一種重組畢赤酵母的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組畢赤酵母的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種單細(xì)胞低等真核生物，是近些年來(lái)研究熱門的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，具有繁殖快、易培養(yǎng)、基因操作技術(shù)成熟、能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒物質(zhì)等特性?，F(xiàn)報(bào)道的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基有BMGY、BMMY及BSM。其中BMGY、BMMY培養(yǎng)基用于實(shí)驗(yàn)室研究較多，且成分復(fù)雜，配置繁瑣；另一方面需使用YNB、酵母浸粉、蛋白胨等有機(jī)氮源，價(jià)格昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。BSM培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，其組分簡(jiǎn)單，配置方便，但易產(chǎn)生沉淀物質(zhì)，菌體對(duì)其敏感，生長(zhǎng)速度緩慢，短時(shí)間內(nèi)難到達(dá)生產(chǎn)用菌濃度，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，設(shè)備、能源、人力投入大。
[0003]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種重組畢赤酵母的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有畢赤酵母培養(yǎng)基要么成分復(fù)雜，配置繁瑣，價(jià)格昂貴，要么易產(chǎn)生沉淀物質(zhì)的問題。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種重組畢赤酵母的培養(yǎng)基，其中，包括:葡萄糖30-40g/L，玉米漿15-20g/L，酵母提取物l_5g/L，硫酸銨5-15g/L，磷酸二氫鉀6-12g/L，磷酸氫二鉀2_3g/L。
[0006]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基，其中，包括:葡萄糖40g/L，玉米漿20g/L，酵母提取物3g/L，硫酸銨5g/L，磷酸二氫鉀6g/L，磷酸氫二鉀3g/L。
[0007]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其中，包括步驟:
A、菌種的復(fù)壯:將甘油管保存的菌種用接種環(huán)劃線于含有100-300ug/mL博萊霉素的YB)瓊脂平板上，28-30°C條件下靜止培養(yǎng)48-72h，待有明顯單菌落長(zhǎng)出，備用；
B、種子培養(yǎng):挑取2-3個(gè)步驟A中得到的單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，180-220rpm條件下培養(yǎng)20-24h，確保菌液OD介于2-6范圍內(nèi)；
C、發(fā)酵罐高密度發(fā)酵培養(yǎng):將步驟B中培養(yǎng)后得到的菌液按照體積百分比為5-10%接種量接種到發(fā)酵罐中的重組畢赤酵母培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵；培養(yǎng)至重組畢赤酵母培養(yǎng)基的殘?zhí)呛吭?.5%以下時(shí)，用預(yù)先準(zhǔn)備好的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)糖；所述營(yíng)養(yǎng)液在10-14h內(nèi)補(bǔ)完，補(bǔ)糖過程中發(fā)酵液殘?zhí)呛靠刂圃?.1%以下；培養(yǎng)發(fā)酵過程中用堿液將pH維持在5-6范圍內(nèi)，直到發(fā)酵結(jié)束。
[0008]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其中，所述步驟B中，所述YPD液體培養(yǎng)基的成分包括:葡萄糖15-20 g/L，蛋白胨20-25 g/L，酵母浸粉5_10 g/L。
[0009]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其中，所述步驟B中，所述YPD液體培養(yǎng)基的成分包括:葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/Lo
[0010]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其中，所述步驟C中，所述營(yíng)養(yǎng)液為葡萄糖溶液。
[0011]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其中，按質(zhì)量百分比計(jì)，所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量為發(fā)酵液總量的3.5-4.5%。
[0012]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其中，所述步驟C中，所述堿液為氨水。
[0013]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其中，所述步驟C中，培養(yǎng)發(fā)酵的溫度為28-30°C，發(fā)酵罐罐壓為0.03-0.05Mpa，通風(fēng)比為1:0.8_1，攪拌的轉(zhuǎn)速為180_250rpm。
[0014]所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的應(yīng)用，其中，將所述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)重組畢赤酵母GS115_ple與重組畢赤酵母X33_ple。
[0015]有益效果:本發(fā)明所述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，用的是廉價(jià)的葡萄糖、玉米漿、部分無(wú)機(jī)鹽及少量酵母提取物，且配置方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。另外，采用本發(fā)明重組畢赤酵母的培養(yǎng)基可產(chǎn)生相同菌體濃度，培養(yǎng)基綜合成本更低，工藝簡(jiǎn)單，適用性強(qiáng)，具備工業(yè)化生產(chǎn)潛力，為后續(xù)的目的蛋白表達(dá)奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為重組畢赤酵母GS115_ple菌株的生長(zhǎng)動(dòng)力曲線圖。
[0017]圖2為重組畢赤酵母GS115_ple菌株的代謝動(dòng)力曲線圖。
[0018]圖3為重組畢赤酵母X33_ple菌株的生長(zhǎng)動(dòng)力曲線圖。
[0019]圖4為重組畢赤酵母X33_ple菌株的代謝動(dòng)力曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明提供一種重組畢赤酵母的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021]本發(fā)明公開一種重組畢赤酵母的培養(yǎng)基，其包括:葡萄糖30_40g/L，玉米漿15-20g/L，酵母提取物l_5g/L，硫酸銨5-15g/L，磷酸二氫鉀6_12g/L，磷酸氫二鉀2_3g/L。
[0022]優(yōu)選地，所述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基包括:葡萄糖40g/L，玉米漿20g/L，酵母提取物3g/L，硫酸銨5g/L，磷酸二氫鉀6g/L，磷酸氫二鉀3g/L。本發(fā)明所述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，用的是廉價(jià)的葡萄糖、玉米漿、部分無(wú)機(jī)鹽及少量酵母提取物，且配置方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0023]本發(fā)明上述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的制備方法，其包括步驟:根據(jù)BMGY培養(yǎng)基組分，將廉價(jià)的葡萄糖、玉米漿和硫酸銨，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀進(jìn)行替換BMGY培養(yǎng)基中的成分，然后設(shè)計(jì)正交表格進(jìn)行試驗(yàn)，篩選得到所述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基。本發(fā)明的主要改進(jìn)在于，基于畢赤酵母的生理特點(diǎn)及代謝規(guī)律，通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方碳氮比(C:N)平衡，篩選得到最優(yōu)配方的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基，篩選得到的所述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基利于菌體的高密度繁殖和生長(zhǎng)。
[0024]具體地，BMGY培養(yǎng)基的配置步驟為:酵母提取物10g，蛋白胨20g，定容至700mL，121°C高壓蒸汽滅菌20min后，添加滅菌的10%甘油lOOmL，13.4%無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)100 mL，0.02% 生物素 2 mL，Imol.L 1 磷酸緩沖液 pH6.0 100 mL。
[0025]與現(xiàn)有BMGY培養(yǎng)基相比，本發(fā)明選取廉價(jià)的葡萄糖、玉米漿和硫酸銨，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀進(jìn)行替換上述BMGY培養(yǎng)基中的成分，然后設(shè)計(jì)正交表格進(jìn)行試驗(yàn)，篩選最優(yōu)組合配方，得到所述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基。本發(fā)明所述重組畢赤酵母的培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，用的是廉價(jià)的葡萄糖、玉米漿、部分無(wú)機(jī)鹽及少量酵母提取物，且配置方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。另外，采用本發(fā)明重組畢赤酵母的培養(yǎng)基可產(chǎn)生相同的菌體濃度，且培養(yǎng)基綜合成本更低，工藝簡(jiǎn)單，適用性強(qiáng)，具備工業(yè)化生產(chǎn)潛力，為后續(xù)的目的蛋白表達(dá)奠定基礎(chǔ)。
[0026]基于上述培養(yǎng)基，本發(fā)明還提供一種如上任一所述的重組畢赤酵母的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，其包括步驟:
A、菌種的復(fù)壯:將甘油管保存的菌種用接種環(huán)劃線于含有100-300 ug/mL博萊霉素的YB)瓊脂平板上，28-30°C條件下靜止培養(yǎng)48-72h，待有明顯單菌落長(zhǎng)出，備用；
本發(fā)明的另一主要改進(jìn)之處在于，在接種培養(yǎng)前先對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯及在含有博萊霉素的YPD瓊脂平板上進(jìn)行抗性壓力篩選，從而利于保證所得到的菌種為目的純培養(yǎng)物。
[0027]所述步驟A具體為，采用對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯，目的在于提高菌體在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中的細(xì)胞代謝能力。采用含有100-300 ug/mL博萊霉素的YH)瓊脂平板進(jìn)行活化及抗性壓力篩選，有利于保證所得到的菌為目的重組畢赤酵母菌。
[0028]B、種子培養(yǎng):挑取2-3個(gè)步驟A中得到的單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，180-220rpm條件下培養(yǎng)20_24h，確保菌液OD介于2_6范圍內(nèi)；
所述步驟B具體為，從YPD瓊脂平板上挑取2-3個(gè)菌落形態(tài)較大的單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，180-220rpm條件下培養(yǎng)20_24h，確保菌液OD介于2_6范圍內(nèi)；其中，所述YPD液體培養(yǎng)基為500mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基lOOmL。其中，所述YPD液體培養(yǎng)基的成分包括:葡萄糖15-20 g/L，蛋白胨20-25 g/L，酵母浸粉5_10 g/L。優(yōu)選地，所述YTO液體培養(yǎng)基的成分包括:葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L ο
[0029]C、發(fā)酵罐高密度發(fā)酵培養(yǎng):將步驟B中培養(yǎng)后得到的菌液按照體積百分比為5-10%接種量接種到發(fā)酵罐中的重組畢赤酵母培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵；培養(yǎng)至重組畢赤酵母培養(yǎng)基的殘?zhí)呛吭?.5%以下時(shí)，用預(yù)先準(zhǔn)備好的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)糖；所述營(yíng)養(yǎng)液在10-14h內(nèi)補(bǔ)完，補(bǔ)糖過程中發(fā)酵液殘?zhí)呛靠刂圃?.1%以下；培養(yǎng)發(fā)酵過程中用堿液將pH維持在5-6范圍內(nèi)，直到發(fā)酵結(jié)束。
[0030]所述步驟C具體為，將步驟B中培養(yǎng)后得到的菌液按照體積百分比為5-10%接種量接種到發(fā)酵罐中的重組畢赤酵母培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵；其中，在發(fā)酵罐裝量為50-70%，培養(yǎng)發(fā)酵的溫度為28-30 °C，發(fā)酵罐罐壓為0.03-0.05Mpa，通風(fēng)比為1:0.8_1，攪拌的轉(zhuǎn)速為180-250rpm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵(即發(fā)酵液溶氧數(shù)值維持在30%以上)。然后在培養(yǎng)發(fā)酵約12-14h，發(fā)酵液菌體濕重達(dá)到75g/L左右，重組畢赤酵母培養(yǎng)基的殘?zhí)呛吭?.5%以下時(shí)，開始用預(yù)先準(zhǔn)備好的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)糖。優(yōu)選地，所述營(yíng)養(yǎng)液為葡萄糖溶液。按質(zhì)量百分比計(jì)，所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量為發(fā)酵液總量的3.5-4.5%。其中，所述補(bǔ)糖以間歇或連續(xù)流加方式進(jìn)行，且所述營(yíng)養(yǎng)液要求在10-14h內(nèi)補(bǔ)完，補(bǔ)糖過程中發(fā)酵液殘?zhí)呛靠刂圃?.1%以下。當(dāng)補(bǔ)糖開始后，通風(fēng)量逐步提升，最高至1: 1.2，攪拌轉(zhuǎn)速維持在250rpm不變。當(dāng)發(fā)酵液PH值低于5.0時(shí)需要補(bǔ)堿液(如氨水)或純堿將pH調(diào)節(jié)到5-6范圍內(nèi)，直到發(fā)酵約22-26h結(jié)束。
[0031]本發(fā)明的又一主要改進(jìn)在于，上述步驟C中，采用間歇或連續(xù)流加方式進(jìn)行補(bǔ)糖，可有效克服葡萄糖對(duì)菌體代謝和繁殖的抑制作用，避免代謝副產(chǎn)物乙醇、乙酸等有害物質(zhì)產(chǎn)生及積累，更有利于菌體的高密度生長(zhǎng)繁殖。另外，發(fā)酵過程中發(fā)酵液PH值控制在菌體生長(zhǎng)繁殖的最適合范圍，溶解氧維持30%以上，為菌體的生長(zhǎng)繁殖提供一個(gè)良好的環(huán)境。此外，整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用流加氨水調(diào)整發(fā)酵液PH值，流加氨水可以代替堿液調(diào)節(jié)pH值的同時(shí)，還可以補(bǔ)充菌體需要的