燕麥的通用名)、玉米、洋蔥、百合、蘭花等的細(xì)胞，以及雙子葉植物細(xì)胞如大豆、油菜籽、番茄、馬鈴薯、菊花、玫瑰、康乃馨、牽?；?、gypsophila、櫻草屬植物等的細(xì)胞，尤其優(yōu)選的實(shí)例是植物細(xì)胞，如菊花等具有高染色體多倍體的植物細(xì)胞。此外，典型的植物部位包括生長點(diǎn)、原始芽、分生組織、葉、莖、根、塊莖、柄、愈傷組織、花藥、花粉、花粉管、花序梗、花葶、花瓣、萼片等。
對于將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞的方法來講，報(bào)道過的和已被接受的多種方法都可作為合適的方法加以選用。優(yōu)選的實(shí)例包括以病毒或土壤桿菌的Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒等作載體的方法，以及利用電穿孔、聚乙二醇、基因槍、微量注射器(″植物基因轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)；前述的“一種實(shí)驗(yàn)室手冊″)、氮化硅晶須、碳化硅晶須(Euphytica85(1995)75-80，In Vitro Cell.Dev Biol.31 101-104，PlantScience 132(1998)31-43)來導(dǎo)入外源基因的物理方法，等等。本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)倪x擇并應(yīng)用這些外源基因?qū)敕椒ā?br> 此外，可通過對植物細(xì)胞進(jìn)行再生的方法來制備能表達(dá)其細(xì)胞中導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)化株植物，而待再生的植物細(xì)胞是已經(jīng)通過本發(fā)明中的DNA鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)化過的。按照已知的、一般的將植物細(xì)胞再生為植物的方法，本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員可很容易的進(jìn)行這樣的操作。對于植物細(xì)胞再生為植物，可參見文獻(xiàn)，如″SHOKUBUTU-SAIBOU BAIYOU MANUAL(植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊)(YasuyukiYamada編，Kodansha Scientific，1984)。
當(dāng)已經(jīng)進(jìn)行過表達(dá)誘導(dǎo)的或已高度表達(dá)的基因產(chǎn)物作為單獨(dú)產(chǎn)物具有所需的用途時(shí)，則可按照依賴于表達(dá)產(chǎn)物的適當(dāng)方法將其從培養(yǎng)物中分離和純化出來。在表達(dá)產(chǎn)物存在的條件下，在宿主細(xì)胞生長并且細(xì)胞特性進(jìn)一步改變時(shí)，對宿主進(jìn)行培養(yǎng)可高度表達(dá)靶結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)產(chǎn)物，或當(dāng)宿主是去分化植物時(shí)，對這些植物進(jìn)行培養(yǎng)也可使靶結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行高度表達(dá)。
此外，利用可表達(dá)如卡那霉素抗性基因(如NPTII)的選擇性標(biāo)記的DNA鏈，本專利所公開的高表達(dá)啟動(dòng)子能顯著提高植物的轉(zhuǎn)化效率。這可通過利用選擇性標(biāo)記基因DNA和包含有上述任一DNA的DNA鏈實(shí)現(xiàn)，而上述任一DNA是以利于表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的形式結(jié)合到選擇性標(biāo)記DNA的5′端的。因此，特定方法沒有細(xì)節(jié)限制，但這種方法可包括如利用DNA鏈轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在能表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的條件下培養(yǎng)制備得到的宿主，以及確定宿主細(xì)胞是否表達(dá)選擇性標(biāo)記基因。宿主可以是其他的植物細(xì)胞，對此沒有特別的限制，但優(yōu)選植物細(xì)胞。在這里，可選用任何選擇性標(biāo)記基因，對其沒有特別的限制，但優(yōu)選抗藥性基因如NPTH基因(卡那霉素抗性基因)，Hygr基因(潮霉素抗性基因)也是可行的。在這種情況下，宿主是否表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的條件的確定是通過將其與含有此基因所耐受的藥物的培養(yǎng)基共培養(yǎng)得到的。當(dāng)NPTII基因用做選擇性標(biāo)記基因時(shí)，選用的藥物可以是卡那霉素(Km)，但并不局限于此，也可有選擇的選用G418或巴龍霉素。此外，應(yīng)用能表達(dá)如潮霉素抗性基因(如Hyg)的選擇性標(biāo)記的DNA鏈也可收到相同的效果。在這種情況下選用的藥物可為潮霉素。
也是在這種情況下，對于通過向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入DNA鏈獲得轉(zhuǎn)化株植物的方法來講，上述的任何方法都可選用。當(dāng)如報(bào)告基因是Gus時(shí)，可通過使用上述(i)組織化學(xué)Gus染色法和/或( )利用熒光底物的方法(植物分子生物學(xué)手冊，C2(1994)1-32，前面有描述)等來確定植物的表達(dá)。
一般來講，在細(xì)胞分化期間，已知基因失活是由甲基化作用引起的。預(yù)期本發(fā)明所公開的啟動(dòng)子不僅能夠?qū)е挛捶只参锛?xì)胞如轉(zhuǎn)化過的愈傷組織中靶基因的高度表達(dá)，也能夠?qū)е轮参锛?xì)胞中靶基因的高表達(dá)。
工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明，利用普遍認(rèn)為對植物如菊花來講是高表達(dá)啟動(dòng)子的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，可提高對結(jié)構(gòu)基因顯示弱表達(dá)的植物的表達(dá)效率。
實(shí)施例下文將參照以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述，但本發(fā)明并不局限于下列實(shí)施例。
制備無甲基化載體在CaMV35S啟動(dòng)子的mRNA(轉(zhuǎn)錄)起始位點(diǎn)上游250bp區(qū)域內(nèi)有13個(gè)CG或CNG，據(jù)推測CG甲基化酶或CNG甲基化酶已分別對這些核苷酸序列進(jìn)行了甲基化作用。因此，利用沒有遭受甲基化的序列替代這些序列，在這個(gè)區(qū)域就合成了一個(gè)DNA。(MF-48SEQ ID NO1)。對于認(rèn)為能產(chǎn)生很大影響，尤其是對轉(zhuǎn)錄活性具有很大影響的ocs區(qū)域，雖然保留了其中的CG序列，卻可以通過對其進(jìn)行修飾來制備DNA以獲得6個(gè)核苷酸的回文結(jié)構(gòu)(GACGTC)。(MF-18SEQ IDNO2)。對MF-48和MF-18序列(轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游區(qū)域)和包含在pBI121載體中的35S啟動(dòng)子序列進(jìn)行的比較如圖1A和1B所示，而pBI121載體是植物基因操作中最常用的載體。
除上述外，已經(jīng)修飾過的、具有35S啟動(dòng)子甲基化靶位點(diǎn)的基因(質(zhì)粒名為pSan9Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)8334-8339，前面有描述)是從Friedrich.Miescher-Institut(Switzerland)的Dr.Hohn處轉(zhuǎn)讓過來的。此基因由mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約250個(gè)核苷酸對的啟動(dòng)子部分、其下游CaMV35S基因的大約50個(gè)核苷酸對的5′非翻譯序列(下文啟動(dòng)子部分與5′非翻譯序列的結(jié)合可參照“MF-28”)、其遠(yuǎn)下游包含Gus結(jié)構(gòu)(報(bào)告)基因的Gus基因表達(dá)箱以及一個(gè)35S終止子組成。
制備含有無甲基化啟動(dòng)子的載體為了確定上述在轉(zhuǎn)化株植物中制備的MF-48、MF-18和MF-28的效用，構(gòu)建了表達(dá)載體。下面的表達(dá)載體全部由Gus基因的表達(dá)單位和存在于側(cè)面與邊緣序列相連以便進(jìn)行反方向轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中的NPTII基因組成的。對這些表達(dá)箱來說，基本的載體是可由土壤桿菌和大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增的二元載體pKT11，將Gus基因啟動(dòng)子和NPTII基因取代，就構(gòu)建了pKT81、pKT83和pMF-28。
二元載體pKT11的組成包括土壤桿菌A281的RB區(qū)域大約250bp的XhoI-EcoRI部分、作為Gus基因表達(dá)單位部分大約3.5kbp的HindIII-EcoRI部分(從5端開始連接，依次是一個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子、一個(gè)煙草PsaDb的翻譯增強(qiáng)子、一個(gè)含有蓖麻過氧化物酶基因內(nèi)含子的Gus基因以及一個(gè)nos基因終止子)、NPTII基因表達(dá)單位部分大約1.7kbp的HindIII-KpnI部分(植物中通過nos基因啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)進(jìn)行作用的NPTII基因終止子和nos基因終止子)、左側(cè)邊緣區(qū)域與pBI121相連的大約5.5kbp的KpnI-XhoI部分以及土壤桿菌和大腸桿菌擴(kuò)增的復(fù)制原點(diǎn)。此外，二元載體pKT11中的Gus基因是由一個(gè)與大豆衍生的Glu基因翻譯增強(qiáng)子相連的啟動(dòng)子表達(dá)的(圖2D)。
利用瓊脂糖凝膠對實(shí)施例1中制備的DNA片段(啟動(dòng)子)進(jìn)行純化，質(zhì)粒pKTll的35S啟動(dòng)子區(qū)(HindIII-Xbal)替代，制得質(zhì)粒pKT81和pKT83(圖2).
pKT81和pKT83各含有源自大豆的大豆衍生Glu基因翻譯增強(qiáng)子，它們分別連接到MF-48和MF-18的下游，這樣就可達(dá)提高翻譯效率的目的，另外在pKT81和pKT83的遠(yuǎn)下游端都含有一個(gè)表達(dá)單位，其中的Gus基因是與nos基因啟動(dòng)子相連接的，此處的Gus基因是報(bào)告基因。同時(shí)，它們都包含有連接有一個(gè)ipt基因啟動(dòng)子、一個(gè)源自大豆Glu基因的翻譯增強(qiáng)子、一個(gè)NPTII基因和一個(gè)nos基因終止子的表達(dá)單位。
在pMF-28中，pSan9的整個(gè)Gus基因表達(dá)箱與pKT11的Gus基因表達(dá)箱進(jìn)行了交換。
利用MF48、MF-18和MF-28啟動(dòng)子來表達(dá)Gus基因的pKT81、pKT83和pMF-28載體的限制性酶圖譜如圖2A，B和C所示，作為最基本載體的pKT11的限制性酶圖譜如圖2D所示。
此外，為了制備含有增加的ocs區(qū)域的啟動(dòng)子，將限制性酶BamHI的BgIII切割位點(diǎn)之間的序列，這是一個(gè)包含有MF-48啟動(dòng)子的ocs元件的區(qū)域，插入到利用BamHI切割啟動(dòng)子制得的片段中，這樣就制備了含有同方向彼此連接的序列的兩個(gè)拷貝的啟動(dòng)子(MF-48-2SEQ ID NO3)以及含有同方向彼化連接的序列的四個(gè)拷貝的啟動(dòng)子(MF-48-4SEQ ID NO4)(圖3)。
表達(dá)Gus基因的菊花愈傷組織的制備作為對照，利用電穿孔技術(shù)將利用MF-48和MF-18啟動(dòng)子表達(dá)Gus基因的pKT81載體和pKT83載體連同pKT11載體導(dǎo)入根瘤土壤桿菌LBA 4404菌株中，向制得的菌株中接種3ml YEB-Km培養(yǎng)基，28℃下避光培養(yǎng)16小時(shí)。其后，離心收集菌株細(xì)胞，將其懸浮在10ml下述的感染培養(yǎng)基中制備感染液。YEB-Km培養(yǎng)基和感染培養(yǎng)基的組成如下。
YEB-Km培養(yǎng)基5g/l牛肉浸膏，1g/l酵母浸膏，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖，2mM硫酸鎂(pH7.2)，以及50mg/l卡那霉素感染培養(yǎng)基1/2 MS培養(yǎng)基(Murashige&Skoog，Physiol.Plant.，15(1962)473-497)濃度的無機(jī)鹽和維生素，15g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，以及10mM MES(pH 5.4)。
將無菌植物Reagan(Chrysanthemum morifodium ev.Reagan或Dendranfhemagrandiflorum ev.Reagan)，菊花的一個(gè)栽培品種的葉子切割成5-7mm見方的葉片，并將這些葉片在土壤桿菌感染液中浸泡10分鐘以使載體pKT11、pKT81和pKT83導(dǎo)入。用濾紙吸凈多余的感染液，將葉片轉(zhuǎn)移到共培育培養(yǎng)基中，并在25℃下避光培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，將葉片轉(zhuǎn)移到隨后的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，從而得到Km抗性愈傷組織。在選擇培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件是25℃、16小時(shí)光照(光強(qiáng)32uE/m2s)/8小時(shí)無光照。每種載體導(dǎo)入到4片含有制得的Km抗性愈傷組織的葉子中，這樣共有12片葉子用于Gus活性確定，以此來確定Gus基因的表達(dá)。
共培育培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基濃度的無機(jī)鹽和維生素，30g/l蔗糖，1mg/l萘乙酸、2mg/k芐基腺嘌呤，8g/l瓊脂，5mM MES(pH5.8)，以及200uM乙酰丁香酮選擇培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基濃度的無機(jī)鹽和維生素，30g/l蔗糖，1mg/l萘乙酸、2mg/l芐基腺嘌呤，8g/l瓊脂，5mM MES(pH5.8)，25mg/l卡那霉素，以及300mg/l頭孢氨噻將葉片轉(zhuǎn)移到200μl反應(yīng)液(100mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)、1mM EDTA、0.1％TritonX-100，1mM二硫蘇糖醇(DTT))中來確定酶活性，冰凍條件下將其完全粉碎。將得到的懸浮液離心收集上清液，收集到的上清液可作為粗酶液。依照已出版的報(bào)道來確定Gus活性(植物分子生物學(xué)手冊，C2(1994)1-32，前文有描述)。也即，以5μl粗酶液和50ul濃度為2.8mg/ml的4-四甲基傘形酮基-β-D-葡萄糖醛酸酐為底物，添加到145ul反應(yīng)液中，測定產(chǎn)生的熒光進(jìn)行。利用Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室的蛋白測定試劑盒II來對蛋白質(zhì)定量，并確定單位蛋白的Gus活性。下表1展示了分別用pKT11、pKT81和pKT83轉(zhuǎn)化的愈傷組織的Gus活性。由于pKT81和pKT83轉(zhuǎn)化的愈傷組織表現(xiàn)了比pKT11轉(zhuǎn)化的愈傷組織約高4-5倍的Gus活性，所以可以確定無甲基化的啟動(dòng)子MF-48和MF-18具有高表達(dá)能力。
表1利用多種啟動(dòng)子來表達(dá)菊花愈傷組織的β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因

對于MF-48-2和MF-48-4來講，這些載體是通過替代pBI121的35S啟動(dòng)子來制備的。以與上文相同的方式，利用菊花葉子作為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而得到Km抗性愈傷組織。利用這些愈傷組織，依照植物分子生物學(xué)手冊，C2(1994)1-32(前面有描述)中描述的方法，對Gus活性進(jìn)行組織染色。在pBI121轉(zhuǎn)化過的組織中未發(fā)現(xiàn)顏色產(chǎn)生，但相反，在MF-48-2和MF-48-4轉(zhuǎn)化的組織中觀察到相當(dāng)強(qiáng)的藍(lán)色。換句話說，對于定量表達(dá)強(qiáng)度來講，pBI121是負(fù)(-)，但MF-48-2和MF48-4正相反，分別是(+)到(++)。
表達(dá)Gus基因的菊科植物的制備在植物轉(zhuǎn)化中，我們經(jīng)常觀察到，即使啟動(dòng)子在未分化細(xì)胞，如愈傷組織中能高度表達(dá)，也僅僅在成年植物的部分細(xì)胞中能高度表達(dá)。我們認(rèn)為，原因之一是在植物細(xì)胞分化的時(shí)候刺激了基因甲基化來抑制不必要的基因表達(dá)。鑒于前述現(xiàn)象，我們認(rèn)為本發(fā)明所公開的無甲基化啟動(dòng)子也能在成年植物中高度表達(dá)，從而我們也可對它們進(jìn)行檢驗(yàn)。
依照實(shí)施例3中的方法，對分別含有pKT81、pKT83和pMF-28的根瘤土壤桿菌LBA 4404菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到Km抗性愈傷組織。在含有Km的MS培養(yǎng)基上(再生培養(yǎng)基其組成與實(shí)施例3中的選擇培養(yǎng)基相同)，從獲得的愈傷組織來再生植物。進(jìn)一步，為了促進(jìn)生根，在促生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)再生植物，而再生培養(yǎng)基中已經(jīng)去除了植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(萘乙酸，芐基腺嘌呤)。
利用PCR，從成年植物中檢測到含有外源基因NPTII基因的植物，所以可以確定這樣獲得的重分化植物是轉(zhuǎn)化株。此處，TAAAGCACGAGGAAGCGGT(SEQID NO5)和GCACAACAGACAATCGGCT(SEQ ID NO6)序列用做NPTII基因特異性序列特異性擴(kuò)增的引物。PCR的反應(yīng)條件是在94℃下加熱5分鐘，然后在72℃下反應(yīng)10分鐘。在這個(gè)反應(yīng)中，選用的酶是ExTaq多聚酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))。
每種植物取3片葉子，每個(gè)基因取10種植物，依照與實(shí)施例3相同的方法進(jìn)行活性確定，已確定活性的平均值如圖4所示。按照實(shí)施例3中的轉(zhuǎn)化方法，將pBI121導(dǎo)入菊花和煙草(品種Xanthi)中作為對照。此外，檢查每片含有導(dǎo)入的pKT81(MF-48)、pKT83(MF-18)及pMF-28(MF-28)的菊花轉(zhuǎn)化株葉片來確定植物對Gus基因表達(dá)的水平，其結(jié)果在圖5中用一個(gè)直方圖來展示。
按照這個(gè)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，每株含有導(dǎo)入的pKT81(MF-48)、pKT83(MF-18)或pMF-28(MF-28)的菊花比含有導(dǎo)入的pBI121的菊花表現(xiàn)出更高的Gus基因表達(dá)。然而，眾所周知的高表達(dá)啟動(dòng)子范例pMF-28的表達(dá)水平?jīng)]有達(dá)到其在煙草中的表達(dá)水平。然而，令人驚訝的是pKT81和pKT83在煙草中表現(xiàn)出比pBI121(35S)高的多的表達(dá)水平。那么，在pKT81(MF48)和pKT83(MF-18)進(jìn)行比較時(shí)，pKT83植物往往表現(xiàn)出較高的Gus基因表達(dá)(圖4)。此外，利用菊花進(jìn)行了表達(dá)水平研究。例如，表現(xiàn)出3倍Gus基因表達(dá)水平的植物局限于MF48和MF-18。整體上來講，相對于MF48，含有MF-18且表現(xiàn)高表達(dá)的植物的數(shù)目可能要更大一些(圖5)。
轉(zhuǎn)化株菊花中外源基因甲基化分析為了了解導(dǎo)入基因在體內(nèi)是如何被甲基化的，就要對導(dǎo)入基因序列中甲基化胞嘧啶的位置進(jìn)行確定。選用的方法是Meyer等的胞嘧啶脫氨基作用PCR法(EMBOJoumal，13(1994)2084-2088)。這個(gè)方法大體包括，首先利用CTAB從實(shí)施例4中制得的轉(zhuǎn)化株菊花中提取DNA，利用限制性酶EcoRI進(jìn)行切割，懸浮于轉(zhuǎn)化緩沖液(3M Na-bissulfate，0.5mM氫醌，pH5.3)中，50℃下在氮?dú)庵蟹磻?yīng)20小時(shí)。透析除鹽，利用0.3N NaOH對DNA進(jìn)行堿飽和，然后在乙醇中收集沉淀。然后，利用設(shè)計(jì)來從側(cè)面連接到位點(diǎn)待確定的核苷酸序列上的DNA引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。此處選用的PCR引物如下所示。
<用于35S區(qū)域甲基化分析的引物>
第一次PCR35S-8GAATGTTAATTTATAGATGGTTAGAGAGGTTTATGTAGTAGG(SEQ ID NO7)35S-8CCATATTCTCTCCAAATAAAATAAAC(SEQ ID NO8)第二次PCR35S-9AGTAATAATTTTAGGAAATTAAATATTTTTTTAAGAAGG(SEQ IDNO9)35S-14TATTCTCTCCAAATAAAATAAACTTC(SEQ ID NO10)<用于35S互補(bǔ)鏈甲基化分析的引物>
第一次PCR35S-C-1CTATTCCAATATAAACAATTCAAAACTTAC(SEQ ID NO11)35S-C-4TGAAATGAATTTTTTTATATAGAGGAAGGGTTTTGTG(SEQ IDNO12)第二次PCR35S-C-2CAACATAATAAAACACAACACACTTATCTAC(SEQ ID NO13)35S-C-3ATGAATTTTTTTATATAGAGAAGGGTTTTGTGAAG(SEQ IDNO14)<用于GUS基因甲基化分析的引物>
第一次PCR35S-16GAAGAAATTTTTGTTAATATGGTGGAGTATGATATG(SEQ IDNO15)TO-100CCAATCAACAAACACATAATTACAATCTTACACAACATACATC(SEQ ID NO16)第二次PCR35S-17GGGATGATGTATAATTTTATTATTTTTTGTAAGA(SEQ ID NO17)TO-101CATAACATCAACTTCAAATAACATATAACCACCCTAATAC(SEQ ID NO18)<用于Pacl基因甲基化分析的引物>
第一次PCR35S-16GAAGAAATTTTTTGTTAATATGGTGGAGTATGATATG(SEQ IDNO15)pacl-7CTTCAATAACAAATTCATTTTAACAATCATACC(SEQ ID NO19)第二次PCR35S-17GGGATGATGTATAATTTTATTATTTTTTGTAAGA(SEQ ID NO17)pacl-8ACAAATTCATTTTAACAATCATACCTTAACT(SEQ ID NO20)
<用于MF甲基化分析的引物>
第一次PCRTO-103GAGGATTTAAAAGGAAGGTGGTTTTTATAAATGTTATTATTG(SEQ ID NO21)TO-105CCACAATTTTCACAATCCAAACTAAATACCCACAAACC(SEQID NO22)GUS基因的5′區(qū)域第二次PCRTO-104GGATTTAAAAGGAAGGTGGTTTTTATAAATGTTATTATTGTG(SEQ ID NO23)TO-106CAATTTTCACAATCCAAACTAAATACCCACAAACCATC(SEQID NO24)GUS基因的5′區(qū)域上述所有PCR的反應(yīng)條件是開始在94℃下加熱5分鐘，在94℃下30秒，在65℃下加熱1分鐘，在72℃下加熱1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，然后在72℃下反應(yīng)10分鐘。然后，選用最先獲得的PCR產(chǎn)物，在94℃下加熱5分鐘后，重復(fù)在94℃下30秒、在65℃下加熱1分鐘、在72℃下加熱1分鐘這樣的操作30次。最后進(jìn)行在72℃下反應(yīng)10分鐘這一步。
在這個(gè)PCR反應(yīng)中，選用的酶是ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))，并將PCR合成產(chǎn)物克隆到pT7blue中。對于起始DNA來講，對大約5個(gè)克隆中的DNA序列進(jìn)行了確定。在這一系列的轉(zhuǎn)化反應(yīng)之后，胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶本身被讀做胞密定，從而就檢測到了甲基基團(tuán)的存在。利用DNASIS-Macv3.7來分析核苷酸序列內(nèi)的差異。
對實(shí)施例4中制備的大約10種菊花轉(zhuǎn)化株植物進(jìn)行了分析。結(jié)果是在表現(xiàn)Gus基因高表達(dá)的菊花轉(zhuǎn)化株的35S啟動(dòng)子中有相對較少的甲基化胞嘧啶，并且在5個(gè)克隆中的甲基化比率也低。相反，在沒有檢測到有Gus基因表達(dá)的植物中，35S啟動(dòng)子中包括CG和CNG在內(nèi)的所有胞嘧啶都以高比率進(jìn)行了甲基化。在此，以導(dǎo)入相同基因的煙草(品種Xanthi)作比較，對其表現(xiàn)高Gus基因表達(dá)的植株進(jìn)行調(diào)查，但沒有檢測到甲基化的胞嘧啶。同時(shí)，對菊花35S啟動(dòng)子的互補(bǔ)DNA鏈中胞嘧啶的甲基化程度進(jìn)行了檢測。雖然其中有零星的甲基化胞嘧啶，但特定的胞嘧啶并沒有遭受甲基化修飾，并且這些零星的甲基化胞嘧啶與Gus基因表達(dá)也沒有任何關(guān)系。另一方面，也對結(jié)構(gòu)基因的甲基化進(jìn)行了調(diào)查，不管表達(dá)強(qiáng)度如何，至少在從翻譯起始位點(diǎn)(ATG)到大約第600位核苷酸之間的核苷酸中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)胞嘧啶修飾作用。上述胞嘧啶甲基化作用和表達(dá)水平之間的關(guān)系不僅在Gus基因，而且在含有導(dǎo)入的結(jié)構(gòu)基因的菊花中可觀察到，而此結(jié)構(gòu)基因中的一個(gè)雙鏈RNA特異性RNA酶基因(Nature Biotechnoloty，15，1290-1297前文有描述)是結(jié)合到35S啟動(dòng)子的下游部分的。
隨后，以相同的方式對含有導(dǎo)入的pKT81并表現(xiàn)高Gus基因表達(dá)的菊花的甲基化作用進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果是許多植物在轉(zhuǎn)化后根本不再遭受甲基化作用，并且，在其他植物中，在回文結(jié)構(gòu)外，從啟動(dòng)子到Gus基因這段核苷酸序列中的位點(diǎn)上的胞嘧啶遭受了很強(qiáng)的甲基化作用。然而，所有植株都強(qiáng)烈表達(dá)Gus基因，鑒于此，我們認(rèn)為回文結(jié)構(gòu)(CG和CNG)外的胞嘧啶殘基甲基化對基因表達(dá)的影響很小。
因此，作為一種提高結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的方法，我們認(rèn)為重要的是去轉(zhuǎn)化導(dǎo)入基因啟動(dòng)子位點(diǎn)上含有CG和CNG回文結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。順便提一下，按照實(shí)施例3的結(jié)果，對pKT83來講，在所有的回文序列中，雖然不能對一個(gè)稱為ocs序列的短序列中的CG序列(SEQ ID NO2中第185和197位胞嘧啶核苷酸)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但這一位點(diǎn)卻表現(xiàn)出比pKT81更高的表達(dá)活性的作用趨勢。因此，在對此ocs序列的回文結(jié)構(gòu)不進(jìn)行轉(zhuǎn)化的條件下制備高表達(dá)啟動(dòng)子就意味著在體內(nèi)能夠取得更高的表達(dá)。
轉(zhuǎn)化康乃馨為了利用無甲基化啟動(dòng)子來提高NPTII基因的表達(dá)水平，并利用標(biāo)記來提高選擇效率，我們將NPTII表達(dá)箱的Nos啟動(dòng)子轉(zhuǎn)換為無甲基化啟動(dòng)子。為了簡便操作，用HindIII和XbaI之間的DNA片段來取代Nos啟動(dòng)子和MF-48啟動(dòng)子，從而制備得到包含MF-48啟動(dòng)子、NPTII和Nos終止子的箱。利用制得的箱取代pKT-11中的NPTII表達(dá)箱(從HindIII位點(diǎn)到KpnI位點(diǎn))，這樣就制得連接到Gus表達(dá)箱上并可用做二元載體的pKT74。
利用電穿孔技術(shù)將pKT74和作為對照的pKT11導(dǎo)入根瘤土壤桿菌LBA 4404菌株中，并對其接種3mlYEB-Km培養(yǎng)基。28℃下避光培養(yǎng)16小時(shí)，離心收集菌株細(xì)胞，將其懸浮在10ml下述的感染培養(yǎng)基中制備感染液。YEB-Km培養(yǎng)基和感染培養(yǎng)基的組成如下。
YEB-Km培養(yǎng)基5g/l牛肉浸膏，1g/l酵母浸膏，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖，2mM硫酸鎂(pH7.2)，以及50mg/l卡那霉素感染培養(yǎng)基1/2 MS培養(yǎng)基(Murashige&Skoog，Physiol Plant.，15(1962)473-497)濃度的無機(jī)鹽和維生素，15g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，以及10mM MES(pH5.4)。
將無菌康乃馨品種Scaria(Dianthus caryophyllus L)植株上的葉莖切掉，并將其浸泡于土壤桿菌感染液中10分鐘，使載體pKT11和pKT74導(dǎo)入。用濾紙吸凈多余的感染液，將葉片移植到下述的共培育培養(yǎng)基中，25℃下避光培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，將葉片轉(zhuǎn)移到隨后的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，從而得到G418抗性愈傷組織。在選擇培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件是25℃、16小時(shí)光照(光強(qiáng)32uE/m2s)/8小時(shí)無光照。
共培育培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基濃度的無機(jī)鹽和維生素，30g/l蔗糖，0.5mg/l吲哚乙酸，0.22mg/l thidiazuron，8g/l瓊脂，5mM MES(pH5.8)，以及100mg/l乙酰丁香酮選擇培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基濃度的無機(jī)鹽和維生素，30g/l蔗糖，0.5mg/l吲哚乙酸，0.22mg/l thidiazuron，8g/l瓊脂，5mM MES(pH5.8)，25mg/l G418，以及300mg/l頭孢氨噻[實(shí)施例7]康乃馨轉(zhuǎn)化株的選擇按照實(shí)施例6中的方法對分別含有pKT11和pKT74的根瘤土壤桿菌LBA4404菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用制得的G418抗性幼苗在不含除G418之外的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(吲哚乙酸，thidiazuron)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行植株再生。
利用PCR，從成年植物中檢測到含有外源基因NPTII基因的植株，所以可以確定獲得的重分化植物是轉(zhuǎn)化株。此處，TAAAGCACGAGGAAGCGGT(SEQ IDNO5)和GCACAACAGACAATCGGCT(SEQ ID NO6)序列用做NPTII基因特異性序列特異性擴(kuò)增的引物。PCR的反應(yīng)條件是開始在94℃下加熱5分鐘，在94℃下30秒，在55℃下加熱1分鐘，在72℃下加熱1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，然后在72℃下反應(yīng)10分中。在這個(gè)反應(yīng)中，選用的酶是ExTaq多聚酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))。
利用PCR，從中檢測到NPTII基因的植株作為轉(zhuǎn)化株。對于每個(gè)pKT11和pKT74來講，其轉(zhuǎn)化效率比率是以選用的每片葉子中轉(zhuǎn)化株的數(shù)目來計(jì)算的。pKT11的比率是不大于5％，相反，pKT74的比率是不小于25％。同時(shí)，利用與實(shí)施例3相同的方法來確定Gus活性，并進(jìn)一步證實(shí)所有的重組體都表達(dá)Gus基因。
鑒于以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為MF-48啟動(dòng)子可高效作用于選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)。
本文中引用的所有出版物、專利和專利申請全部作為參考文獻(xiàn)。
序列表序列表<110>麒麟麥酒株式會社(KTRIN BREWERY COMPANY，LIMITED)<120>改進(jìn)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用<130> PH-1165-PCT<150>JP 2000-59276<151>2000-03-03<160>24<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>320<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明含有啟動(dòng)子序列的合成DNA<400>1aagcttaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg tgataaagga aaggctatca 60ttgaagatgc ctctacctat agtggtccca aagatggacc cccacccatg aggagcatgg 120tagaaaaaga agatgttcca accatgtctt caaagcaagt ggattgatgt ggatcctcca 180atgatgtcaa ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcttccc tctatataag 240gaagttcatt tcatttggag aggacaaggt actctagact tctttcctca accttctttc 300ttcttatata tcataccatg 320<210>2<211>320<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明含有啟動(dòng)子序列的合成DNA<400>2aagcttaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg tgataaagga aaggctatca 60ttgaagatgc ctctacctat agtggtccca aagatggacc cccacccatg aggagcatgg 120tagaaaaaga agatgttcca accatgtctt caaagcaagt ggattgatgt ggatcctcca 180atgacgtcaa ggatgacgtc aaatcccact atccttgcca agatcttccc tctatataag 240gaagttcatt tcatttggag aggacaaggt actctagact tctttcctca accttctttc 300ttcttatata tcataccatg 320<210>3<211>370<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明含有啟動(dòng)子序列的合成DNA<400>3aagcttaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg tgataaagga aaggctatca 60ttgaagatgc ctctacctat agtggtccca aagatggacc cccacccatg aggagcatgg 120tagaaaaaga agatgttcca accatgtctt caaagcaagt ggattgatgt ggatcctcca 180atgatgtcaa ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcctcca atgatgtcaa 240ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcttccc tctatataag gaagttcatt 300tcatttggag aggacaaggt actctagact tctttcctca accttctttc ttcttatata 360tcataccatg370<210>4<211>470<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明含有啟動(dòng)子序列的合成DNA<400>4aagcttaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg tgataaagga aaggctatca 60ttgaagatgc ctctacctat agtggtccca aagatggacc cccacccatg aggagcatgg 120tagaaaaaga agatgttcca accatgtctt caaagcaagt ggattgatgt ggatcctcca 180atgatgtcaa ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcctcca atgatgtcaa 240ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcctcca atgatgtcaa ggatgatgtc 300aaatcccact atccttgcca agatcctcca atgatgtcaa ggatgatgtc aaatcccact 360atccttgcca agatcttccc tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacaaggt 420actctagact tctttcctca accttctttc ttcttatata tcataccatg470<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>5taaagcacga ggaagcggt 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>6gcacaacaga caatcggct 19<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>7gaatgttaat ttatagatgg ttagagaggt ttatgtagta gg 42<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>8ccatattctc tccaaataaa ataaac 26<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>9agtaataatt ttaggaaatt aaatattttt ttaagaagg 39<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>10tattctctcc aaataaaata aacttc 26<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>11ctattccaat ataaacaatt caaaacttac 30<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>12tgaaatgaa tttttttatat agaggaaggg ttttgtg 37<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>13caacataata aaacacaaca cacttatcta c 31<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>14atgaattttt ttatatagag gaagggtttt gtgaag36<210>15<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>15gaagaaattt ttgttaatat ggtggagtat gatatg36<210>16<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>16ccaatcaaca aacacataat tacaatctta cacaacatac atc43<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>17gggatgatgt ataattttat tattttttgt aaga 34<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>18cataacatca acttcaaata acatataacc accctaatac40<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>19cttcaataac aaattcattt taacaatcat acc 33<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>20acaaattcat tttaacaatc ataccttaac t 31<210>21<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>21gaggatttaa aaggaaggtg gtttttataa atgttattat tg 42<210>22<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>22ccacaatttt cacaatccaa actaaatacc cacaaacc 38<210>23<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>23ggatttaaaa ggaaggtggt ttttataaat gttattattg tg 42<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>24caattttcac aatccaaact aaatacccac aaaccatc 38
權(quán)利要求
1.下面(a)或(b)表示的DNA(a)包含有由SEQ ID NO1中第7到272個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(b)包含有由SEQ ID NO1中第7到272個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
2.下面(c)或(d)表示的DNA(c)包含有由SEQ ID NO1所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(d)包含有由SEQ ID NO1所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
3.下面(e)或(f)表示的DNA(e)包含有由SEQ ID NO2中第7到272個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(f)包含有由SEQ ID NO2中第7到272個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列(此處核苷酸NO.185到186和197到198是單個(gè)CG)。
4.下面(g)或(h)表示的DNA(g)包含有由SEQ ID NO2所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(h)包含有由SEQ ID NO2所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列(此處核苷酸NO.185到186和197到198是單個(gè)CG)。
5.下面(i)或(j)表示的DNA(i)包含有由SEQ ID NO3中第7到322個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(j)包含有由SEQ ID NO3中第7到322個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
6.下面(k)或(1)表示的DNA(k)包含有由SEQ ID NO3所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(1)包含有由SEQ ID NO3所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
7.下面(m)或(n)表示的DNA(m)包含有由SEQ ID NO4中第7到422個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(n)包含有由SEQ ID NO4中第7到422個(gè)核苷酸所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
8下面(o)或(p)表示的DNA(o)包含有由SEQ ID NO4所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列的DNA；或(p)包含有由SEQ ID NO4所展示的核苷酸序列組成的核苷酸序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位點(diǎn)外的位點(diǎn)有一到多個(gè)核苷酸缺失、添加或插入，并且這些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何連續(xù)序列。
9.包含權(quán)利要求1-8中任一DNA的DNA鏈。
10.權(quán)利要求9中的DNA鏈，其含有一個(gè)結(jié)構(gòu)基因DNA和權(quán)利要求1-8中以利于表達(dá)的方式結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因DNA 5′端的任一DNA。
11.利用權(quán)利要求9或10中的DNA鏈轉(zhuǎn)化過的宿主
12.權(quán)利要求11中的宿主，其中的宿主是植物細(xì)胞
13.在植物中表達(dá)結(jié)構(gòu)基因的方法，其中對權(quán)利要求11中的宿主進(jìn)行培育或培養(yǎng)來保正結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
14.權(quán)利要求13中的方法，其中的結(jié)構(gòu)基因是外源基因。
15.生產(chǎn)蛋白的方法，包括利用權(quán)利要求11中的宿主生產(chǎn)蛋白的步驟，而這種蛋白是結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)產(chǎn)物，而具有啟動(dòng)子活性的DNA可活化此結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)其表達(dá)。
16.通過對權(quán)利要求12中的宿主進(jìn)行再生獲得的轉(zhuǎn)化株植株。
17.權(quán)利要求9中的DNA鏈，其包含選擇性標(biāo)記基因DNA和權(quán)利要求1-8中以利于表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的方式結(jié)合到選擇性標(biāo)記基因DNA 5′端的任一DNA。
18.用于選擇轉(zhuǎn)化株宿主的方法，其中該方法包括下列步驟利用權(quán)利要求17中的DNA鏈轉(zhuǎn)化宿主；以及在選擇性標(biāo)記基因可進(jìn)行表達(dá)的條件下培養(yǎng)制得的宿主，并確定該宿主是否表達(dá)選擇性標(biāo)記基因。
19.權(quán)利要求18中的方法，其中的宿主是植物細(xì)胞。
全文摘要
對啟動(dòng)子進(jìn)行改進(jìn)以便在轉(zhuǎn)化株構(gòu)建過程中不進(jìn)行甲基化作用。上述啟動(dòng)子是如(1)和(2)中所定義的DNA(1)含有SEQ ID NO1－4所表示的堿基序列的DNA以及(2)含有衍生自SEQ ID NO1－4所表示的堿基序列并具有啟動(dòng)子活性的DNA，這些堿基序列是通過對SEQ ID NO1－4所表示的堿基序列缺失、添加或插入一到多個(gè)堿基的方式得到的，但缺失、添加或插入的堿基序列中不含有CG、CAG、CTG、CCG和CGG表示的連續(xù)序列。這些啟動(dòng)子可提高那些弱表達(dá)植物的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)效率(例如菊花)，而這些弱表達(dá)植物即使是利用被認(rèn)為是植物高表達(dá)啟動(dòng)子的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子也表現(xiàn)弱表達(dá)。
文檔編號C12N15/82GK1427890SQ01809011
公開日2003年7月2日 申請日期2001年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月3日
發(fā)明者藤井敏雄, 小川俊也, 吉岡正陽, 間宮千士, 戶栗敏博 申請人:麒麟麥酒株式會社