專利名稱：在氮限制條件下具有改變的農(nóng)學(xué)特性的植物和涉及編碼包含snf2結(jié)構(gòu)域多肽的基因的相 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)，具體地講涉及植物中可用的賦予氮利用效率和/或氮限制條件耐受性的重組DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)非生物脅迫顯著地限制了作物產(chǎn)量。據(jù)評估，這些因素累積地造成平均70%的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量減少。植物是固著的，必須適應(yīng)它們周邊的主要環(huán)境條件。這已經(jīng)導(dǎo)致它們發(fā)展出基因調(diào)控、形態(tài)發(fā)生和代謝的高可塑性。適應(yīng)和防御機制策略涉及激活編碼對適應(yīng)或防御不同脅迫具有重要作用的蛋白。植物氮吸收在它們的生長中起到重要作用(Gallais等人，J. Exp. Bot. 55(396) ^5-306(2004))。植物從環(huán)境中的無機氮合成氨基酸。因此，氮肥已經(jīng)成為提高栽培植物如玉米和大豆的產(chǎn)量有力工具。為了避免硝酸鹽污染并保持足夠的利潤率，如今農(nóng)民期望減少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生長和產(chǎn)量的提高。概括地說，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品種是所期望的?？衫眉せ顦?biāo)記來鑒定能影響性狀的基因。已經(jīng)在模型植物擬南芥屬中使用該方法(Weigel等人，Plant Physiol. 122 1003-1013 (2000))。插入轉(zhuǎn)錄增強子元件能夠顯著激活和/或提高附近內(nèi)源基因的表達(dá)。這種方法可以用于鑒定特定性狀(例如植物的氮利用效率)的受關(guān)注的基因，當(dāng)所述基因經(jīng)轉(zhuǎn)基因進(jìn)入生物中時可改變該性狀。發(fā)明概述本發(fā)明包括在一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、21、23、25、27、 29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或49進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。 在另一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、21、23、25、 27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或49進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性， 并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。任選地，在氮限制條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的所述對照植物比較時，所述植物表現(xiàn)出所述至少一種農(nóng)學(xué)特性的所述改變。所述至少一種農(nóng)學(xué)特性可以是產(chǎn)量、生物量、或它們二者，并且所述改變可以是提高。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽(canola)、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、小米、甘蔗和柳枝稷。。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、 48、或49進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述種子產(chǎn)生的植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性或至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變，或者兩者皆有。所述至少一種農(nóng)學(xué)特性可以是產(chǎn)量、生物量、或二者，并且所述改變可以是提高。在另一個實施方案中，提高植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、 42、44、46、48、或49進(jìn)行比較時，具有至少50 %的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組 DNA構(gòu)建體；以及(c)獲取來源于步驟(b)的轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。在另一個實施方案中，評價植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)獲取轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、21、23、25、27、四、 30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或49進(jìn)行比較時具有至少50 %的序列同一性；(b)獲取來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的氮脅迫耐受性。在另一個實施方案中，測定植物農(nóng)學(xué)特性的改變的方法，所述方法包括(a)獲取轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 19、21、23、25、27、四、 30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或49進(jìn)行比較時，具有至少50%的序列同一性，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(b)獲取來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。任選地，所述測定步驟(c)包括測定所述轉(zhuǎn)基因植物在氮限制條件下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。所述至少一種農(nóng)學(xué)特性可以是產(chǎn)量、生物量、或二者，并且所述改變可以是提高。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何方法，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、小米、甘蔗和柳枝稷。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含 (a)編碼包含SNF2結(jié)構(gòu)域的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、21、23、36、38、或46進(jìn)行比較時，具有至少50%，55%，60%， 65%，70%，75%，80%，85%，90%，或95%的序列同一性，或者(b)所述核苷酸序列的全長互補序列，其中所述全長互補序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是 100%互補的。所述多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO :19、21、23、36、38、或46。所述核苷酸序列可包含核苷酸序列SEQ ID NO :18、20、22、35、37、或45。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明任何分離的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸可操作地連接到至少一種調(diào)控序列，并且本發(fā)明涉及包含所述重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞、植物和種子。所述細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞，或者是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。附圖簡沭和序列表根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。

圖1示出pHSbarENDs2激活標(biāo)記構(gòu)建體的圖譜，該構(gòu)建體用于制備擬南芥屬種群 (SEQ ID NO 1)ο圖 2 示出載體 PDONR11^eo (SEQ ID NO 2), GATEWAY· 供體載體的圖譜。attPl 位點位于核苷酸570-801 ；attP2位點位于核苷酸27M-2985 (互補鏈)。圖3示出載體pD0NR 221 (SEQ ID NO :3) ,GATEWAY 供體載體的圖譜。attPl位點位于核苷酸570-801 ；attP2位點位于核苷酸27M-2985 (互補鏈)。圖4示出載體pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建擬南芥屬表達(dá)載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸11276-11399(互補鏈)；attR2位點位于核苷酸9695-9819(互補鏈)。圖5示出載體PHP27840 (SEQ ID NO 5)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建大豆表達(dá)載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸7310-7434 ；attR2位點位于核苷酸8890-9014。圖6示出載體PHP23236(SEQ ID NO 6)的圖譜，它是用于構(gòu)建feispe Flint來源的玉米品系的表達(dá)載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸2006-2130 ；attR2位點位于核苷酸沘99-3023。圖7示出載體PHP10523 (SEQ ID NO :7)的圖譜，該載體是存在于農(nóng)桿菌菌株 LBA4404 中的質(zhì)粒 DNA(Komari 等人，Plant J. 10 :165-174(1996) ；NCBI 通用標(biāo)識號 59797027)。圖8示出載體PHP23235 (SEQ ID NO 8)的圖譜，它是用于構(gòu)建目的載體PHP23236 的載體。圖 9 示出載體 PHP20234(SEQ ID NO 9)的圖譜。圖10示出目的載體PHP22655(SEQ ID NO :10)的圖譜。圖11示出目的載體PHP^634(SEQ ID NO :15)的圖譜，該載體用于構(gòu)建用于feispeFlint來源的玉米品系的表達(dá)載體。圖12示出用于篩選的五個品系(標(biāo)記為1至5-每個品系有十一個個體)，加上野生型對照品系Cl (九個個體)的典型網(wǎng)格圖案。圖13示出通過圖像分析測定的若干個不同硝酸鉀濃度對植物顏色的效應(yīng)。綠色區(qū)(色調(diào)50至66)對氮劑量的響應(yīng)證明該區(qū)可被用于指示氮同化作用。圖14顯示實施例18中用于半水耕玉米生長的生長培養(yǎng)基。圖15是列出不同硝酸鹽濃度對實施例18中Gaspe Flint衍生的玉米系生長和發(fā)育的影響相關(guān)的數(shù)據(jù)的圖表。圖 16A-AM示出擬南芥(Arabidopsis thaliana)包含 SNF2 結(jié)構(gòu)域的多肽(SEQ ID NO :25、27、和 29)以及它們的同源物(SEQ ID NO :19、21、23、30、31、32、36、38、40、42、44、 46、48、和49)的全長氨基酸序列的多重比對。圖17示出圖16A-AM中顯示的每對氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值的圖表。序列描述以及所附序列表遵循如37C. F. R. § 1. 821-1. 825所列出的關(guān)于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical J. 219(2) 345-373(1984)中，它們引入本文以供參考。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的規(guī)定。表1列出了本文所述的某些多肽、包含編碼多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的對應(yīng)標(biāo)識符(SEQ ID NO:)。^ 1包含SNF2結(jié)構(gòu)域的多肽
權(quán)利要求
1.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、 38、40、42、44、46、48、或49進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。
2.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、 38、40、42、44、46、48、或49進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出產(chǎn)量或生物量的提高或二者皆提尚。
3.權(quán)利要求2的植物，其中在氮限制條件下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的所述對照植物進(jìn)行比較時，所述植物表現(xiàn)出所述產(chǎn)量或生物量的提高或二者皆提高。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、小米、甘蔗、和柳枝稷。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA 構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與 SEQ ID NO :19、21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或 49 進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中從所述種子產(chǎn)生的植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種性狀的提高，所述性狀選自氮脅迫耐受性、產(chǎn)量和生物量。
6.增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽， 所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :19、2U3、25、27、29、30、31、32、 36、38、40、42、44、46、48、或49進(jìn)行比較時具有至少50 %的序列同一性；以及(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的氮脅迫耐受性。
7.評價植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)獲取轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 19, 21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或 49 進(jìn)行比較時具有至少 50% 的序列同一性；(b)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的氮脅迫耐受性。
8.測定植物中產(chǎn)量、生物量或二者的改變的方法，所述方法包括(a)獲取轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 19, 21、23、25、27、29、30、31、32、36、38、40、42、44、46、48、或 49 進(jìn)行比較時具有至少 50% 的序列同一性；(b)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出產(chǎn)量或生物量或二者的改變。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述測定步驟(c)包括測定所述轉(zhuǎn)基因植物在氮限制條件下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比是否表現(xiàn)出產(chǎn)量或生物量或二者的改變。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述改變?yōu)樘岣摺?br> 11.權(quán)利要求6至10中任一項的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、 低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、小米、甘蔗和柳枝稷。
12.分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)編碼包含SNF2結(jié)構(gòu)域的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 19、21、23、36、38、或46進(jìn)行比較時，具有至少50%的序列同一性，其中所述Clustal V比對方法采用以下逐對比對默認(rèn)參數(shù)=KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5，和 DIAGONALS SAVED = 5，或(b)(a)的核苷酸序列的全長互補序列。
13.權(quán)利要求12的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包括SEQID N0:19、21、23、 36,38 或 46。
14.權(quán)利要求12的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包括SEQID NO 18、20、22、35、37或45。
15.包含重組DNA構(gòu)建體的植物或種子，其中所述重組DNA構(gòu)建體包含權(quán)利要求12至 14中任一項的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了尤其可用于在氮限制條件下改變植物農(nóng)學(xué)特性的分離的多核苷酸和多肽以及重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(如植物或種子)、以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含SNF2結(jié)構(gòu)域的多肽。
文檔編號C12N15/82GK102365365SQ201080013984
公開日2012年2月29日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者C·R·西蒙斯, D·盧塞爾, H·薩凱, M·奧克曼, S·M·艾倫, S·V·廷蓋, S·拉克 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司