專利名稱：在氮限制條件下具有改變的農(nóng)學(xué)特性的植物以及涉及編碼lnt1多肽及其同源物的基因的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)，具體地講涉及植物中可用的賦予氮利用效率 和/或氮限制條件耐受性的重組DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)非生物脅迫顯著地限制了作物產(chǎn)量。據(jù)評估這些因素累積地造成平均 70%的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量減少。植物是固著的，必須適應(yīng)它們周邊的主要環(huán)境條件。這已經(jīng)導(dǎo)致它 們發(fā)展出基因調(diào)控、形態(tài)發(fā)生和代謝的高可塑性。適應(yīng)和防御機制策略涉及激活編碼對適 應(yīng)或防御不同脅迫重要的蛋白。植物氮吸收在它們的生長中起到重要作用(Gallais等人，J. Exp. Bot. 55(396) 295-306(2004))。植物從環(huán)境中的無機氮合成氨基酸。因此，氮肥已經(jīng)成為提高栽培植物如 玉米和大豆的產(chǎn)量有力工具。為了避免硝酸鹽污染并保持足夠的利潤率，如今農(nóng)民期望減 少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生長和產(chǎn)量的提高。概 括地講，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品種是所期望的?？衫眉せ顦?biāo)記來鑒定能影響性狀的基因。已經(jīng)在模型植物擬南芥屬中使用該方 法(Weigel等人，Plant Physiol. 122 1003-1013 (2000))。插入轉(zhuǎn)錄增強子元件能夠顯著 激活和/或提高附近內(nèi)源基因的表達(dá)。這種方法可以用于鑒定特定性狀(例如植物的氮利 用效率)的受關(guān)注的基因，當(dāng)所述基因經(jīng)轉(zhuǎn)基因進(jìn)入生物中時可改變該性狀。發(fā)明概述本發(fā)明包括在一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體 包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽 的氨基酸序列基于 ClustalV 比對方法在與 SEQ ID NO 18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、 或37進(jìn)行比較時具有至少50 %的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA 構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。在另一個實施方案中，增加植物的氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重 組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種 調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、 30、32、33、34、或37進(jìn)行比較時，基于Clustal V比對方法，所述多肽的氨基酸序列具有至 少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其 中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含該DNA構(gòu)建體的對照植物比較時表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性；并且任選地，(C)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代 植物，其中所述子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體，并且在與不包含該DNA構(gòu)建 體的對照植物比較時表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。在另一個實施方案中，評價植物的氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重 組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種 調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、 30、32、33、34、或37進(jìn)行比較時，基于Clustal V比對方法，所述多肽的氨基酸序列具有至 少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其 中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價該轉(zhuǎn)基因植物在與不 包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的氮脅迫耐受性；以及任選地，(d)獲得源自 該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及任 選地，(e)評價該子代植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的氮脅迫 耐受性。在另一個實施方案中，評價植物的氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重 組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種 調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、 30、32、33、34、或37進(jìn)行比較時，基于Clustal V比對方法，所述多肽的氨基酸序列具有至 少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其 中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；(c)獲取來源于轉(zhuǎn)基因植物的子代 植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評價該轉(zhuǎn)子代植 物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的氮脅迫耐受性；在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何方法，其中所述植物是玉米植物 或大豆植物。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含 (a)編碼LNTl或LNTl樣多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比 對方法在與SEQ ID NO :26、28或30中的其中一個進(jìn)行比較時，具有至少90%或95%的序 列同一性，或(b)所述核苷酸序列的全長互補序列，其中所述全長互補序列和所述核苷酸 序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。所述多肽可包含SEQ ID N0:26、28或 30的氨基酸序列。所述核苷酸序列可包含SEQ ID NO 25、27或29的核苷酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明任何分離的多核苷酸的重組DNA構(gòu) 建體，所述分離的多核苷酸可操作地連接至至少一個調(diào)控序列，并且本發(fā)明涉及包含所述 重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞、植物、和種子。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括包含本發(fā)明的任何分離的多核苷酸的載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明任何重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞、植物 或種子。所述細(xì)胞可為真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞，或者可為原核細(xì)胞，例如細(xì) 菌。附圖簡述和序列表根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描 述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。


圖1示出pHSbarENDs2活化標(biāo)記構(gòu)建體的圖譜，該構(gòu)建體用于制備擬南芥屬種群 (SEQ ID NO 1)ο圖2 示出載體pD0NR Zeo(SEQ ID NO :2)、GATE\￥AY 供體載體的圖譜。attPl 位點位于核苷酸570-801 ；attP2位點位于核苷酸2754-2985 (互補鏈)。圖3示出載體pD0NR 221 (SEQ ID NO 3)、0八丁￡\￥八丫@供體載體的圖譜』《卩1 位點位于核苷酸570-801 ；attP2位點位于核苷酸2754-2985 (互補鏈)。圖4示出載體pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建擬南芥屬表 達(dá)載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸11276-11399(互補鏈)；attR2位點位于核苷 酸9695-9819 (互補鏈)。圖5示出載體PHP27840 (SEQ ID NO 5)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建大豆表達(dá)載體 的目的載體。attRl位點位于核苷酸7310-7434 ；attR2位點位于核苷酸8890-9014。圖6示出載體PHP23236(SEQ ID NO 6)的圖譜，它是用于構(gòu)建Gaspe Flint來源 的玉米品系的表達(dá)載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸2006-2130 ；attR2位點位于核 苷酸 2899-3023。圖7示出載體PHP10523 (SEQ ID NO :7)的圖譜，該載體是存在于農(nóng)桿菌菌 株 LBA4404 中的質(zhì)粒 DNA(Komari 等人，Plant J. 10 165-174(1996) ；NCBI 通用標(biāo)識符 59797027)。圖8示出載體PHP23235(SEQ ID NO 8)的圖譜，它是用于構(gòu)建目的載體PHP23236 的載體。圖 9 示出載體 PHP20234(SEQ ID NO 9)的圖譜。圖10示出目的載體PHP22655(SEQ ID NO 10)的圖譜。圖11示出用于篩選的五個品系(標(biāo)記為1至5-每個品系有十一個個體)，加上野 生型對照品系Cl (九個個體)的典型網(wǎng)格圖案。圖12示出通過圖像分析測定的若干個不同硝酸鉀濃度對植物顏色的效應(yīng)。綠色 區(qū)(色調(diào)50至66)對氮劑量的響應(yīng)證明該區(qū)可被用于指示氮同化作用。圖13為實施例18中用于半水栽玉米生長的培養(yǎng)基。圖14是列出實施例18中與不同硝酸鹽濃度對Gaspe Flint衍生的玉米系生長和 發(fā)育的影響相關(guān)的數(shù)據(jù)的圖表。圖15A-15C示出擬南芥LNTl多肽(SEQ ID NO 32)的全長氨基酸序列與SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、33、34、和 37 的 LNTl 同源物的多重比對。圖16示出圖15A-15C中顯示的每對氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值的 圖表。圖17A-E示出用PHP30116轉(zhuǎn)化的單個Gaspe Flint來源的玉米品系的評估。圖18示出用PHP30116轉(zhuǎn)化的單個Gaspe Flint來源的玉米品系的綜合評估。本文附帶的序列描述和序列表遵循在37C. F. R. § 1.821-1.825的專利申請公 布中列出的核苷酸和/或氨基酸序列規(guī)則。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)的單字 母符號表示的核苷酸序列和三字母表示的氨基酸，該標(biāo)準(zhǔn)如Nucleic Acids Res. 13 3021-3030(1985)和 Biochemical J. 219(2) :345_373 (1984)所述，其引入本文以供參考。 用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的規(guī)定。
表1列出了本文所述的某些多肽、包含編碼多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的對應(yīng)標(biāo)識符(SEQ ID NO:)。^ 1耐低氮蛋白(LNT)
權(quán)利要求
1.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至 少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、或 37 進(jìn) 行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體 的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。
2.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
3.增加植物的氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列基于 ClustalV 比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、或 37進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性；以及(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物 進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。
4.權(quán)利要求3的方法，所述方法還包括(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的 氮脅迫耐受性。
5.評價植物的氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列基于 ClustalV 比對方法在與 SEQ ID NO 18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、或 37進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的氮 脅迫耐受性。
6.權(quán)利要求5的方法，所述方法還包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體；以及(e)評價所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的氮脅 迫耐受性。
7.評價植物的氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地 連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列基于 ClustalV 比對方法在與 SEQ ID NO 18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、或 37進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(C)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組 DNA構(gòu)建體；以及(d)評價所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的氮脅 迫耐受性。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
13.分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)編碼LNTl或LNTl樣多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :26、28或30進(jìn)行比較時具有至少90%的序列同一性， 所述ClustalV比對方法的成對比對默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5，和 DIAGONALS SAVED = 5，或(b)(a)的核苷酸序列的全長互補序列。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸，其中所述多肽具有的氨基酸序列基于采用成對比對默認(rèn) 參數(shù)的Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :26、28或30進(jìn)行比較時具有至少95%的序列 同一性。
15.權(quán)利要求13的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :26、28、或30。
16.權(quán)利要求13的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO :25、27、或29。
17.包含權(quán)利要求13的多核苷酸的載體。
18.重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含與至少一種調(diào)控序列可操作地連接的權(quán) 利要求13的分離的多核苷酸。
19.包含權(quán)利要求18的重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞 和昆蟲細(xì)胞以及植物細(xì)胞。
20.包含權(quán)利要求18的重組DNA構(gòu)建體的植物或種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了尤其可用于在氮限制條件下改變植物農(nóng)學(xué)特性的分離的多核苷酸和多肽以及重組DNA構(gòu)建體，包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(如植物或種子)、以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接在植物中有功能的啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼LNT1多肽。
文檔編號C12N15/82GK102105590SQ200980126532
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日
發(fā)明者D·盧塞爾, H·薩凱, M·奧克曼, S·M·艾倫, S·V·廷蓋, S·盧克 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司