專利名稱：：短寡核苷酸的聚合方法以及通過該聚合方法制備的高分子寡核苷酸的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制備高分子寡核苷酸的方法以及通過所述方法制備的高分子寡核苷酸的應(yīng)用，該方法的特征在于通過使短寡核苷酸聚合而增加生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
：近年來，發(fā)現(xiàn)SiRNA對于在動物細(xì)胞內(nèi)抑制特異性基因的表達(dá)效果優(yōu)越，因此siRNA作為基因治療藥劑，受到人們關(guān)注。由于這些物質(zhì)具有較高的活性和對基因的精確的選擇性，因此在過去20年中開展著研究，并且期待著能夠代替目前作為治療藥劑而正在應(yīng)用的反義寡核苷酸(ODN)，作為治療藥劑使用。鑒于此，目前有30家以上的制藥公司和生物工程公司正在致力于基于寡核苷酸(siRNA)的治療藥劑的開發(fā)。尤其是，近年來為了治療諸如糖尿病、肥胖癥、風(fēng)濕病(rheumatism)、帕金森癥(Parkinson'sdisease)、B型肝炎、C型肝炎、艾滋病、癌癥等疾病，正在開發(fā)與寡核苷酸(siRNA)有關(guān)的治療藥劑。使用siRNA等寡核苷酸概念的治療藥劑，是為了調(diào)控特異性基因的表達(dá)代謝過程，特異性地降解任意重要的mRNA，并阻斷靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，從而治療疾病。然而，寡核苷酸的穩(wěn)定性低，在生物體內(nèi)，因大量存在于血漿中的多種降解酶，會非常迅速地被降解。尤其是，這種藥劑作為注射治療劑使用時(shí)，如果不經(jīng)過化學(xué)處理而變成穩(wěn)定的狀態(tài)，則會更加迅速地被破壞。并且，siRNA等寡核苷酸所具有的陰離子特性造成難以容易地通過具有相同的負(fù)電荷的細(xì)胞膜，結(jié)果降低了細(xì)胞內(nèi)的傳遞性，從而導(dǎo)致其治療效率急劇降低的問題。不僅如此，在生物體內(nèi)，可能會將siRNA等寡核苷酸識別成外來物質(zhì)，因此會引起免疫系統(tǒng)的副作用，并且寡核苷酸會影響不是原來的計(jì)劃的基因部位的其他部位的基因，由此可能會在基因序列上引起交叉雜交(cross-hybridization)。鑒于此，目前的現(xiàn)狀是，為了在疾病治療中所使用的基于寡核苷酸(siRNA)的治療藥劑的穩(wěn)定性，并且為了使副作用最小化，要求開發(fā)出能夠提高藥物在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性且能夠使藥物的副作用最小化的納米顆粒、膠囊、微囊(micelle)等藥物輸送載體。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明是為了解決上述問題而提出的，其目的在于提供一種能夠應(yīng)用于提高siRNA等寡核苷酸在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性的同時(shí)能夠使藥物的副作用最小化的高分子寡核苷酸。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供通過使短寡核苷酸彼此聚合而制備的高分子寡核苷酸。并且，本發(fā)明提供在如上制得的高分子寡核苷酸上結(jié)合親水性高分子物質(zhì)或者無機(jī)物以進(jìn)一步提高穩(wěn)定性的高分子寡核苷酸的輸送載體。有益效果根據(jù)本發(fā)明的高分子寡核苷酸與以前所使用的低分子量寡核苷酸相比，穩(wěn)定性得到提高，因此可以在生物體內(nèi)停留長時(shí)間長，可穩(wěn)定地抑制靶標(biāo)疾病基因的表達(dá)，從而可以有效地應(yīng)用于多種疾病的治療中。圖1為利用兩端基團(tuán)為巰基(-SH基)的寡核苷酸(SiRNA)的二硫鍵而結(jié)合的高分子量的寡核苷酸(siRNA)的制備模式圖。圖2為通過電泳實(shí)驗(yàn)表示實(shí)施例1中兩端基團(tuán)為巰基(-SH基)的寡核苷酸(siRNA)發(fā)生化學(xué)聚合之前和之后的分子量變化的電泳圖。圖3為通過電泳實(shí)驗(yàn)表示實(shí)施例1中通過聚合而得到的寡核苷酸(Poly-siRNA)按照二氯二苯二氯乙烷(Dichlorodiphenyltrichloroethane，DTT)的濃度降解成低分子的結(jié)果的電泳圖。圖4為示出利用通過聚合而得到的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA)與帶正電荷的聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI(Mw25K，1.8K))制備高分子寡核苷酸輸送載體(納米顆粒)的方法的圖。圖5為表示對通過將實(shí)施例1中聚合而得到的寡核苷酸(Poly-siRNA)與聚乙烯亞胺(PEI，25K)相結(jié)合而制備的納米顆粒和寡核苷酸進(jìn)行電泳而得到的熒光圖像的圖。圖6為表示對通過將實(shí)施例2中聚合而得到的寡核苷酸(Poly-siRNA)與聚乙烯亞胺(PEI，1.8K)相結(jié)合而制備的納米顆粒和寡核苷酸進(jìn)行電泳而得到的熒光圖像的圖。圖7為根據(jù)實(shí)施例5中制備的寡核苷酸(Poly-siRNA)-聚乙烯亞胺(PEI，25K)納米顆粒的濃度表示細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。圖8為根據(jù)實(shí)施例5中制備的寡核苷酸(Poly-siRNA)-聚乙烯亞胺(PEI，1.8K)納米顆粒的濃度表示細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的特征在于提供通過使低分子寡核苷酸之間發(fā)生聚合而制備的高分子寡核苷酸。并且本發(fā)明的特征在于，在所述制備的高分子聚寡核苷酸上結(jié)合親水性的高分子物質(zhì)或者無機(jī)物，由此提供納米顆粒形態(tài)的輸送載體。以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。在本說明書中，“低分子寡核苷酸”或者“短寡核苷酸”是指，分子量在Ibp以上且小于IOObp(5個以下單體(monomer))的寡核苷酸，并且寡核苷酸包括在生物學(xué)研究以及醫(yī)學(xué)上的疾病治療上所應(yīng)用的siRNA、DNA、RNA、反義核苷酸(antisensenucleotides)。并且，“高分子寡核苷酸”是指分子量大的寡核苷酸，在本發(fā)明中可以是分子量為IOObp以上且小于40000bp(5至2000個單體)的寡核苷酸。所述高分子寡核苷酸可以通過使低分子寡核苷酸物理或者化學(xué)地彼此結(jié)合而制備。物理結(jié)合可以從氫鍵、電位結(jié)合、電荷結(jié)合、范德華力結(jié)合、疏水性鍵、親水性鍵中選擇，而化學(xué)結(jié)合可以是從二硫鍵(disulfidebonds)、二胺鍵(diaminebonds)、磺-胺鍵(sulfide-aminebonds)、羧-胺鍵(carboxyl-aminebonds)、酉旨鍵(esterbonds)以及共價(jià)鍵中選擇的。通過這種物理結(jié)合或者化學(xué)結(jié)合，可以將低分子量的寡核苷酸制備成多種分子量的高分子寡核苷酸。優(yōu)選地，可以采用化學(xué)結(jié)合的方式制備高分子寡核苷酸。通過二硫鍵等的化學(xué)結(jié)合，使短寡核苷酸聚合時(shí)，與采用物理結(jié)合的情形相比，不僅能夠制備出多種分子量的高分子siRNA，而且能夠得到陰離子特性的提高和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并且在生物體內(nèi)更加穩(wěn)定，因此是好的。作為一種例子，寡核苷酸可以優(yōu)選地為siRNA，更優(yōu)選地為由15至30個核苷酸構(gòu)成的siRNA。siRNA可以在生物體內(nèi)抑制特異性基因的表達(dá)，因此在基因治療上有用。另夕卜，為了提高在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性，可以將所述低分子siRNA寡核苷酸制備成高分子寡核苷酸。可以將兩端基團(tuán)為巰基(-SH基)的低分子siRNA通過化學(xué)交聯(lián)以二硫鍵相結(jié)合，由此制備成高分子siRNA寡核苷酸(參考圖1)。并且，“高分子寡核苷酸輸送載體”是指，將高分子寡核苷酸輸送到生物體內(nèi)的物質(zhì)，是通過使低分子siRNA、DNA、RNA、反義核苷酸等寡核苷酸聚合而制得的高分子量的寡核苷酸上結(jié)合親水性高分子物質(zhì)或者無機(jī)物而制備的。在本發(fā)明中所制備的高分子量的寡核苷酸帶有多個負(fù)(_)電荷，因此可以與帶有正電荷的親水性高分子或者無機(jī)物結(jié)合。在本發(fā)明的寡核苷酸中，尤其對于siRNA來說，與作為基因治療藥物所使用的高分子量的寡核苷酸(DNA)不同，其分子量小，呈低負(fù)電位，因此即使與呈正電位的高分子也是相對弱的結(jié)合，從而在細(xì)胞吸收過程中以及在生物體內(nèi)容易被破壞，或者還可能引起副作用。因此，如果通過與呈正電位的親水性高分子結(jié)合而形成納米顆粒型復(fù)合體，則可以增加生物體內(nèi)的穩(wěn)定性，因此是優(yōu)選的。或者，如果與氧化鐵(IronOxide)、金(gold)等生物相容性無機(jī)物結(jié)合，則可以進(jìn)一步增加分子量，能夠使藥物長時(shí)間停留在生物體內(nèi)，因此是有用的(參考實(shí)施例2、圖2)。對于可以與所述siRNA寡核苷酸結(jié)合的親水性高分子物質(zhì)來說，只要具有生物相容性，則可以不受限制地使用，尤其可以使用病灶組織積聚效率較高的高分子物質(zhì)。原因是，只有生物相容性和生物降解性優(yōu)越，生物體內(nèi)的穩(wěn)定性才會優(yōu)越，并且能夠增加血液內(nèi)的生物體濃度，從而可以在充分的時(shí)間內(nèi)不斷地積聚在癌變組織等病灶細(xì)胞或組織。作為可能的例子，包括葡聚糖(dextran)、殼聚糖(chitosan)、乙二醇?xì)ぞ跦(glycolchitosan)、多聚賴Mil(poly_L_lysine)、聚天冬MSI(poly-asparticacid)等生物體高分子物質(zhì)；聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine,PEI)、聚(N_(2_羥丙基))甲基丙烯酰胺(poly(N-2-(hydroxypropyl)methacrylamide)、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物(poly(divinylether-co-maleicanhydride))、苯乙烯-馬來酸酐共聚物(poly(styrene-co-maleicanhydride))、聚乙二酉享(poly(ethyleneglycol))等合成高分子物質(zhì)。在所述高分子物質(zhì)中，由于聚乙烯亞胺(PEI，Mw(重均分子量)為25K、1.8K)的高分子鏈上包含有多的正電子，因此適合與帶負(fù)電荷的siRNA等寡核苷酸結(jié)合。本發(fā)明中所使用的聚乙烯亞胺的平均分子量可以在102至105a范圍。siRNA等寡核苷酸與聚乙烯亞胺(PEI)等高分子之間的結(jié)合可以是物理結(jié)合或者化學(xué)結(jié)合。其中優(yōu)選根據(jù)電位結(jié)合的物理結(jié)合。所述方法與最大納入量限制為10%左右的化學(xué)結(jié)合方法相比，最大納入量達(dá)到95%而優(yōu)越，因此可以克服通過化學(xué)結(jié)合的局限性，從而可以大幅增加藥物含量。如上所述，由SiRNA等高分子寡核苷酸與親水性高分子物質(zhì)相結(jié)合的復(fù)合體在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性高，可以抑制多種疾病(例如，癌癥)或者病灶細(xì)胞的特異性基因的表達(dá)，因此可以有效地應(yīng)用于疾病的預(yù)防和/或治療。所述復(fù)合體是具有兩親性的納米顆粒形態(tài)的物質(zhì)，其大小可以在10至2000nm范圍，參考圖4，優(yōu)選為10至800nm。在本發(fā)明中的SiRNA可以采用所有類型的SiRNA，可以列舉，能夠治療諸如肺部疾病(呼吸道合胞病毒(RSV)感染、流行性感冒(Flu)、非典型性肺炎(SARS)、流行性感冒(Influenza))、眼部疾病(老年性黃斑變性(AMD))、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(抑郁癥(Digression)、老年癡呆癥(Alzheimer)、亨廷頓病(Huntingtondisease)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(Spinocerebellarataxia)、肌肉萎縮性側(cè)面硬化病(ALS)、神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathicpain)、腦炎(Enc印halitis))、癌癥(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma)、人類乳頭瘤病毒(HumanpailIomavirus)感染、前列腺(Prostate)癌、腺癌(Adenocarcinoma))、消化系統(tǒng)疾病(腸易激疾病(Irritableboweldisease))、肝臟疾病(乙型肝炎病毒(HBV)感染、高膽固醇血癥(Hypercholesterolemia))、關(guān)節(jié)疾病(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis))、生殖系統(tǒng)疾病(單純皰疹病毒(HSV))等疾病的siRNA。在輸送載體中所包含的高分子寡核苷酸siRNA相對于輸送載體的總重量可以包含1至99重量份。另外，根據(jù)本發(fā)明制備方法而通過聚合制得的高分子寡核苷酸還可以作為用于治療特定疾病的藥理學(xué)上的組合物的有效成分而使用。因此，本發(fā)明提供包含有效劑量的高分子量寡核苷酸的藥理學(xué)上的組合物。為了實(shí)施給藥，本發(fā)明的藥理學(xué)上的組合物除了根據(jù)本發(fā)明而制得的高分子寡核苷酸輸送載體之外，還可以進(jìn)一步包含藥理學(xué)上允許的1種以上的載體。藥理學(xué)上允許的載體應(yīng)當(dāng)要與本發(fā)明的有效成分可以配伍，可以將在食鹽水、滅菌水、林格氏液、緩沖食鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇以及這些成分中的一種以上成分混合而使用，并根據(jù)需要可以添加抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑等其他常用的添加齊U。并且，可以進(jìn)一步添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘結(jié)劑以及潤滑劑，制備成諸如水溶劑、懸浮劑、乳劑等注射劑型藥劑。并且，可以制成粉劑、片齊IJ、膠囊齊、液齊、注射齊、軟膏齊、糖漿劑等多種劑型，并且還可以使用單次劑量容器或者多劑量容器來提供，例如該容器可以使用密封安瓿以及瓶寸。本發(fā)明的藥理學(xué)上的組合物可以采用口服給藥或者腸外給藥。但是，根據(jù)本發(fā)明的藥理學(xué)上的組合物的給藥途徑不限于此，例如，可以采用口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、硬膜內(nèi)、心內(nèi)，經(jīng)皮、皮下、腹腔、腸內(nèi)、舌下以及局部給藥。如此，為了在臨床上實(shí)施給藥，本發(fā)明的藥理學(xué)上的組合物可以利用公知技術(shù)而制備成合適的劑型。例如，當(dāng)采用口服給藥時(shí)，可以混合惰性稀釋劑或可食用載體，或者密封在硬質(zhì)或軟質(zhì)的明膠膠囊中，或者壓制成片劑，以此實(shí)施給藥。作為口服給藥的劑型，可以采用活性化合物與賦形劑混合的口服型片劑、口含片劑、片劑(troche)、膠囊劑、酏劑(elixirs)、懸浮劑、糖漿劑、封膠片(wafer)等劑型。并且，注射用劑型、腸外給藥用劑型等各種劑型可以根據(jù)本
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的公知方法或者常用方法來制備。對于本發(fā)明的組合物的給藥量來說，根據(jù)患者的體重、年齡、性別、健康狀態(tài)、飲食、給藥時(shí)間、給藥方法、排泄率以及疾病的嚴(yán)重程度等，有多種范圍，并且本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以容易地決定本發(fā)明的實(shí)施方式以下，通過實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。但是，以下實(shí)施例僅是用來舉例說明本發(fā)明的，而本發(fā)明的內(nèi)容并不限定于以下實(shí)施例。實(shí)施例1高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))的制備將2mg的Dithiol(二巰基)-siRNA(RFP(RedFluorescentProtein,紅色熒光蛋白))溶于200yL的IOmMHEPES緩沖液(ImMEDTA，pH8.0)，在常溫下，攪拌12小時(shí)，制備通過二硫鍵相結(jié)合的分子量在1602000bp范圍內(nèi)的多種高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))(參考圖1)。實(shí)施例2利用電泳檢測的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))與高分子寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))的分子量比較在溶于HEPES緩沖液(pH8.0)的500ng/lμ1的分子量為21bp的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))和高分子寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))中，混合1μL的上樣緩沖液(loadingbuffer)和8μL的DEPC水，然后與分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)(IOObp梯度)一同，分別加樣(loading)到8%丙烯酰胺凝膠(acrylamidegel)上，然后在150V條件下，進(jìn)行電泳35分鐘。此后，用SYBR-gold染色劑染色后，得到熒光圖像。與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，可以確認(rèn)，制備出分子量為1602000bp的多種分子量的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))(參考圖2)。實(shí)施例3基于電泳檢測的按照二氯二苯二氯乙烷(DT)的濃度降解為低分子的結(jié)果確認(rèn)在溶于HEPES緩沖液(pH8.0)的10μg/ΙΟμ1的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))中，分別混合200倍-1倍摩爾過量的二氯二苯二氯乙烷(DT)(25μg/10μ1-0μg/10μ1)，在37°C下，放置90分鐘，然后采用與實(shí)施例2相同的方法，實(shí)施電泳檢測，得到熒光圖像。如圖3所示，可以確認(rèn)，根據(jù)可降解二硫鍵的二氯二苯二氯乙烷(DT)，高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))降解成寡核苷酸(Mono-SiRNA(RFP))(參考圖3)。即，可以確認(rèn)，所述高分子寡核苷酸是通過二硫鍵而結(jié)合的。實(shí)施例4高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw25K，1.8K)納米顆粒的制造在溶于HEPES緩沖液(pH8.0)的20μg/10μ1的分子量為21bp的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))和分子量在1602000bp范圍內(nèi)的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))中，分別混合200μg/10μ1的10倍至O倍(O倍時(shí)作為對照組使用)重量過量的Mw25Κ的聚乙烯亞胺(PEI)以及Oμg/10μ1的10倍至O倍(O倍時(shí)作為對照組使用)重量過量的Mw1.8Κ的聚乙烯亞胺。常溫下，放置30分鐘。將所述制備模式圖示出在圖4中。實(shí)施例5基于電泳檢測的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw25K)納米顆粒的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對在實(shí)施例4中制得的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))/PEI(Mw25K)納米顆?；蛘吒叻肿庸押塑账?Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw25K)納米顆粒，采用與實(shí)施例2相同的方法，進(jìn)行電泳檢測，確認(rèn)熒光圖像。確認(rèn)，通過混合PEI(25K)5倍重量過量的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))與PEI(25K)，形成相比寡核苷酸(Mono_siRNA(RFP))更穩(wěn)定的復(fù)合體(參考圖5)。實(shí)施例6基于電泳檢測的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw1.8K)納米顆粒的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對在實(shí)施例4中制得的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))/PEI(Mw1.8K)納米顆粒和高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw1.8K)納米顆粒，采用與實(shí)施例2相同的方法，進(jìn)行電泳檢測，然后通過納米熒光圖像進(jìn)行確認(rèn)(參考圖6)。確認(rèn)，當(dāng)混合PEI(Mw1.8K)2.5倍重量過量的高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))與PEI(Mw1.8Κ)時(shí)，形成相比寡核苷酸(Mono-SiRNA(RFP))更穩(wěn)定的復(fù)合體(參考圖6)。實(shí)施例7基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的將高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw25K)納米顆粒作為寡核苷酸(siRNA)輸送載體的效果評價(jià)在寡核苷酸(siRNA(RFP))濃度為50nM、25nM的在實(shí)施例4和5中制得的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))/PEI(Mw25K)(51重量比)納米顆?；蛘吒叻肿庸押塑账?Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw25K)(51重量比)納米顆粒、對照組(空白對照，Mono-siRNA(RFP)，Poly-siRNA(RFP))中，加入可表達(dá)RFP(紅色熒光蛋白(RedFluorescentProtein))的RFP-B16/F10(1.2XIO5/皿)細(xì)胞，經(jīng)過24小時(shí)后，獲得抑制RFP表達(dá)效果的圖像。圖7為將高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw25K)納米顆粒與對照組對比而示出細(xì)胞內(nèi)寡核苷酸(siRNA(RFP))輸送、發(fā)揮功能(抑制RFP表達(dá))的圖像。從圖7中可以得知，高分子寡核苷酸納米顆粒的細(xì)胞內(nèi)濃度更高。實(shí)施例8基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的將高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw1.8K)納米顆粒作為寡核苷酸(siRNA)輸送載體的效果評價(jià)在寡核苷酸(siRNA(RFP))濃度為400nM、200nM、IOOnM的在實(shí)施例4和5中制得的寡核苷酸(Mono-siRNA(RFP))/PEI(Mw1.8K)(2.51重量比)納米顆粒或者高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw1.8K)(2.51重量比)納米顆粒、對照組(空白對照，Mono-siRNA(RFP)，Poly-siRNA(RFP))中，加入可表達(dá)RFP的RFP-B16/F10(1.2X105/皿)細(xì)胞，經(jīng)過24小時(shí)后，獲得抑制RFP表達(dá)效果的圖像。圖8為將高分子寡核苷酸(Poly-siRNA(RFP))/PEI(Mw1.8K)納米顆粒與對照組對比而示出細(xì)胞內(nèi)寡核苷酸(siRNA(RFP))輸送、發(fā)揮功能(抑制RFP表達(dá))的圖像。權(quán)利要求1.一種制備高分子寡核苷酸的方法，該高分子寡核苷酸的分子量在IOObP以上且小于40000bp,并且由5至2000個單體構(gòu)成，其特征在于，通過物理結(jié)合或者化學(xué)結(jié)合而使分子量在Ibp以上且小于IOObp的低分子寡核苷酸結(jié)合，由此增加生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。2.如權(quán)利要求1所述的制備高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述寡核苷酸從由DAN,RNA,siRNA以及反義核苷酸組成的組中選擇。3.如權(quán)利要求1所述的制備高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述低分子寡核苷酸是由15至30個核苷酸構(gòu)成的siRNA。4.如權(quán)利要求3所述的制備高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述siRNA是以下組中選擇的，肺部疾病呼吸道合胞病毒感染、流行性感冒、非典型性肺炎、流行性感冒；眼部疾病老年性黃斑變性；神經(jīng)系統(tǒng)疾病抑郁癥、老年癡呆癥、亨廷頓病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、肌肉萎縮性側(cè)面硬化病、神經(jīng)病理性疼痛、腦炎；癌癥膠質(zhì)母細(xì)胞、人類乳頭瘤病毒感染、前列腺癌、腺癌；消化系統(tǒng)疾病腸易激疾?。桓闻K疾病乙型肝炎病毒感染、高膽固醇血癥；關(guān)節(jié)疾病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；生殖系統(tǒng)疾病單純皰疹病毒。5.如權(quán)利要求1所述的制備高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述物理結(jié)合從氫鍵、電位結(jié)合、電荷結(jié)合、范德華力結(jié)合、疏水性鍵以及親水性鍵中選擇。6.如權(quán)利要求1所述的制備高分子寡核苷酸的方法，其特征在于，所述化學(xué)結(jié)合是從二硫鍵、二胺鍵、硫-胺鍵、羧-胺鍵、酯鍵以及共價(jià)鍵中選擇的。7.一種高分子寡核苷酸的輸送載體，其特征在于，該輸送載體是在根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法制備的高分子寡核苷酸上結(jié)合從以下組中選擇的一種以上的高分子物質(zhì)而得到的，生物體高分子物質(zhì)葡聚糖、殼聚糖、乙二醇?xì)ぞ厶恰⒍嗑?L-賴氨酸、聚天冬氨酸；合成高分子物質(zhì)聚乙烯亞胺、聚(N-(2-羥丙基))甲基丙烯酰胺、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、苯乙烯_馬來酸酐共聚物、聚乙二醇。8.一種高分子寡核苷酸的輸送載體，其特征在于，該輸送載體是在根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法制備的高分子寡核苷酸上結(jié)合從氧化鐵、金中選擇的生物相容性無機(jī)物而得到的。9.如權(quán)利要求7或8所述的高分子寡核苷酸的輸送載體，其特征在于，所述高分子寡核苷酸的輸送載體是具有兩親性的納米顆粒形態(tài)的載體。10.如權(quán)利要求9所述的高分子寡核苷酸的輸送載體，其特征在于，具有所述兩親性的高分子納米顆粒的大小為10至800nm。11.如權(quán)利要求7或8所述的高分子寡核苷酸的輸送載體，其特征在于，所述高分子寡核苷酸的輸送載體的大小為10至2000nm。12.如權(quán)利要求7或8所述的高分子寡核苷酸的輸送載體，其特征在于，高分子寡核苷酸相對于100重量份的高分子寡核苷酸的輸送載體，包含1至99重量份。13.如權(quán)利要求7或8所述的高分子寡核苷酸的輸送載體，其特征在于，所述高分子寡核苷酸的輸送載體在水中形成球形的自聚集體。全文摘要本發(fā)明涉及一種高分子寡核苷酸的聚合方法以及通過所述聚合方法制備的高分子寡核苷酸的應(yīng)用，該方法的特征在于增加生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的聚合方法具有能夠?qū)⒌头肿恿康墓押塑账崛菀椎鼐酆铣筛叻肿庸押塑账岬膬?yōu)點(diǎn)。并且，根據(jù)本發(fā)明而制備的高分子寡核苷酸，通過與親水性高分子物質(zhì)或無機(jī)物結(jié)合而能夠穩(wěn)定地傳遞到生物體內(nèi)，因此可以廣泛地應(yīng)用于多種疾病的治療等中。文檔編號C12N15/87GK102361882SQ201080013677公開日2012年2月22日申請日期2010年3月2日優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日發(fā)明者尹仁燦,崔貴元,權(quán)翊贊,李承泳,李素珍,許明淑,金光明申請人:韓國科學(xué)技術(shù)研究院