專利名稱：包含新的調(diào)控元件的載體的制作方法
包含新的調(diào)控元件的載體背景技術(shù)本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)領(lǐng)域，尤其是開發(fā)用于重組蛋白表達(dá)的 載體。在真核細(xì)胞中表達(dá)異源基因是生物技術(shù)的一個(gè)重要方面，在學(xué) 術(shù)和商業(yè)方面均有應(yīng)用。這些基因的表達(dá)需要RNA聚合酶II (PolII) 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這是被已知為啟動子和增強(qiáng)子的順式遺傳元件驅(qū)動的。簡單來說，啟動子是位于下游少于100 (通常少于50)堿基對(bp) 的起始序列轉(zhuǎn)錄的定向元件。它們包含許多作為不同蛋白的結(jié)合位點(diǎn) 的短的共有核苷酸序列，這些蛋白參與轉(zhuǎn)錄起始和已知為前-起始復(fù)合 物的多-亞單位復(fù)合物的組裝(McKnight and Tjian， 1987， Ce1 46: 795-805 )。在大部分基因中，這發(fā)生在非常廣泛的已知為TATA盒 (TATAAA)的保守序列，TATA盒-結(jié)合蛋白(TBP，通用轉(zhuǎn)錄因子 TFIID的一個(gè)亞單位)與其結(jié)合。隨后超過10種其他轉(zhuǎn)錄因子有序組裝， 最終形成PolII全酶復(fù)合物。RNA轉(zhuǎn)錄實(shí)際起始于下游約25-30堿基的起 始{立點(diǎn)(Breathnach禾口Chambon， 1981 , Annu Rev Biochem 50: 349-393)， TBP也與其結(jié)合。大部分功能性啟動子還包含上游啟動子元件(UPEs)，它們中最 保守的是CAAT盒(CCAAT ，轉(zhuǎn)錄因子CBF 、 C/EBP禾BNF-1的結(jié)合位點(diǎn))， 在上游大約70-200bp，和GC盒(GGGCGG，通用轉(zhuǎn)錄因子Sp-l的結(jié)合 位點(diǎn))，位于上游相似距離。盡管TATA盒單獨(dú)就能產(chǎn)生基本水平的轉(zhuǎn) 錄，但對大部分啟動子來說優(yōu)選水平的轉(zhuǎn)錄至少需要CAAT和GC盒。增強(qiáng)子是非定向增強(qiáng)附近但不必直接緊鄰的啟動子的轉(zhuǎn)錄的序列 (可以到幾千堿基遠(yuǎn)(Kadonaga (2004) Cell 116: 247-257)。增強(qiáng)子 包含代表廣泛的轉(zhuǎn)錄激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)的短(8-12bp)共有序列(Ondek
等人，1988， Science 236: 1237-1244)，所述轉(zhuǎn)錄激活蛋白包括也與啟動 子元件有關(guān)的一些蛋白，例如NF-1和SP-1。這些序列經(jīng)常以串聯(lián)或者 反向重復(fù)形式重復(fù)出現(xiàn)。在一些天然轉(zhuǎn)錄單位中，包括許多DNA病毒諸如巨細(xì)胞病毒的非 ?；钴S的立即/早期基因轉(zhuǎn)錄單位，增強(qiáng)子和啟動子元件可以被功能性 組合成有效的擴(kuò)展的上游元件。啟動子可被調(diào)節(jié)，以對細(xì)胞類型、溫度、金屬離子或者其他因子 作出應(yīng)答；或者啟動子可以是組成型的，產(chǎn)生對這些因子沒有應(yīng)答的 轉(zhuǎn)錄。出于許多目的，在許多(如果不是全部的)細(xì)胞類型中產(chǎn)生持 續(xù)高水平轉(zhuǎn)錄的組成型強(qiáng)啟動子是非常有利的。許多年來在人巨細(xì)胞 病毒中驅(qū)動立即/早期基因表達(dá)的增強(qiáng)子/啟動子元件已被廣泛用于驅(qū) 動真核表達(dá)載體異源基因的這種表達(dá)(Foecking和Hoffstetter， 1986, Gene 45: 101- 105)。人巨細(xì)胞病毒(CMV)是3皰疹病毒科成員，引起胃腸和呼吸道 感染、肝炎和視網(wǎng)膜炎。和其他皰疹病毒屬一樣，CMV可持續(xù)潛伏感 染，在免疫缺陷病人中被重新激活。在細(xì)胞培養(yǎng)中，人CMV在終極分 化細(xì)胞諸如成纖維、上皮和內(nèi)皮細(xì)胞以及單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞中 有效復(fù)制(Isomura和Stinski, 2003， J Virol 77: 3602-3614及其參考文獻(xiàn))c在有效感染過程中，CMV基因有一個(gè)有序的表達(dá)模式，稱為立即-早期(IE)、早期或者晚期。人CMVIE基因被認(rèn)為在復(fù)制效率上起著 關(guān)鍵作用(參見Castillo和Kowalik， 2002， Gene 290: 19-34的綜述)。人CMV IE啟動子的上游區(qū)域被分成3個(gè)區(qū)域，調(diào)節(jié)子、獨(dú)特區(qū)和 增強(qiáng)子。增強(qiáng)子還可被分為遠(yuǎn)端和近端增強(qiáng)子。遠(yuǎn)端增強(qiáng)子是有效IE 基因表達(dá)和低MOI下病毒復(fù)制必需的。人CMVs具有用于IE基因表達(dá)的 非常強(qiáng)的增強(qiáng)子。人CMV增強(qiáng)子具有4個(gè)包含NF-K B或者rel結(jié)合位點(diǎn) 的18-bp重復(fù)元件，5個(gè)包含CREB或者ATF結(jié)合位點(diǎn)的19-bp重復(fù)元件， 2個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)和多個(gè)SP1位點(diǎn)(Thomsen等人，1984, Proc Natl Acad Sci USA 81 : 659-663; Meier禾P Stinski, 1996, Intervirology 39: 331-342)。鼠CMV增強(qiáng)子包含6個(gè)NF-K B或者rel結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)CREB 或者ATF結(jié)合位點(diǎn)，和至少7個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)(Dorsch-Hasler等人，1985, ProcNatlAcadSci USA 82: 8325-8329)。不同的順式-作用元件單獨(dú)以 及協(xié)同地穩(wěn)定啟動子上的RNA聚合酶n轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。許多優(yōu)勢地感染其他宿主種類的巨細(xì)胞病毒是已知的，但是，在 許多情況下，確切的分類和種間相關(guān)性的程度都是暫定的。感染許多 靈長類(包括非洲綠猴、恒河猴和倭黑猩猩)和嚙齒類包括小鼠、大 鼠和豚鼠的巨細(xì)胞病毒樣病毒已經(jīng)被識別。在這些中，只有小鼠和大 鼠的啟動子-增強(qiáng)子已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)功能分析。這些種類與人CMV的比 較顯示IE啟動子-增強(qiáng)子的功能沒有直接可比性，這可能是因?yàn)檫€存在 未識別的在不同種的細(xì)胞中作用于下游轉(zhuǎn)錄的順式-作用元件(Isomura 禾口Stinski， 2003, J Virol 77: 3602-3614)。但是，人和小鼠的CMV IE啟動子-增強(qiáng)子在真核表達(dá)載體中產(chǎn)生 異源基因的持續(xù)高水平組成型表達(dá)，在生物技術(shù)中廣泛應(yīng)用。人CMV 啟動子的這種使用公開于US 5,168,062 (Stinski/University of Iowa)。 US 5,591,639 (Bebbington/Celitech)要求保護(hù)利用啟動子、增強(qiáng)子和 包含人巨細(xì)胞病毒主要立即-早期基因的第一個(gè)內(nèi)含子的功能完整的5' (上游)非翻譯區(qū)域，其中這不是直接連接到它的天然DNA編碼序列。 US 4,968,615 (Koszinowski等人)公開了小鼠CMV IE增強(qiáng)子的使用。豚鼠CMV (GPCMV)引起與人CMV感染的病理學(xué)有很多相似的 豚鼠疾病。力圖表現(xiàn)基因組特征的努力(Isom等人，1984, J Virology 49: 426-436; Gao和Isom， 1984， J Virology 52: 436-447)表明其基因組的結(jié) 構(gòu)組織在皰疹病毒屬中是獨(dú)特的。盡管大小與人和鼠CMV相似， GPCMV基因組比人CMV基因組簡單得多，最接近于小鼠CMV的基因 組。但是，GPCMV基因組具有幾個(gè)不尋常的特征，尤其是在末端區(qū)域 的結(jié)構(gòu)。IE基因表達(dá)的后續(xù)研究通過與人CMV的序列比較發(fā)現(xiàn)了IE區(qū) 域(Yinetal, 1990， J Virol 64: 1537- 154S)，并分析了IE轉(zhuǎn)錄本的表達(dá) 和加工。但是，還沒有關(guān)于IE啟動子-增強(qiáng)子對異源基因表達(dá)的有用性 的分析。包含IE1編碼序列的5'端和上游啟動子/增強(qiáng)子區(qū)域的GPCMV基因 組的"HRv" (HindIII-EcoR V )立即-早期上游片段的序列，被測序(Yin， 1991 ， Guinea pig cytomegalovirus immediate-early gene expression, PhD thesis, Pennsylvania State University, USA)，顯示包含重復(fù)序歹U的區(qū)±或， 這是典型的CMVIE調(diào)節(jié)區(qū)域。鑒定了三個(gè)短重復(fù)序列，GP-1、 GP-2和 GP-3 。 GP-1是 一 個(gè)出現(xiàn)9次的18-bp重復(fù)序列(與 GGCCCGGGACTTTCCA共有序列具有73-100^相似性)，包含NF-k B 結(jié)合位點(diǎn)，對應(yīng)HCMV 18-bp重復(fù)序列。GP-2是一個(gè)出現(xiàn)10次的17-bp 重復(fù)序列(與TGTCCTTTTTGGCAAA共有序列具有86-100。/a目似性)， 包含與共有的SRE (血清應(yīng)答元件)相似的核心序列。GP-3在接近上游 區(qū)域重復(fù)4次，包含GTGACTTT，這個(gè)序列鑒定是c-jun或者GCN4的結(jié) 合位點(diǎn)(Hill等人，1984， Science 234: 451-457)。盡管這項(xiàng)工作表明GPCMV IE上游區(qū)域包含強(qiáng)啟動子，但是由于報(bào) 告構(gòu)建體的制備方式， 一些假象(artefacts)不能被排除。首先，HRv 片段看起來也包含IE1基因的第一個(gè)外顯子和第一個(gè)內(nèi)含子的一部分。 這個(gè)內(nèi)含子包含推定的NF-1結(jié)合位點(diǎn)的3個(gè)拷貝，它可以人為的促進(jìn)啟 動子的顯著效果。其次，用于檢測GPCMV片段的報(bào)告構(gòu)建體包含一個(gè) SV40啟動子(自身是一個(gè)強(qiáng)病毒啟動子)，這樣的話報(bào)告表達(dá)來自與 雙GPCMV/SV40啟動子的效果。結(jié)果導(dǎo)致不可能將單用GPCMV增強(qiáng)子 /啟動子與其他強(qiáng)啟動子，或者甚至與其他CMV IE增強(qiáng)子/啟動子進(jìn)行 比較。 本申請人的共同待決專利申請PCT/GB99/02357 (WO 00/05393)， 在此引入作為參考，描述了在其天然染色體環(huán)境中負(fù)責(zé)建立跨越一個(gè) 基因座的開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的元件，所述基因座完全由遍在表達(dá)的持家 基因構(gòu)成。這些元件不是來自基因座控制區(qū)(LCR)，包含擴(kuò)展的無甲 基化CpG島。術(shù)語遍在染色質(zhì)開放元件(UCOE)被用于描述這種元件。
在哺乳動物DNA中，二核苷酸CpG被DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶識別，所 述DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶將胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶。但是，5-甲基胞 噴啶不穩(wěn)定，會轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。結(jié)果就是，CpG二核苷酸比預(yù)想的偶 然出現(xiàn)的幾率要少得多。不管怎么說基因組DNA—些部分的CpG頻率 與預(yù)想的接近，這些序列已知為"CpG島"。此處使用的"CpG島"定 義為至少200bp的DNA序列，含有的GC含量至少為50X，并且觀察/預(yù) 測CpG含量的比例至少為0.6 (即CpG二核苷酸的含量至少是預(yù)想的偶 然出現(xiàn)的CpG二核苷酸的含量的60 % ) ( Gardiner-Green M和Frommer M. J Mol Biol 196, 261-282 (1987); Rice P, Longden I和Bleasby A Trends Genet 16, 276-277 (2000))。
無甲基化的CpG島是本領(lǐng)域公知的(Bird等人(1985) Cell 40: 91-99, Tazi和Bird (1990) Cell 60: 909-920)，可以被定義為其中大部分胞嘧 啶沒有被甲基化的CpG島，所述CpG島通?？缭絻蓚€(gè)在空間上接近(0.1-3kb)的趨異轉(zhuǎn)錄的基因的5'端。這些DNA區(qū)域據(jù)報(bào)道在整個(gè)發(fā)育 期間在所有組織中都保持低甲基化(Wise和Pravtcheva (1999) Genomics 60:258-271)。它們通常與廣泛表達(dá)基因的5'端，以及估計(jì)40%的顯示 組織限制性表達(dá)模式基因相關(guān)(Antequera， F. & Bird, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1195-11999 (1993); Cross, S.H.和Bird， A.P. Curr. Opin, Genet. Dev. 5, 309-314 (1995))，并且已知位于活性染色質(zhì)區(qū)域(Tazi, J.和Bird, A. Cell 60, 909-920 (1990))。
"擴(kuò)展的"無甲基化CpG島是一種無甲基化CpG島，它跨越包括超 過一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的區(qū)域和/或跨越超過300bp，優(yōu)選超過500bp。通
過對該區(qū)域使用PCR并聯(lián)合限制性內(nèi)切酶，對擴(kuò)展的無甲基化CpG島的 邊界進(jìn)行功能性定義，其中所述限制性內(nèi)切酶在其識別序列消化(切割)DNA的能力對存在的任意CpG殘基的甲基化狀態(tài)敏感。 一種這樣 類型的酶是HpaII，它識別并消化通常出現(xiàn)在CpG島中的位點(diǎn)CCGG， 該位點(diǎn)但只是在中心CG殘基未被甲基化的情況下消化。因此，對Hpa n-消化的DNA進(jìn)行的跨越包含HpaII位點(diǎn)區(qū)域的PCR不會產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn) 物，因?yàn)镈NA未被甲基化會導(dǎo)致HpaII消化。只有DNA被甲基化，PCR 才會產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，在無甲基化區(qū)域之外，HpaII不會消化DNA， 可觀察到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，因此可以定義"擴(kuò)展的無甲基化CpG島"的邊 界。國際申請WO00/05393表明跨越無甲基化CpG島的區(qū)域，包括來自 人TATA結(jié)合蛋白(TBP) /蛋白體組件-Bl (PSMB1)和核內(nèi)不均一核 糖蛋白A2/B1 (hnRNPA2) /異染色質(zhì)蛋白lHsY (HPlHsY)基因座位的雙重趨異轉(zhuǎn)錄的啟動子，使可操作連接的基因表達(dá)水平增強(qiáng)。與活躍 轉(zhuǎn)錄啟動子相關(guān)的無甲基化CpG島具有改造染色質(zhì)的能力，因此被認(rèn)為是在看家基因座位建立和保持開放結(jié)構(gòu)域的主要決定子。UCOE產(chǎn)生有效基因整合事件的比例增加，以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和 穩(wěn)定性的增加。這具有重要的科研和生物技術(shù)應(yīng)用，包括制備轉(zhuǎn)基因 動物和在培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白產(chǎn)品。WO00/05393公開了大約4.0kb的功能性UCOE片段，尤其是，圖21 的核苷酸4102到8286定義的"5.5RNP"片段(第11頁，第6和7行公開)。 相同申請公開了一個(gè)"1.5kbRNP"片段(圖22和29，衍生過程描述在 第51頁，第1到5行)。但是，這個(gè)片段實(shí)際是上述"5.5RNP"片段的 一個(gè)2165bp BamH I -Tthlll I片段，由該申請圖21的核苷酸4102到 6267組成。另一個(gè)申請WO 02/24930，公開了人工構(gòu)建的UCOEs，由天然產(chǎn)
生的CpG島組成。第三個(gè)申請，WO 04/067701描述了包括UCOEs的小 功能片段的多核苷酸。這種多核苷酸包括不超過大約2kb的無甲基化 CpG島，或者更大的但不超過大約2kb的這種島的片段?？紤]到生物技術(shù)中重組蛋白表達(dá)的重要性，仍然需要包括新的啟 動子/增強(qiáng)子組合的改進(jìn)的表達(dá)載體。發(fā)明概述貫穿本說明書的描述和權(quán)利要求，詞"包含"和"包括"和這些 詞的變形，意思是"包括但不限于"，不是用于(也沒有)排除其也部 分、添加物、組分、整數(shù)或者步驟。貫穿本說明書的描述和權(quán)利要求，單數(shù)包括復(fù)數(shù)除非上下文另外 限定。尤其是，在使用不定冠詞時(shí)，說明書應(yīng)該理解為包括復(fù)數(shù)以及 單數(shù)，除非上下文另外限定。與本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方式或者實(shí)施例相關(guān)描述的特征、整 數(shù)、特性、化合物、化學(xué)部分或者基團(tuán)，應(yīng)了解也可用于此處描述的 任何其他方面、實(shí)施方式或者實(shí)施例，除非與其不相容。此處使用的術(shù)語"可操縱連接的"涉及本發(fā)明多核苷酸中元件的 操縱性的關(guān)系。"可操縱連接的"是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的術(shù)語，描 述順式作用DNA序列間的功能關(guān)系。確切的結(jié)構(gòu)關(guān)系可以是或可以不 是相關(guān)的，對不同類型的元件是有區(qū)別的。對啟動子來說，它距離其 驅(qū)動的開放閱讀框5'端非常接近(通常在少于100bp內(nèi))。在擴(kuò)展的無 甲基化CpG島例子中，顯示對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的區(qū)域效應(yīng)導(dǎo)致基因表達(dá)水平 和一致性的增加。在所述例子中，包含擴(kuò)展的無甲基化CpG島的元件可 以位于控制可表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子/啟動子的5'端。但是，"可操 縱連接的"包括其位于其他地方的可能性，只要能夠證明明顯的功能 效果。"功能同源"是指在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與公開的序列雜交的多核苷 酸序列，所述序列具有能夠在兩種或多種組織中增加可操縱連接的的 可表達(dá)的開放閱讀框架的表達(dá)的類似性質(zhì)。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交/洗滌條件是本領(lǐng)域公知的。例如，在6(TC O.IXSSC、 0.1XSDS洗滌后穩(wěn)定的核酸雜交物。如果核酸序列是已知的，可以計(jì)算出合適的雜交條件，這是本領(lǐng)域公知的。例如，可通過用于雜交的核酸的GC含量確定雜交條件。 參見Sambrook et al (1989), Molecular Cloning; A Laboratory Approach。一個(gè)用于計(jì)算特定同源性的核酸分子間完成雜交所需的嚴(yán)謹(jǐn)條件的通 用公式是Tm = 81.5°C+ 16.6 Log [Na+] +0.41 [ % G + C]-0.63 (%甲酰胺)本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的新DNA分子和載體， 其中增強(qiáng)子能夠在真核細(xì)胞中提供可操縱連接的可表達(dá)的核酸序列的 非常高水平的表達(dá)。具有優(yōu)勢的是增強(qiáng)子可以與其天然相聯(lián)的啟動子 和/或其他促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的遺傳元件聯(lián)用。本發(fā)明涉及豚鼠巨細(xì)胞病毒早期-立即啟動子/增強(qiáng)子及其在表達(dá) 載體中的應(yīng)用，尤其是為了獲得重組蛋白高水平的表達(dá)。本發(fā)明提供 真核表達(dá)載體，所述載體能夠在許多細(xì)胞類型中提供比獲自人類或小 鼠CMV IE增強(qiáng)子/啟動子元件更高的表達(dá)水平。豚鼠巨細(xì)胞病毒早期-立即上游調(diào)控區(qū)由IEl基因上游的大約 1500bp組成，更具體的是

圖1和SEQ ID NO:l所示的序列。它包括啟動 子和增強(qiáng)子元件。提到"啟動子"至少表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，TATA盒和 CAAT盒，是包含圖l (SEQIDNO:l)的核苷酸779-880的片段或者其 功能同源物。因此，本發(fā)明提供分離分離的多核苷酸，包括至少100，優(yōu)選200， 更優(yōu)選至少500個(gè)如圖1和SEQ ID NO:l所示的豚鼠CMV立即/早期調(diào)控
區(qū)的連續(xù)多核苷酸以及可表達(dá)的多核苷酸序列，所述可表達(dá)的多核苷 酸序列的轉(zhuǎn)錄被位于增強(qiáng)子和基因之間或者其他可表達(dá)序列間的啟動 子驅(qū)動，所述啟動子可以是內(nèi)源性的豚鼠CMV立即/早期啟動子或者一些其他異源的與增強(qiáng)子不是天然相聯(lián)的啟動子。可表達(dá)的多核苷酸序列不是豚鼠CMV立即/早期基因，不是與啟動子天然可操縱連接的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，在環(huán)形分離的多核苷酸(如在質(zhì)粒載體中) 情況下，"之間"表示直接可操縱連接的可表達(dá)多核苷酸序列的上游(就正義鏈而言是5')，及可操縱連接的增強(qiáng)子的下游(3')。應(yīng)了解這種分離的多核苷酸可以包括不與感興趣的插入的可表達(dá)序列的表達(dá) 相聯(lián)的其他啟動子(例如那些表達(dá)選擇標(biāo)記物所需要的啟動子或者那 些與其他元件相聯(lián)的啟動子)。因此分離的多核苷酸包括a) 包括SEQ ID NO:1的至少200個(gè)，優(yōu)選至少500個(gè)連續(xù)核苷酸的 元件和b) 包括可表達(dá)的多核苷酸序列的元件；其特征在于所述分離的多核苷酸包括，按可表達(dá)的多核苷酸序列 的正義鏈從5'至3'方向，增強(qiáng)子，單一啟動子和所述可表達(dá)的多核苷酸序列，其中所述增強(qiáng)子與所述啟動子可操縱連接，所述啟動子與所述 可表達(dá)的多核苷酸序列直接可操縱連接，其中所述啟動子與所述表達(dá) 多核苷酸序列不是天然可操縱連接的。優(yōu)選分離的多核苷酸包括立即/早期調(diào)控區(qū)的包含核苷酸50至550 的5'片段，或者，包括核苷酸275至775的3'片段。這種片段包括功能性 增強(qiáng)子片段，而沒有內(nèi)源性啟動子。在一個(gè)實(shí)施方案中，因此，本發(fā)明分離的多核苷酸包括至少來自 豚鼠CMV的立即/早期調(diào)控區(qū)的啟動子與不是天然可操縱連接的的可 表達(dá)核酸序列直接可操縱連接，所述啟動子優(yōu)選包括SEQIDNO:l的核 苷酸779至880。"直接可操縱連接的"表示基因或者其他可表達(dá)的核
酸的轉(zhuǎn)錄被啟動子直接驅(qū)動。優(yōu)選，所述的分離的多核苷酸還包括來自豚鼠CMV的主要立即/早期調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子，更優(yōu)選包括SEQIDNO:l的核苷酸l至887。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸還包括擴(kuò)展的、無 甲基化CpG島，所述CpG島與所述可表達(dá)核酸序列可操縱連接。更優(yōu)選， 所述擴(kuò)展的、無甲基化CpG島包括一個(gè)或多個(gè)另外的啟動子，尤其是趨 異轉(zhuǎn)錄的二元或者雙向啟動子。因此本發(fā)明提供包括圖l (SEQ ID NO:l)的至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的分離的核苷酸，與可表達(dá)的多核苷酸 序列可操縱連接，還包括與所述可表達(dá)的核酸序列可操縱連接的的擴(kuò) 展的、無甲基化CpG島。這種擴(kuò)展的、無甲基化CpG島可以方便的置于 增強(qiáng)子序列的鄰近或者上游。優(yōu)選這種分離多核苷酸包括至少圖1(SEQ IDNO:l)的500個(gè)連續(xù)多核苷酸，更優(yōu)選立即/早期調(diào)控區(qū)的包括核苷 酸50至550的5'片段，或者，包括核苷酸275至775的3'片段。最更優(yōu)選它 包括SEQ ID NO:l的核苷酸l至887。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)展的、無甲基化CpG島包括44kbDNA 片段，跨越人TATA結(jié)合蛋白基因和12kb 5'和3'側(cè)翼序列，或其功能片 段。優(yōu)選，功能片段包括25kbDNA片段，跨越具有l(wèi)kb 5'和5kb 3'側(cè)翼 序列的人TATA結(jié)合蛋白或者其功能片段。更優(yōu)選，TATA結(jié)合蛋白基 因相聯(lián)的擴(kuò)展的、無甲基化CpG島的功能片段不超過2kb，更優(yōu)選僅為 大約lkb，最優(yōu)選包括987bpBspEl -Esp31限制片段。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)展的、無甲基化CpG島包括60kb DNA片段，跨越具有30 kb 5'和20 kb 3'側(cè)翼序列的人hnRNP A2基因， 或者其功能片段。優(yōu)選，所述功能片段包括16kbDNA片段，跨越具有 5kb 5'和1.5kb 3'側(cè)翼序列的人hnRNP A2基因，更優(yōu)選不超過2kb的人 hnRNP A2基因的片段，最優(yōu)選不超過1.6kb，包括1546bp Esp31限制片 段。優(yōu)選，所述片段方向?yàn)檎颉?在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸包括e-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域的片段，優(yōu)選人源的，更優(yōu)選范圍在100bp至2kb的 跨越人e-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域的DNA片段。在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸包括PDCD2CpG 島/啟動子區(qū)域的片段，優(yōu)選人源的，更優(yōu)選范圍在100bp至2kb的跨越 人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域的DNA片段。在最后另一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)展的、富含CpG的無甲基化CpG 島是一個(gè)人工序列，天然不存在，包括范圍在lOObp至1.9kb的跨越人0 -肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域的DNA片段和范圍在100bp至2kb的跨越 人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域的DNA片段。優(yōu)選所述片段與其趨異定向 的啟動子直接毗連。本發(fā)明的另一方面提供了包括上述分離多核苷酸的載體。載體可 以是任意能夠?qū)NA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的載體。優(yōu)選載體是真核表達(dá)載體。 這種載體包括能夠指導(dǎo)和增強(qiáng)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的元件，諸如啟動子和增 強(qiáng)子。優(yōu)選它們優(yōu)選還包括其他促進(jìn)和優(yōu)化其功能的特點(diǎn)。這些特點(diǎn) 包括選擇的復(fù)制起點(diǎn)以便在合適的真核宿主細(xì)胞和原核細(xì)胞中復(fù)制用 于制備載體自身， 一種或多種選擇標(biāo)記物(通常是對抗生素或者毒素 產(chǎn)生抗性)以便在兩種細(xì)胞類型中選擇包含載體的細(xì)胞，允許載體擴(kuò) 增或其片段整合的元件，和方便的位于主要增強(qiáng)子/啟動子下游的多接 頭或者多克隆位點(diǎn)以便方便的插入編碼所需多肽產(chǎn)物的可表達(dá)的多核 苷酸序列(通常稱為"插入物")。這種優(yōu)化是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選，載體是整合型載體或者游離型載體。優(yōu)選整合型載體包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 包括逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的至少部分DNA，所述部分能夠感染靶細(xì)胞。
使用的術(shù)語"感染"表示病毒將遺傳材料轉(zhuǎn)移到宿主或者靶細(xì)胞的過 程。優(yōu)選，用于構(gòu)建本發(fā)明載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒是復(fù)制缺陷型的，以去 除靶細(xì)胞的病毒復(fù)制的影響。在這些例子中，根據(jù)常規(guī)技術(shù)可以通過 輔助病毒包裝復(fù)制缺陷型病毒基因組。通常，任何滿足上述感染標(biāo)準(zhǔn) 和能夠進(jìn)行功能基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒均可用于本發(fā)明。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于pLJ、 pZip、 pWe和pEM，這是本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。用于復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒合適的包裝病毒系 包括，例如iACrip、 ^Cre、 1//2禾卩0Am。用于本發(fā)明的其他載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、SV40病毒、牛 痘病毒、HSV和痘病毒載體。優(yōu)選載體是腺病毒。腺病毒載體是本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的，已經(jīng)被用于遞送基因到許多細(xì)胞類型，包括氣道 上皮、骨骼肌、肝、腦和皮膚(Hitt等人，1997; Anderson, 1998)。另一個(gè)優(yōu)選載體是腺相關(guān)病毒(AAV)載體。AAV載體是本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的，已經(jīng)被用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)人T-淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、鼻息肉、骨骼肌、腦、類紅細(xì)胞和造血干細(xì)胞用于基因治療用途。國際 專利申請WO 91/18088描述了特定的基于AAV的載體。優(yōu)選游離型載體包括瞬時(shí)非復(fù)制型游離載體，和自主復(fù)制型游離 載體，它們具有衍生自諸如那些來自EBV、人乳多空病毒(BK)和BPV-1的病毒復(fù)制起點(diǎn)的功能。這種整合型和游離型載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的，在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的文獻(xiàn)中有完整描述。尤其是，合適 的游離型載體描述在WO 98/07876。哺乳類人工染色體可在本發(fā)明中用作載體。Calos (1996)討論了 哺乳類人工染色體的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒。質(zhì)粒可以是非復(fù)制 型、非整合型的質(zhì)粒。此處使用的術(shù)語"質(zhì)粒"是指編碼可表達(dá)的基因的任意核酸，包 括線性或者環(huán)狀核酸以及雙鏈或者單鏈核酸。核酸可以是DNA或者RNA，可以包括修飾的核苷酸或者核糖核苷酸，可以通過諸如甲基化或者添加保護(hù)基團(tuán)或者帽-或者尾結(jié)構(gòu)的方法進(jìn)行化學(xué)修飾。當(dāng)轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞時(shí)，非復(fù)制型、非整合型質(zhì)粒不復(fù)制，也不特 異整合入宿主細(xì)胞的基因組(即不以高頻率整合，不整合在特異位點(diǎn))。本發(fā)明載體的高度優(yōu)選實(shí)施方案包括SEQ ID NO: 2的核苷酸1至 1003和1747至5749; SEQ ID NO: 3的核苷酸1至9328和10072至14119; 或者SEQ ID NO: 4的核苷酸1至2592和3336至7383，該表達(dá)載體適合在 完整序列編碼的示例增強(qiáng)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的位置插入可表達(dá)的 序列。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)染本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任意 真核細(xì)胞。優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選是人或者嚙齒動物細(xì)胞。已知許多技術(shù)可用于根據(jù)本發(fā)明所述將載體遞送到細(xì)胞，包括使 用核酸凝聚劑、電穿孔、與石棉絡(luò)合、聚凝胺(polybrene) 、 DEAE纖 維素、葡聚糖、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體、脂多胺、聚鳥氨酸、粒子轟 擊和直接顯微注射。通過病毒或者非病毒遞送方法，本發(fā)明的載體可以非特異或特異 的(即到指定亞型的宿主細(xì)胞)遞送到宿主細(xì)胞。優(yōu)選病毒來源的遞 送方法包括產(chǎn)生病毒顆粒的組裝細(xì)胞系作為本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)染受體， 其中設(shè)計(jì)了病毒包裝信號，例如那些腺病毒、皰疹病毒和乳多空病毒 的信號。在本發(fā)明中還可使用優(yōu)選基于非病毒的遞送方式和方法，包 括直接裸核酸注射、核酸凝集肽和非肽，陽離子脂質(zhì)體和包裹在脂質(zhì) 體中。構(gòu)思使用核酸凝集肽遞送本發(fā)明的載體。核酸凝集肽對凝集載體并將其遞送到細(xì)胞非常有效，在國際專利申請WO 96/41606中有描述。 WO 96/41606描述了官能團(tuán)可以結(jié)合到肽上以便遞送本發(fā)明的載體。這 些官能團(tuán)可以包括靶向特定細(xì)胞類型的配體，例如單克隆抗體、胰島 素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白，或者糖。因此配體可以釆用非特異 方式或者特異方式靶向定位細(xì)胞，這受細(xì)胞類型的限制。官能團(tuán)還可以包括脂、例如棕櫚酰、油酰、或者硬脂酰；中性親 水聚合物例如聚乙二醇(PEG)或者聚乙烯吡咯烷(PVP);融合肽例如流感病毒的HA肽；或者重組酶或者整合酶。官能團(tuán)還包括細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍桌绾硕ㄎ恍蛄?NLS)，內(nèi)含體逃逸信號例如破膜肽，或者指 導(dǎo)細(xì)胞直接到細(xì)胞質(zhì)的信號。本發(fā)明還提供包含此處所述的分離的多核苷酸或者載體的宿主細(xì) 胞。優(yōu)選所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選人或嚙 齒動物細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供表達(dá)可表達(dá)的多核苷酸的方法，優(yōu)選該 多核苷酸編碼多肽，包括將本發(fā)明的分離的多核苷酸插入到此處所述 的合適表達(dá)載體，然后將所述載體插入到此處所述合適的宿主細(xì)胞， 在合適條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以獲得表達(dá)。優(yōu)選，所述多肽是對治療有用的多肽，優(yōu)選選自免疫球蛋白或者 免疫球蛋白的功能性表位-結(jié)合片段、生長因子、受體或其可溶性片段 和血液凝集因子。本發(fā)明還提供包括本發(fā)明多核苷酸、載體或者宿主細(xì)胞和制藥上 可接受的載體、賦形劑、緩沖劑或者介質(zhì)的藥物制品。
附圖簡述圖l顯示GPCMVIE增強(qiáng)子/啟動子(SEQ IDNO:l)的核苷酸序列。 顯示轉(zhuǎn)錄因子AP-1， NF-kB， SRF和GCN4的潛在結(jié)合部位，以及CAAT 和TATA盒，CRS起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)(箭頭)。圖2顯示通過許多EGFP報(bào)告構(gòu)建體獲得的CH0-K1細(xì)胞中的表達(dá) 水平，表示為通過FACS檢測的熒光中值。結(jié)果比較人和豚鼠GPCMV IE 增強(qiáng)子/啟動子，具有和不具有1.5kbhnRNPUCOE元件。圖3顯示報(bào)告質(zhì)粒CET 1005 GPCMV-EGFP的圖譜，包括驅(qū)動增強(qiáng) 綠色熒光蛋白報(bào)告基因(EGFP)表達(dá)的GPCMV IE增強(qiáng)子/啟動豐 (GPCMV)，。真核選擇標(biāo)記物是表達(dá)自小鼠磷酸甘油酯激酶啟動子的 嘌呤霉素抗性基因。原核選擇標(biāo)記物是氨芐抗性。圖4顯示報(bào)告質(zhì)粒CET1015 8kb-GPCMV-EGFP的圖譜。這與CET 1005 GPCMV-EGFP相似，且在GPCMV IE增強(qiáng)子/啟動子上游添加8kb hnRNP UCOE。圖5顯示報(bào)告質(zhì)粒CET1015 1.5kb-GPCMV-EGFP的圖譜。這與 CET1015 Skb-GPCMV-EGFP相似，除了用1.5kb hnRNP UCOE元件替代 8kbhnRNP UCOE。圖6比較HEK293細(xì)胞(剪切的腺病毒5型DNA轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞) 中人和豚鼠CMV IE增強(qiáng)子/啟動子元件驅(qū)動的EGFP表達(dá)。圖7顯示使用基于熒光酶的報(bào)告構(gòu)建體的相似比較。詳細(xì)描述實(shí)施例l使用包括hCMV啟動子或者gpCMV啟動子的載體產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 CHO-Kl細(xì)胞按以下方式制備質(zhì)粒構(gòu)建體。氨芐抗性基因通過PCR從 pBluescript ( Stratagene ) 分 離 ， 在 弓l 物 5'-TGTCGCGAGTCTGACAGTTACCAATGCT TAATC 3' ( SEQ ID NO: 5)， 5'-CATCGCGAGCACTTTTCGGGGAAAT GTGTGCGC誦3' (SEQID
NO: 6)的每個(gè)末端引入Nru I位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物插入pMaeII的PvuII位 點(diǎn)(Nucleic Acids Research 2001 29:E26)產(chǎn)生pCAl。下述寡核苷酸1.5'- TCGAAGTTTAAACATTTAAATCTAGAAGCTTAT-3'(SEQ ID NO :7)2. 5'-CCGGTATCGATAAGCTTCTAGATTTAAATGTTTAAACT-3'(SEQ ID NO:8)3'(SEQ ID NO:9)4. 5'-CCCATTGGGCCAGATCTTAATTAACAATTGGCGCGCCA-3'(SEQ ID NO: 10)5. 5'-CCCAATGGGCCGTACGAATTCCTTAGGCTCGAG-3' (SEQ ID NO: 11)6. 5'-GGCCCTCGAGCCTAAGGAATTCGTACGG-3' (SEQ ID NO:12)進(jìn)行退火(1和2; 3和4; 5和6;然后三個(gè)二聚體再一起進(jìn)行退火)，用于代替Xho I和Not I位點(diǎn)間pCAl的多克隆位點(diǎn)，在構(gòu)建過程中這些 位點(diǎn)被破壞。這產(chǎn)生pCAlMCS。通過AgeI限制性消化，Age I位點(diǎn)從 pPGK-Puro-bgh pA內(nèi)的PGK啟動子中去除，然后用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平 并再連接。PGK-嘌呤霉素pA盒作為EcoR I -Xho I片段從這個(gè)載體移 除，連接入用EcoRI和Xho I進(jìn)行相似消化的pCAlMCS。這個(gè)載體命 名為pCIA-Puro (CET 1000) 。 pCIA-Puro中的bghpA用HSV TkpA代替。 HSV-Tk polyA作為Ssffi I -Ecol09 I片段從pEGFP-Nl移除，用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平，連接入經(jīng)過Sac I消化和T4 DNA聚合酶補(bǔ)平的 pCIA-Puro。這個(gè)載體命名為CET 1005。為構(gòu)建pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP，用BsmB I從pCET20 (前
述)切下1.5kbhnRNPUCOE片段，利用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平，然后克隆 入pEGFP-Nl (Clontech, Palo Alto,CA, USA)補(bǔ)平的XhoI位點(diǎn)，產(chǎn)生 pEGFP-Nl 1.5kb-EGFP。然后用Nhe I (平端)/Not I從這個(gè)質(zhì)粒切下 2.4kb " hnRNP-EGFP "盒，亞克隆入已經(jīng)用Swa I /Not I消化的 pCET1005-EGFP骨架，得到pCET1005 1.5kb-EGFP。然后用Nhe i和 EcoR I從pPCRScript GPCMV (由Geneart， Regensburg， Germany合成) 切下GPCMV啟動子，補(bǔ)平，亞克隆入這個(gè)質(zhì)粒補(bǔ)平的BamH I ，產(chǎn)生 pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP。禾u用Pme I/Sac I切下1.5kb hnRNP UCOE，補(bǔ)平，重新連接骨架產(chǎn)生質(zhì)粒pCET1005 GPCMV-EGFP。為構(gòu)建pCET1015 8kb-GPCMV-EGFP， pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP的5.3kb Sac i (平端)/Pac i片段亞克隆入pCET1015的Asc I (平 端)/Pac i -消化的骨架。通過將來自pCET20補(bǔ)平的1.5kb hnRNP BsmB i片段亞克隆入pCET1005-EGFP補(bǔ)平的Cla I位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pCET1005 1.5kb-HCMV-EGFP。CH0-K1在F12 (HAM)營養(yǎng)混合物(Gibco，UK)中培養(yǎng)，其中 添加10%胎牛血清(Invitrogen, UK) ， 5 U/ml青霉素和鏈霉素混合物(Sigma，UK)。為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CH0-K1，質(zhì)粒用Pci I線性化，在酚氯 仿異戊醇和氯仿抽提，乙醇沉淀，重懸于無菌水中，濃度為0.25/ig/Ml。 在無菌電穿孔杯中，等摩爾量的線性化質(zhì)粒在無菌水中稀釋到25/xl(1.39|tig pCET1005-EGFP, 1.78pg pCET1005 1.5kb-HCMV-EGFP, 1.45pg pCET1005 GPCMV-EGFP 或者 1.85/xg pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP)，與5xl06 CHO-K1細(xì)胞在250/U生長培養(yǎng)基中 混合。在冰浴15分鐘后，細(xì)胞在250V/975mF電穿孑l(BioRad Gene Pulser II )，在室溫繼續(xù)孵育10分鐘。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10ml生長培養(yǎng)基， 離心收集，轉(zhuǎn)移到225 cn^組織培養(yǎng)瓶，總體積50ml生長培養(yǎng)基。在 加入嘌呤霉素(Sigma，UK)至濃度12.5/xg/ml前，細(xì)胞在37°C 5% C02 孵箱中孵育24小時(shí)。在收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子前，細(xì)胞培養(yǎng)8天(4天后替 換選擇培養(yǎng)基)，亞培養(yǎng)至6孔組織培養(yǎng)板(維持選擇壓力)，使用21
熒光激活細(xì)胞分類術(shù)進(jìn)行分析，利用FL1通道觀察EGFP。圖2清楚顯 示兩個(gè)包含gpCMV的構(gòu)建體pCET1005- GPCMV-EGFP (圖3)和 pCET1005-1.5kb-GPCMV-EGFP (圖5)比使用hCMV啟動子的相應(yīng) 構(gòu)建體，pCET1005-EGFP禾a pCET1005-1.5kb-HCMV-EGFP，產(chǎn)生表達(dá) 轉(zhuǎn)基因的水平更高的細(xì)胞群。實(shí)施例2HEK293細(xì)胞在Dulbecco，s Eagle培養(yǎng)基(DMEM; Sigma, UK)中 培養(yǎng)，其中添加10。/。胎牛血清及5U/ml青霉素和鏈霉素混合物(Sigma， UK)。為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，HEK293細(xì)胞以lxl(^細(xì)血/孔密度接種于6孔板， 然后在37。C 5% (302孵箱中孵育24小時(shí)。然后用10pl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, UK)將4/^所示質(zhì)粒(pCET1005-EGFP or pCET1005-gpCMV-EGFP)(用Pd I線性化)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。DNA和Lipofectamine 2000分另iJ在250jLi1 OptiMEM I (Gibco， UK) 中稀釋，在室溫孵育5分鐘后，混合然后再孵育20分鐘。細(xì)胞的生長培 養(yǎng)基替換成lml添加15 % FCS的OptiMEM I ， 然后加入 DNA/Lipofectamine 2000混合物。在加入3.5ml添加10% FCS的OptiMEM I前，細(xì)胞在37。C 5% C02孵箱中孵育5小時(shí)。收集前細(xì)胞在37。C 5% C02 孵箱中孵育24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到225 cn^組織培養(yǎng)瓶，總體積50ml DMEM生長培養(yǎng)基，添加0.5pg/ml嘌呤霉素。在離心收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子前， 細(xì)胞生長大約14天(每隔3-4天更換選擇培養(yǎng)基)，亞培養(yǎng)至6孔組織培 養(yǎng)板(維持選擇壓力)，使用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)進(jìn)行分析，利用FL1 通道觀察EGFP。圖6顯示用gpCMV構(gòu)建體產(chǎn)生細(xì)胞群表達(dá)EGFP的水平 比用hCMV構(gòu)建體產(chǎn)生的細(xì)胞群高3-4倍。實(shí)施例3按實(shí)施例1所述培養(yǎng)CH0-K1細(xì)胞。轉(zhuǎn)然到12孔前24小時(shí)接種 1.5xl05 CH0-K1細(xì)胞。24小時(shí)后，用1.5 pl FUGENE (Roche，UK)將l /xg熒光酶報(bào)告質(zhì)粒(phCMV-LucorpgpCMV-Luc)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為此，F(xiàn)UGENE和DNA分別稀釋到Opti-MEM I (Invitrogen)中，混合，加入 到細(xì)胞中前在室溫孵育30分鐘。24小時(shí)后用Berthold光度計(jì)(Berthold, Wildbad， Germany)分析熒光酶表達(dá)。通常，按先前所述迸行細(xì)胞裂解 和熒光酶報(bào)告分析(Lipinski等人，Gene Therapy, 2001 (8): 274-281)。 轉(zhuǎn)染進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)代表性試驗(yàn)的平均和標(biāo)準(zhǔn)差被顯示(圖7)。 很清楚gpCMV載體的熒光酶活性比hCMV質(zhì)粒高至少2倍。在先前已經(jīng)有質(zhì)粒hCMV-Luc的描述(Lipinski等人，Gene Therapy (2001) 8: 274-281)。通過從pCRScript/gpCMV (用戶基因合成公司 Ge認(rèn)rt, Regensburg， Germany)制備Nde I /EcoR I片段，并將這個(gè) gpCMV啟動子片段克隆入pGL3basic (Promega)補(bǔ)平的Xho I位點(diǎn)，產(chǎn) 生質(zhì)粒gpCMV-Luc。
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，包括a.包括SEQ ID NO1的至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的元件和b.包括可表達(dá)的多核苷酸序列的元件；其特征在于所述分離的多核苷酸按可表達(dá)的多核苷酸序列的正義鏈從5’至3’方向包括，增強(qiáng)子，單一啟動子和所述可表達(dá)的多核苷酸序列，其中所述增強(qiáng)子與所述啟動子可操縱連接，所述啟動子與所述可表達(dá)的多核苷酸序列直接可操縱連接，其中所述啟動子與所述可表達(dá)的多核苷酸序列不是天然可操縱連接的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，包括SEQIDNO:l的 至少500個(gè)連續(xù)核苷酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的分離的多核苷酸，包括SEQ ID NO:l的核苷酸50至550。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的分離的多核苷酸，包括SEQ ID N0:1的核苷酸275至775。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的分離的多核苷酸，包括來自豚鼠 CMV的立即/早期調(diào)控區(qū)的啟動子，所述啟動子與不是與其天然可操縱 連接的可表達(dá)的核酸序列直接可操縱連接。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，包括SEQIDN0:1的 核苷酸679至880。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，包括 SEQ ID N0:1的核苷酸1至887。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，還包括 與所述可表達(dá)的核酸序列可操縱連接的擴(kuò)展的、無甲基化CpG島。
9. 一種載體，包括前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的真核表達(dá)載體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或者IO所述的載體，包括SEQIDNO:2的核 苷酸1至1003和1747至5749的多核苷酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9或者10所述的載體，包括SEQ ID N0:3的核 苷酸1至9328和10072至14119。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9或者10所述的載體，包括SEQ ID NO:4的核 苷酸1至2592和3336至7383。
14. 一種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的分離 的多核苷酸，或者權(quán)利要求11至13中任意一項(xiàng)所述的載體。
15. —種表達(dá)多肽的方法，包括將編碼所述多肽的可表達(dá)的核酸 序列插入根據(jù)權(quán)利要求11至13中任意一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，再導(dǎo)入 合適宿主細(xì)胞，并且在合適條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以允許表達(dá)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多肽是治療有用的多肽。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的多肽選自免疫球蛋 白，免疫球蛋白的功能性表位-結(jié)合片段，生長因子，可溶性受體和血 液凝集因子。
18. —種藥物制品，包括權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸，權(quán)利要求11至13中任意一項(xiàng)所述的載體，或者權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，和制藥上可接受的載體、賦形劑、緩沖劑或者介質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)領(lǐng)域，尤其是開發(fā)用于重組蛋白表達(dá)的載體。異源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)需要RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這是被已知為啟動子和增強(qiáng)子的順式作用遺傳元件驅(qū)動的。本發(fā)明提供一種用于獲得高水平重組蛋白表達(dá)的啟動子，所述啟動子來自豚鼠巨細(xì)胞病毒的早期-立即啟動子/增強(qiáng)子。本發(fā)明還公開了包含這種啟動子的真核表達(dá)載體，在許多細(xì)胞類型中所述載體能夠提供比可從人或小鼠巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子/啟動子元件獲得的表達(dá)更高的表達(dá)水平。
文檔編號C12N15/85GK101120093SQ200680005299
公開日2008年2月6日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月5日
發(fā)明者喬納森·高恩, 史蒂文·杰蘭特·威廉姆斯, 阿利斯泰爾·辛普森·歐文 申請人:密理博公司