專利名稱：改善的細胞系以及在膠囊化細胞生物遞送中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及表達重組蛋白的細胞系的產(chǎn)生，所述細胞系用于分泌性治療分子的裸細胞生物遞送和膠囊化細胞生物遞送。在一個實施方案中細胞系是人的細胞系。
背景技術：
向細胞中引入DNA的典型方法包括濃縮DNA的試劑、包含脂質(zhì)的試劑以及病毒介導的策略。然而，這些方法具有局限性。例如，濃縮DNA試劑和病毒介導的策略存在大小限制。此外，在病毒策略中轉(zhuǎn)染進入細胞的核酸的量受限制。此外，病毒介導的策略可以是細胞類型特異性的或組織類型特異性的，并且當體內(nèi)使用病毒策略時會產(chǎn)生免疫問題。克服這些問題的一個適宜的方法是轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座元件是可在單個細胞基因組內(nèi)移來移去并整合在不同部位的DNA序列，這是一個稱作轉(zhuǎn)座的過程。轉(zhuǎn)座子包括在其上游和下游帶有倒轉(zhuǎn)重復序列的短核酸?；钚赞D(zhuǎn)座子編碼稱作轉(zhuǎn)座酶的促進切下核酸并插入到靶DNA序列內(nèi)的酶。轉(zhuǎn)座子向染色體內(nèi)的整合提供了長期或可能永久在轉(zhuǎn)基因細胞和生物體中表達轉(zhuǎn)基因的基礎。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)具有廣的轉(zhuǎn)基因應用范圍。迄今為止，已經(jīng)研究了轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在昆蟲幼體內(nèi)的體內(nèi)蛋白質(zhì)生產(chǎn)，其中將轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒直接注射入昆蟲前胚盤胚中(W0 2001/29204)。然后從發(fā)育中的幼體或成體昆蟲純化目的蛋白質(zhì)。還已經(jīng)利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)遺傳修飾干細胞。WO 2009/050657涉及使用轉(zhuǎn)座子-轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)產(chǎn)生遺傳修飾干細胞的方法。在干細胞中表達的轉(zhuǎn)基因是處于在干細胞和分化細胞中均為組成型的啟動子控制下的標志物基因，例如GFP。在WO 2009/071334中，描述了使用通過轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)修飾的精原干細胞產(chǎn)生敲除或者轉(zhuǎn)基因動物模型的方法。因此，在本領域當前技術水平眾所周知，轉(zhuǎn)座子可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞系，或者產(chǎn)生敲除細胞系或者產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞系，因此改變細胞的特性。由于轉(zhuǎn)座子長期或者可能永久性整合入染色體中，所以在轉(zhuǎn)基因細胞和生物體中實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達。在基于細胞的治療法中，其中產(chǎn)生穩(wěn)定的人轉(zhuǎn)基因細胞系用于隨后作為或者膠囊化細胞或者裸細胞移植入受試者中，需要在植入后穩(wěn)定高表達轉(zhuǎn)基因，例如在其中不能使用選擇標記的條件下。有代表性地，移植的細胞和植入的膠囊化細胞必須能夠表達轉(zhuǎn)基因達1年或更長，而沒有任何下調(diào)，例如由基因沉默引起的下調(diào)。傳統(tǒng)的增強表達的工具例如密碼子優(yōu)化、表達增強序列的使用或者強啟動子的使用具有局限性并且可能產(chǎn)生變異的結(jié)^ ο在本發(fā)明中，在用于植入的膠囊生產(chǎn)中采用了轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的特性，其中所述膠囊包含使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)改變成分泌生物活性化合物或多肽或者促進所述生物活性肽產(chǎn)生的 siRNA的細胞。膠囊的外膜是生物相容性的并且膠囊包含支持細胞的基質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，在第一個方面中，本發(fā)明涉及用于向受試者遞送分泌性生物活性化合物的
8膠囊。膠囊包括a.生物相容性外膜和內(nèi)核，b.所述內(nèi)核包含細胞，c.所述細胞包含含有下列結(jié)構基因的異源表達構建體i.編碼分泌性生物活性多肽的結(jié)構基因，或者ii.編碼促進細胞中產(chǎn)生分泌性生物活性化合物的多肽或SiRNA的結(jié)構基因，d.所述基因位于其為轉(zhuǎn)座酶或者其它整合酶底物的兩個反向重復序列之間。該膠囊使得在植入后穩(wěn)定高表達轉(zhuǎn)基因成為可能，并且轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的使用與傳統(tǒng)的細胞轉(zhuǎn)染相比使轉(zhuǎn)基因表達增加數(shù)倍。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的膠囊用于治療的用途。由于本發(fā)明的膠囊穩(wěn)定且高水平地并且在缺乏選擇壓力下產(chǎn)生生物活性化合物，它們特別適宜于在治療中使用。由于表達水平更高，所以可降低膠囊的數(shù)量和/或大小。在另一個方面中，本發(fā)明涉及細胞系，包含編碼下列結(jié)構基因的異源表達構建體i.編碼分泌性生物活性多肽的結(jié)構基因，或者ii.編碼促進細胞中產(chǎn)生分泌性生物活性化合物的多肽或SiRNA的結(jié)構基因；所述基因位于其為轉(zhuǎn)座酶底物的兩個反向重復序列之間。通過使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)產(chǎn)生細胞系，甚至在低拷貝數(shù)時觀察到分泌多肽的增加。因此在缺乏選擇壓力下達到高效率和意外的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因表達。通過使用細胞系，保證了組合物中的所有細胞是相同的。在另一個方面中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組蛋白的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明的細胞和回收所述重組蛋白。有代表性地，在重組表達中，至少在細胞擴大培養(yǎng)過程中維持選擇壓力以保證細胞沒有丟失轉(zhuǎn)基因。由于本發(fā)明的細胞系可以在沒有選擇壓力下轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達和高水平表達，所以可以避免在重組生產(chǎn)過程中使用選擇壓力，例如使用抗生素。由此，使隨后的下游加工變得容易。在進一步的方面中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生能夠分泌生物活性化合物的細胞系的方法， 所述方法包括a.以第一和第二表達構建體轉(zhuǎn)染細胞；b.所述第一表達構建體包含編碼轉(zhuǎn)座酶的閱讀框；c.所述第二表達構建體編碼分泌性生物活性多肽或者編碼促進細胞中產(chǎn)生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA ；d.所述第二表達構建體位于其為所述轉(zhuǎn)座酶底物的兩個反向重復序列之間；e.使所述座酶瞬時表達，由此使所述第二構建體整合入所述人細胞的基因組中。通過使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)產(chǎn)生分泌多肽的細胞系，達到分泌性多肽的更高產(chǎn)量。通過使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，較少需要連續(xù)選擇壓力，因為轉(zhuǎn)基因細胞傾向于不降低表達。


MJA :2D，8周研究，甘丙肽克隆.體外穩(wěn)定分泌甘丙肽的ARPE-19克隆基于pCA 表達載體，使用標準轉(zhuǎn)染技術和G418選擇產(chǎn)生克隆，不傳代培養(yǎng)克隆8周，通過ELISA測量
9甘丙肽的分泌；SIB :2D, 8周研究，SB IgSP-甘丙肽克隆.體外穩(wěn)定分泌甘丙肽的ARPE-19克隆基于SB底物載體pT2，使用SB技術產(chǎn)生克隆，不傳代培養(yǎng)克隆直到8周，通過ELISA測量甘丙肽的分泌；SIC 對臨床NGF克隆的2D測試.體外穩(wěn)定分泌NGF的ARPE-19克隆基于pCA 表達載體，使用標準轉(zhuǎn)染技術和G418選擇產(chǎn)生克隆，不傳代培養(yǎng)克隆8周，通過ELISA測量 NGF的分泌；MID 對臨床SB-NGF克隆的2D測試.體外穩(wěn)定分泌NGF的ARPE-19克隆基于SB 底物載體PT2，使用SB技術產(chǎn)生克隆，不傳代培養(yǎng)克隆8周，通過ELISA測量NGF分泌；Ml 在迷你豬中的甘丙肽4周體內(nèi)研究.使用SB技術產(chǎn)生的膠囊化SB-甘丙肽克隆SB-IgSP-M對使用標準轉(zhuǎn)染技術產(chǎn)生的克隆ppG-152的丙甘肽表達水平，植入前數(shù)值 (藍色柱)與外植體數(shù)值(紅色柱)相比并且體外并行運行裝置(黃色柱)，將裝置植入迷你豬的海馬內(nèi)；S3 在大鼠中的NGF 8周體內(nèi)研究.使用SB技術產(chǎn)生的膠囊化SB-甘丙肽克隆 SB-NGF-78對使用標準轉(zhuǎn)染技術產(chǎn)生的克隆NGC-0295的NGF表達水平，植入前數(shù)值(藍色柱)與外植體數(shù)值(紅色柱)相比并且體外并行運行裝置(黃色柱)，將裝置植入大鼠的紋狀體內(nèi)。
具體實施例方式定義生物學活性指分子對特定細胞的生物學上有益的作用。如本文所使用，“生物活性化合物”是從產(chǎn)生其的細胞釋放或分泌并且對分開的靶細胞起作用的化合物。如本文所使用，“生物相容性膠囊”意思是指這樣的膠囊，即當植入到宿主哺乳動物內(nèi)時沒有引起足以導致排斥膠囊或者使其不適合，例如通過降解的有害宿主反應。如本文所使用，術語“生物學試劑”指任何試劑，例如病毒、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、核苷酸、藥物、前藥或者由細胞產(chǎn)生的對細胞具有作用的其它物質(zhì)， 而不論此種作用是有害、有益的還是其它方式。如本文所使用，“編碼序列”是被轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽的多核苷酸序列。如本文所使用，術語“控制序列”指對于實現(xiàn)與其連接的編碼序列和非編碼序列的表達所必需的多核苷酸序列?？刂菩蛄型ǔ０▎幼印⒑颂求w結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。 此外，“控制序列”指控制編碼序列內(nèi)所編碼肽加工的序列；這些控制序列可以包括，但不限于控制肽的分泌、蛋白酶切割和糖基化的序列。術語“控制序列”旨在以最小限度包括其存在可以影響表達的成分，并且還可包括其存在是有利的額外成分，例如，前導序列和融合配偶體序列。啟動子“下調(diào)”意思是指在體內(nèi)植入后減少轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達至導致轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的生物學活性明顯缺乏的水平。如本文所使用，“不下調(diào)的啟動子”意思是指在體內(nèi)植入至哺乳動物宿主內(nèi)后驅(qū)動或持續(xù)驅(qū)動轉(zhuǎn)基因以具有生物學活性的水平表達的啟動子。如本文所使用，術語“表達載體”指能夠指導與其有效連接的基因表達的載體。通常，表達載體在重組DNA技術中的應用性常常是質(zhì)粒形式。
10
如本文所使用，術語“遺傳修飾”和“遺傳工程”指通過有意引入外源DNA而穩(wěn)定或瞬時改變細胞的基因型。DNA可以是合成的或天然衍生的，并且可以包括基因、基因部分或其它有用的DNA序列。術語“遺傳修飾”的含義不包括天然存在的改變，例如通過天然病毒活性、天然遺傳重組等發(fā)生的改變。如本文所使用，“免疫隔離性膠囊”意思是指這樣的膠囊，即當植入至哺乳動物宿主內(nèi)時，使宿主免疫系統(tǒng)對膠囊核心內(nèi)的細胞的有害作用最小化。如本文所使用，“生物活性化合物的長期穩(wěn)定表達”意思是指以足以維持其有用的生物活性的水平持續(xù)產(chǎn)生生物活性化合物達到大于一個月、優(yōu)選大于3個月并且最優(yōu)選大于6個月的時間?！安溉閯游飭幼印敝改軌蛟诓溉閯游锛毎麅?nèi)起作用的啟動子。如本文所使用，術語“神經(jīng)病學試劑”指對神經(jīng)細胞有益的生物學試劑，術語包括經(jīng)證明可能用于CNS或眼細胞的存活、增殖、分化或功能或者神經(jīng)病學或眼科疾病或病癥治療的任何生物學或藥學活性物質(zhì)?！吧窠?jīng)肽”是在腦中產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)樣分子的成員。神經(jīng)肽由短鏈氨基酸組成，一些神經(jīng)肽作為神經(jīng)遞質(zhì)起作用并且一些神經(jīng)肽作為激素起作用。短鏈意思是指具有 < 5kD分子量的肽。如本文所使用，術語“有效連接的”意思是指在重組表達載體內(nèi)目的核苷酸序列與一個或多個調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或者，當載體被引入至宿主細胞內(nèi)時，在宿主細胞中)的方式連接。如本文所使用，術語“調(diào)節(jié)性序列”旨在包括啟動子、增強子和其它表達控制元件 (例如多腺苷化信號)。“序列同一性”高水平的序列同一性指第一個序列衍生自第二個序列的可能性。 氨基酸序列同一性要求兩個比對的序列間具有相同的氨基酸序列。因此，與參考序列具有70%氨基酸同一性的候選序列要求在比對后候選序列中70%的氨基酸與參考序列中相應氨基酸相同。同一性可以借助于計算機分析例如但不限于ClustalW計算機比對程序 (Higgins D. , Thompson J. , Gibson Τ. , Thompson J. D. ,Higgins D. G. , Gibson Τ. J. , 1994. CLUSTAL Wimproving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22 :4673-4680)和其中推薦的默認參數(shù)確定。ClustalW 軟件可以從歐洲生物信息研究所的ClustalW Wffff服務器http://www. ebi. ac. uk/clustalw得到。使用該程序和其默認設置，查詢多肽的成熟(生物活性)部分和參考多肽比對。計算完全保守殘基的數(shù)量并且除以參考多肽的長度。ClustalW算法可類似的用于比對核苷酸序列?？膳c對于氨基酸序列所標明的方式相似的方式計算序列同一性。如本文所使用，術語“轉(zhuǎn)化”指外源多核苷酸(8卩“轉(zhuǎn)基因”)向宿主細胞中的插入。 外源多核苷酸整合入宿主基因組內(nèi)。“治療”可以數(shù)種不同方式開展，包括治療性、緩解性和預防性方式。治療性治療通常是針對治療已經(jīng)存在于所治療個體內(nèi)的臨床病癥，例如疾病或感染。緩解性治療通常意思是指為了改善個體中現(xiàn)存臨床病癥的治療。預防性治療通常針對預防臨床病癥。
11
如本文所使用，術語“siRNA”指稱作“小干擾RNA”，有時稱作短干擾RNA或沉默 RNA的一類化合物。20-25個核苷酸長度的RNA在生物學上起著多種作用。最值得注意的是，siRNA參與RNA干擾(RNAi)途徑，其中其干擾特定基因的表達。使產(chǎn)生的siRNA與待沉默基因轉(zhuǎn)錄物一部分互補。使用本文所述的方法使siRNA在靶細胞中表達。所表達的短 siRNA與靶轉(zhuǎn)錄物中的互補RNA序列雜交并且所產(chǎn)生的雙鏈RNA被細胞自身的機構降解。 最終的結(jié)果是所靶向基因表達的下調(diào)。如本文所使用，術語“載體”指能夠轉(zhuǎn)運已經(jīng)與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！保渲赶蚱渲锌梢赃B接額外DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括諸如此類形式的表達載體，例如病毒載體(例如復制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)，它們具有等效的功能。如本文所使用，“反向重復序列”(或IR)是這樣的核苷酸序列，其是更下游另一序列的反向互補物。反向重復序列限定了轉(zhuǎn)座子中的邊界。反向重復序列還可稱作“反向末端重復”或者“末端反向重復序列”，因為它們以反向形式位于同一轉(zhuǎn)座子的相反端。轉(zhuǎn)座子當前，已知兩類轉(zhuǎn)座子，即I類和II類轉(zhuǎn)座子。I類移動遺傳元件或反轉(zhuǎn)座子，通過首先轉(zhuǎn)錄成RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并且然后插入在基因組中的另一位置而將自身備份。II類移動遺傳元件也稱作僅DNA轉(zhuǎn)座子，通過切割和粘接機制移動，使用轉(zhuǎn)座酶從一個位置直接移動到另一個位置。不同類型的轉(zhuǎn)座酶可以以不同方式工作。一些轉(zhuǎn)座酶可結(jié)合DNA分子的任何部分，并且靶向部位可以位于任何位置，而其他的轉(zhuǎn)座酶結(jié)合特異的序列。然后，轉(zhuǎn)座酶切割靶部位產(chǎn)生粘性末端，釋放轉(zhuǎn)座子并將其連接入靶部位內(nèi)。 DNA轉(zhuǎn)座子的插入部位可以通過短的定向重復序列(DR)鑒定，短的定向重復在由DNA聚合酶填補的靶DNA內(nèi)被交錯切開，接著通過反向重復序列(IR)鑒定，反向重復序列對于轉(zhuǎn)座子被轉(zhuǎn)座酶的切除是重要的。無脊椎動物和脊椎動物的轉(zhuǎn)座子在模式生物中均具有的轉(zhuǎn)基因和插入誘變的潛能。在脊椎動物中，當前已知和使用三種有效轉(zhuǎn)座子Tol2元件(Kawakami，K.， (2007)，Genome Biology, 8 (Supp 1 1) :S7)和重構建的轉(zhuǎn)座子 Sleeping Beauty (SB) (Ivies, Ζ.等· (2004)，Curr· Issues Mol. Biol.，6 :43-56)和 Frog Prince (FP) (Miskey, C.等· (2003) ,Nucleic Acid Research, 31 (24) :6873-6881)。脊椎動物中的另一感興趣的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是PiggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(Wilson，M. H.等· (2007) ,Molecular Therapy, 15 (1) 139-145。從青鏘魚(青鏘(Oryzias latipes))分離的Tol2轉(zhuǎn)座子是自主性轉(zhuǎn)座子，其編碼全功能的轉(zhuǎn)座酶?？蓪⑾喈敶蟮腄NA插入片段(大至111Λ)克隆入Το12轉(zhuǎn)座子中，而不降低轉(zhuǎn)座活性。已經(jīng)證明，Το12轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在迄今為止所測試的所有脊椎動物細胞中是有效的，包括斑馬魚、爪蟾、雞、小鼠和人。Το12轉(zhuǎn)座子的DNA序列與hAT家族轉(zhuǎn)座子，包括來自果蠅的hobo，來自玉米的Ac和來自金魚草的Tam3 (Kawakami，K. (2007)，Genome Biology, 8 (supp 1 1) :S7)相似。Sleeping Beauty (SB)是從魚基因組復活的Tcl/mariner樣家族轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座
12酶成員并且表現(xiàn)出在多種脊椎動物的培養(yǎng)細胞系、胚胎干細胞和小鼠體內(nèi)體細胞和種系細胞中具有高轉(zhuǎn)座活性。已經(jīng)證明Slewing Beauty是用于數(shù)種脊椎動物模式生物內(nèi)功能基因組學的有價值的工具，并且顯示有希望用于人基因治療應用(Ivics，Ζ.和Izsvak， Ζ. (2006)，Curr.Gene Ther.，6 :593-607)。SB轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子描述于US 7，148，203和US 6，489，458。SB轉(zhuǎn)座酶的高活性變體描述于WO 2009/003671中，結(jié)果改善了已經(jīng)有價值的SB系統(tǒng)作為將DNA引入細胞的方法。Frog Prince也是"Tcl/marine樣家族成員并且最近已經(jīng)從北方豹蛙(豹紋蛙， Rana pipiens)的基因組轉(zhuǎn)座子拷貝中再活化。Frog I^rince與Slewing Beauty僅具有約50%的序列相似性并且有效催化魚、兩棲動物和哺乳動物細胞系中轉(zhuǎn)座的切割和粘連 (Miskey, C.等，(2003), Nucleic Acids Research, 31 (24) :6873-6881)。PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)衍生自粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)并且能夠遞送大的轉(zhuǎn)座元件(大至141Λ)而不明顯降低效率。PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已經(jīng)用于昆蟲轉(zhuǎn)基因和用于小鼠內(nèi)的種系誘變(Wilson, Μ. H.等，(2007), Molecular Therapy, 15(1) :139-145)?？山Y(jié)合使用的另外的轉(zhuǎn)座子是Oc31 (見例如Calos，Curr Gene Ther. 2006Dec ； 6(6) :633-45)、Minos (見例如 Zagoraiou 等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2001Sep 25; 98(20) :11474-8. Epub 2001Sep 18)、Mariner 轉(zhuǎn)座酶例如 Minos (見例如 Pavlopoulos 等，Genome Biol. 2007 ；8Suppl 1 :S2)禾口 Hermes (例如 Evertts 等，Genetics. 2007Dec ； 177(4) :2519-23. Epub 20070ct 18)。上述轉(zhuǎn)座子不會相互作用并且因此可以用作在其他轉(zhuǎn)座子存在下的遺傳工具，這極大地擴展了這些元件的實用性。可以以互補方式利用對于不同插入部位的任何偏愛。已經(jīng)開發(fā)出作為在無脊椎動物和脊椎動物兩種模式生物內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移載體的DNA轉(zhuǎn)座子。 DNA轉(zhuǎn)座子在人基因治療中是逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的強有力的競爭者。對于遺傳分析和治療目的， II類轉(zhuǎn)座元件是最有用的，因為它們具有容易的實驗室操作和可控性質(zhì)。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)具有廣泛的遺傳應用范圍。迄今為止，已經(jīng)研究了轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)用于在昆蟲幼蟲內(nèi)的體內(nèi)蛋白質(zhì)生產(chǎn)，在其中將轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒直接注射入昆蟲的前胚盤胚胎中(W0 2001/29204)。然后將目的蛋白質(zhì)從發(fā)育中的幼蟲或成體昆蟲中純化。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)還已經(jīng)用于通過向干細胞引入轉(zhuǎn)座而遺傳修飾干細胞。 W02009/050657涉及使用轉(zhuǎn)座子-轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)產(chǎn)生遺傳修飾干細胞的方法。在干細胞中表達的轉(zhuǎn)基因是標記基因，例如處于在干細胞和分化細胞內(nèi)均為組成型的啟動子控制下的 GFP。在WO 2009/071334中，描述了使用通過轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)修飾的精原干細胞產(chǎn)生敲除或者轉(zhuǎn)基因動物模型的方法。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，編碼促成細胞中產(chǎn)生生物活性分泌性化合物的多肽的核酸已經(jīng)通過使用Slewing Beauty(SB)轉(zhuǎn)座酶插入至染色體中。更優(yōu)選地，SB轉(zhuǎn)座酶是高活性轉(zhuǎn)座酶，如在WO 2009/003671中所述。高活性轉(zhuǎn)座酶包括選自包含與SEQ ID NO 7有1至20個氨基酸不同的SB 10X變體的Sle印ing Beauty變體，包括選自下列的突變或突變組的至少一種-K14R ；-Kl 3D ；
13
-K13A ；
-K30R ；
-K33A ；
-T83A ；
-1100L ；
-Rl15H ；
-R143L ；
-R147E ；
-A205K/H207V/K208R/D210E ；
-H207V/K208R/D210E ；
-R214D/K215A/E216V/N217Q ；
-M243H ；
-M243Q ；
-E267D ；
-T314N ；和
-G317E.
特別的，優(yōu)選的SB變體包含至少下列的突變組合
-變體 1 K14R//R214D/K215A/E216V/N217Q ；
-變體 2 K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；
-變體3
K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；
-變體 4 :K13D/K33A/T83A//H207V/K208R/D210E//M243Q ；
-變體 5 K13A/K33A//R214D/K215A/E216V/N217Q
-變體 6 K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q//G317E ；
-變體 7 :K14R/T83A/M243Q ；
-變體 8 :K14R/T83A/1100L/M243Q ；
-變體 9 :K14R/T83A/R143L/M243Q ；
-變體 10 :K14R/T83A/R147E/M243Q ；
-變體 11 :K14R/T83A/M243Q/E267D ；
-變體 12 :K14R/T83A/M243Q/T314N ；
-變體13
K14R/K30R/I100I7/A205K/H207V/K208R/D210E//'R214D/K215A//E216V/,N217Q//M243H ；
-變體14
K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//'R214D/K215A//E216V/,N217Q//M243H ；
-變體15
K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//'R214D/K215A//E216V/,N217Q//M243H ；
14
-變體 16:K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/ E267D ；-變體 17:K14R/K30R/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/ T314N ；-變體 18:K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/ G317E ；-變體 19 K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；-變體 20:K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/T314N ；-變體 21:K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/E267D ；-變體 22:K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/T314N ；-變體 23:K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/G317E ；
0127]-變體24K14R/K33A/R115H/R143L//R214D/K215A/E216V/N217Q///M243H ；0128]-變體25K14R/K3 3A/R115H/R147E//R214D/K215A/E216V/N217Q///M243H ；0129]-變體26K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H//E267D ；0130]-變體27K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H//T314N ；0131]-變體28K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H//G317E ；0132]-變體29:K14R/T83A/M243Q/G317E ；0133]-變體30K13A/K3 3A/T8 3A//R214D/K215A/E216V/N217Q0134]優(yōu)選地選自0135]-變體1K14R/R214D//K215A/E216V/N217Q ；0136]-變體2K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；0137]-變體30138]K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H0139]-變體4K13D/K33A/T83A//H207V/K208R/D210E//M243Q ；0140]-變體5K13A/K33A//R214D/K215A/E216V/N217Q ；0141]-變體6K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q//G317E ；0142]-變體7K14R/T83A/M243Q ；0143]-變體8K14R/T83A/1100L7M243Q ；0144]-變體9K14R/T83A/R143L/M243Q ；
-變體10 :K14R/T83A/R147E/M243Q ；-變體11 :K14R/T83A/M243Q/E267D ；-變體12 :K14R/T83A/M243Q/T314N ；-變體 14:K14R/K30R/R14317/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216/N217Q// M243H ；-變體 15:K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H ；-變體 16:K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/ E267D ；-變體 17:K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/ T314N ；-變體 18:K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/ G317E ；-變體19 K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；-變體 20:K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/T314N ；-變體 21:K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/E267D ；-變體 23:K14R/K30R/R14317/A205K/H207V/K20RR/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/G317E ；-變體24 :K14R/K33A/R115H/R143L//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；-變體25 :K14R/K33A/R115H/R147E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；-變體26 :K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D ；-變體27 K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N ；-變體28 K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E ；更優(yōu)選地選自-變體2 :K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；-變體3 K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；-變體 14:K14R/K30R/R143IJ/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；-變體 15:K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H ；-變體 16:K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/ E267D ；-變體19 K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H ；-變體 20:K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243HAT314N ；-變體 21:K14R/K30R/R143L7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/E267D ；-變體 23:K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q// M243H/G317E ；
0187]-變體24:K14R/,K33A,ZRl15H/'R143L//R214D/K215A/E216V/,N217Q///M243H ；0188]-變體25:K14R/,K33A,ZRl15H/'R147E//R214D/K215A/E216V/,N217Q///M243H ；0189]-變體26:K14R/,K33A,ZRl15H/VR214D/K215A/E216V/N217Q/VM243H//E267D ；0190]-變體27:K14R/,K33A,ZRl15H/VR214D/K215A/E216V/N217Q/VM243H//T314N ；0191]-變體28:K14R/,K33A,ZRl15H/VR214D/K215A/E216V/N217Q/VM243H/,G317E。在最優(yōu)選的實施方案中，高活性SB是變體27，其具有如SEQ ID NO 8中所示氨基酸序列。膠囊化細胞治療膠囊化細胞生物遞送治療基于這樣的一種概念，即通過在植入到宿主內(nèi)之前以半滲透性生物相容性材料包繞細胞將細胞與接受體宿主的免疫系統(tǒng)隔離開。本發(fā)明包括其中細胞被包于免疫隔離性膠囊中的裝置。通過將細胞包裝入由微孔膜形成的可植入聚合物膠囊中，將細胞與宿主免疫隔離。該方法防止了宿主與所植入組織間的細胞與細胞接觸，消除通過直接提呈的抗原識別。細胞膠囊，以下稱作膠囊，具有特定的膜以控制分子例如生長因子激素、神經(jīng)遞質(zhì)、肽、抗體和補體基于它們的分子量的擴散(Lysaght等，56J. Cell Biochem. 196 (1996)， Colton, 14Trends Biotechnol. 158(1996))。使用膠囊化技術，可將細胞移植入宿主內(nèi)，而沒有免疫排斥，或者使用或者不使用免疫抑制藥物。有用的生物相容性聚合物膠囊通常包含含有細胞的核，細胞或者懸浮在液體介質(zhì)中或者固定在基質(zhì)內(nèi)，和不包含所分離細胞的選擇性滲透基質(zhì)或膜的周圍或外周區(qū)(“套”)，套是生物相容性的并且足以保護核內(nèi)的細胞不受有害的免疫攻擊。膠囊化阻止免疫系統(tǒng)成分進入膠囊，由此保護膠囊化細胞不被免疫破壞。膠囊膜的半滲透性性質(zhì)還阻止目的生物活性分子容易地從膠囊中擴散到周圍宿主組織中并允許營養(yǎng)物容易地擴散進入膠囊中并支持膠囊化細胞。膠囊可由生物相容性材料制成?！吧锵嗳菪圆牧稀笔沁@樣的材料，即在植入宿主后不引起足以導致排斥膠囊或例如通過降解使其不起作用的有害宿主反應。生物相容性材料對大分子，例如宿主免疫系統(tǒng)成分相對不通透，但是對小分子例如胰島素、生長因子和營養(yǎng)物是可滲透性的，同時允許去除代謝廢物。多種生物相容性材料適宜通過本發(fā)明的組成遞送生長因子。已知具有不同外表面形態(tài)和其它機械和結(jié)構特征的多種生物相容性材料。優(yōu)選地，本發(fā)明的膠囊將與通過參考并入本文的WO 92/19195或WO 95/05452 ；或通過參考并入本文美國專利號5，639，275 ； 5，653，975 ；4，892，538 ；5，156，844 ；5，283，187 ；或美國專利號 5，550，050 中描述的那些相似。此類膠囊允許代謝物、營養(yǎng)物和治療物質(zhì)通過，而使宿主免疫系統(tǒng)的不利作用最小化。 生物相容性材料的構成可包括外周的半滲透性膜和內(nèi)部的支持細胞的支架。優(yōu)選地，重組細胞置于支架上，其被選擇性滲透膜膠囊化。絲狀的細胞支持支架可由選自丙烯酸、聚酯、 聚乙烯、聚丙烯聚乙腈、聚對苯二甲酸乙二醇酯、尼龍、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚丁烯酯、 絲、棉、甲殼質(zhì)、碳或生物相容性金屬的任何生物相容性材料制成。并且，粘合的纖維結(jié)構可用于細胞植入(美國專利號5，512，600，通過參考并入本文)。生物可降解聚合物包括由聚 (乳酸)PLA、聚(乳酸共羥乙酸)PLGA和聚(羥乙酸)PGA及其等效物組成的那些。泡沫支架已經(jīng)用于提供所移植細胞可粘附其上的表面(W0 98/05304，通過參考并入本文)。編織網(wǎng)管已經(jīng)用作人造血管(W099/52573，通過參考并入本文)。另外，核可以由從水凝膠形成的固定介質(zhì)構成，核將細胞的位置穩(wěn)定。水凝膠是大部分由水組成的、凝膠形式的交聯(lián)親水聚合物的三維網(wǎng)絡。套優(yōu)選地具有如小于1000kD、更優(yōu)選50_700kD之間、更優(yōu)選70_300kD之間、更優(yōu)選70-150kD之間，例如70和130kD之間的該分子量所限定的分子量截留值，其中膜(套) 將排斥90 %的溶質(zhì)。分子量截留值應當可選擇以保證生物活性分子逃離膠囊同時保護膠囊化細胞不被患者的免疫系統(tǒng)破壞。套的厚度有代表性地在2至200微米，更優(yōu)選從50至150微米范圍內(nèi)。套應該具有給予膠囊足夠強度以保持細胞膠囊化的厚度，并且記住應當盡可能薄以占據(jù)盡可能小的空間。多種聚合物和聚合物混合物可以用于制造周圍的半滲透性膜，包括聚丙烯酸酯 (包括丙烯酸共聚物)、聚偏二乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚酰胺、乙酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷腈、聚丙烯腈、聚(丙烯腈/共氯乙烯) 以及它們的衍生物、共聚物和混合物。優(yōu)選地，周圍的半滲透性膜是生物相容性半滲透性中空纖維膜。此類膜以及制造它們的方法公開于美國專利號5，284，761和5，158，881中，該兩篇文獻通過參考并入本文。周圍的半滲透性膜可以從聚醚砜中空纖維，例如美國專利號 4，976，859或美國專利號4，968，733中描述的那些形成，該兩篇文獻通過參考并入本文?？商娲闹車陌霛B透性膜材料是聚(丙烯腈/共氯乙烯)(Pan-PVC)。膠囊可以是適宜保持生物學活性和提供產(chǎn)品遞送或功能通路的任何形狀，包括例如圓柱形、矩形、圓盤形、片形、卵圓形、星形或球形。此外，膠囊可以卷曲或纏繞于網(wǎng)樣或巢結(jié)構中。如果打算在膠囊植入后還取回膠囊，則傾向于導致膠囊從植入部位移走的形狀，例如足夠小以致于在受體宿主血管中移行的球形膠囊不是優(yōu)選的。某些形狀例如矩形、片形、 圓盤形、圓柱形和扁片提供更大的結(jié)構完整性并且在希望取回的情況下是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的形狀是圓柱形，因為此形狀容易地從中空纖維產(chǎn)生，這可以工業(yè)化生產(chǎn)。
在本發(fā)明中，大膠囊是體積具有至少1 μ L，例如從1至10 μ L的膠囊。當使用大膠囊時，在每一裝置中優(yōu)選至少IO3個細胞被膠囊化，例如IO3和IO8個之間的細胞被膠囊化，最優(yōu)選IO5至IO7個細胞被膠囊化。當然，每一膠囊中的細胞數(shù)量取決于膠囊大小。根據(jù)經(jīng)驗，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在具有泡沫的膠囊中(下面描述)，每yL膠囊(體積計算為包括泡沫的內(nèi)體積)加載10，000和100，000個之間的細胞，更優(yōu)選每μ L 25，000至50，000個細胞，更優(yōu)選每μ L30, 000至40，000個細胞使膠囊填充良好?？杉虞d的細胞數(shù)量還取決于細胞大小?？赏ㄟ^改變膠囊的尺寸(長度，直徑)和/或通過植入更少或更多數(shù)量的膠囊，優(yōu)選每個患者1和10個之間的膠囊來控制劑量。支架可用細胞外基質(zhì)(ECM)分子包被。細胞外基質(zhì)分子的適宜實例包括，例如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白。支架表面還可以如下修飾，即用等離子體輻射處理使其帶有電荷以增強細胞粘附。任何適宜的封閉膠囊的方法可以使用，包括使用聚合物粘合劑或褶形、結(jié)節(jié)或熱封。此外，還可使用任何適宜的“干”封，如例如美國專利號5，653，687中所描述，該文獻通過參考并入本文。根據(jù)已知技術植入膠囊化細胞裝置。許多植入部位考慮用于本發(fā)明的裝置和方法。這些植入部位包括但不限于，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦、脊髓(見美國專利號5，106，627， 5，156，844和5，554，148，通過參考并入本文)，和眼睛的水性體液和玻璃體液(見WO 97/34586，通過參考并入本文)。所公開的膠囊可包括從膠囊延伸出來的完整拴繩，并且其足夠長以致于至少從治療部位到達接近插入部位，由此利于將膠囊固定在插入部位，例如固定在皮膚外表面。插入部位隨后用皮膚覆蓋。為了便于從組織中移出膠囊，例如當治療結(jié)束時，或者如果必須替換膠囊，膠囊和拴繩之間的過渡應當是平滑的并且沒有任何類型的突出，或者尺寸從膠囊向著拴繩方向增加。明顯的，這在兩部分之間產(chǎn)生了邊緣，但是由于相對小的膠囊形成治療系統(tǒng)的遠端，即朝向身體的末端，在移出膠囊的過程中防止輔助傷害。如果膠囊和拴繩是橫截面為圓形的管，則膠囊的半徑大小優(yōu)選小于栓繩的半徑大小，并且膠囊和栓繩可優(yōu)選彼此同軸連接。優(yōu)選地，本發(fā)明的膠囊在設計上將與WO 2006/122551中所述相似。膠囊可通過使用注射器填充，或者備選地可使用如W02007/048413 (通過參考并入本文)中所述的自動或半自動填充。泡沫支架泡沫支架可從任何適宜的材料形成，所述材料形成帶有開室或帶有孔網(wǎng)絡的大孔結(jié)構的生物相容性泡沫。開室泡沫是互聯(lián)孔的網(wǎng)狀結(jié)構。泡沫支架提供非生物降解性的穩(wěn)定的支架材料，這使得貼壁細胞附著。在用于形成用于本發(fā)明裝置的泡沫支架的聚合物當中有熱塑性塑料和熱塑性彈性體。用于形成適宜泡沫支架的材料的一些實例列于表3。表3熱塑性塑料熱塑性彈性體丙烯酸聚酰胺
19
變性腈綸聚酯聚酰胺聚乙烯聚碳酸酯聚丙烯聚酯聚苯乙烯聚乙烯聚氨基甲酸酯聚丙烯聚乙烯醇聚苯乙烯硅酮聚砜聚醚砜聚偏二氟乙烯由聚砜和聚醚砜制造的熱塑性塑料泡沫支架，和由聚氨基甲酸酯和聚乙烯醇制造的熱塑性彈性體泡沫支架是優(yōu)選的。泡沫必須有一些(但不需全部)允許細胞粘附孔內(nèi)的壁或表面的大小的孔。泡沫支架的孔大小、孔密度和外水體積可變?？仔螤羁梢允菆A形、橢圓形或不規(guī)則。由于孔形狀可以相當大地變化，其尺寸可根據(jù)所測量的軸而改變。為了本發(fā)明的目的，泡沫中至少一些孔應該具有20-500 μ m之間，優(yōu)選50-150 μ m之間的孔徑。優(yōu)選地，上述尺寸代表著泡沫的孔大小。如果是非圓形的，孔可以具有可變的尺寸，只要其大小足以允許粘附細胞貼附到孔內(nèi)的壁或表面即可。在一個實施方案中，考慮了具有一些橢圓形孔的泡沫，橢圓形的孔沿著短軸具有20-500 μ m的直徑并且沿著長軸具有最多達1500 μ m的直徑。除了上述的細胞許可的孔大小外，優(yōu)選地泡沫中至少部分孔應該小于10 μ m以便不允許細胞透出，但是仍然提供營養(yǎng)物和生物活性分子在整個泡沫內(nèi)運輸?shù)耐ǖ馈Ｅ菽目酌芏?即，每體積中可以容納細胞的孔數(shù)量，如上所述)可以在20-90% 之間，優(yōu)選50-70 %之間變化。類似地，泡沫的孔體積可以在20-90%之間，優(yōu)選30-70%之間變化?？椎谋诨虮砻婵梢杂靡环N或多種細胞外基質(zhì)分子或其它適宜分子包被。該包衣可以用于促進細胞粘附至孔的壁，容納特定表型的細胞和/或誘導細胞分化?？梢哉掣街僚菽變?nèi)表面的細胞外基質(zhì)分子(ECM)的優(yōu)選實例包括膠原、層粘連蛋白、玻連蛋白、聚鳥氨酸和纖連蛋白。其它適宜的ECM分子包括葡糖氨基聚糖和蛋白聚糖；例如硫酸軟骨素，硫酸肝素、透明質(zhì)酸、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、類肝素硫酸蛋白聚糖 (HSPG)和彈性蛋白。ECM可以通過培養(yǎng)已知儲存ECM的細胞得到，包括間質(zhì)或星形膠質(zhì)細胞來源的細胞。當用抗壞血酸鹽和cAMP處理時，可誘導^Awann細胞合成ECM。見例如Baron-Van Evercooren 等，“S chwann Cell Differentiation in vitro :Extracellular Matrix Deposition and Interaction, " Dev.Neurosci. ,8, pp.182-96(1986)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)粘附肽片段，例如包含RGD的序列(ArgGlyAsp)，包含YIGSR的序列(TyrIIeGlykrArg)，以及包含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal)，可用于促進細胞附著。 一些包含RGD的分子是商業(yè)可得的-例如P印Tite-2000. TM. (Telios)。本發(fā)明的泡沫支架還可用增加裝置內(nèi)細胞分布的其它材料處理。例如，泡沫的孔可用抑制細胞增殖或遷移的非許可性水凝膠填充。此類修飾可改善粘附細胞對泡沫支架的附著。適宜的水凝膠包括因為帶電荷而排斥細胞的陰離子水凝膠(例如藻酸鹽或鹿角菜膠)。備選地，“固體”水凝膠(例如瓊脂糖或聚環(huán)氧乙烷)也可以用于通過阻礙細胞所分泌細胞外基質(zhì)分子的結(jié)合而抑制細胞增殖。泡沫支架區(qū)域以非許可材料處理使得在裝置內(nèi)包封兩種或更多種不同的細胞群， 而不會一個群體比另一種過度生長。如此的非許可材料可用于泡沫支架中以分隔開不同的膠囊化細胞群。不同的細胞群可以是相同或不同的細胞類型，并且可以產(chǎn)生相同或不同的生物活性分子。在一個實施方案中，一個細胞群產(chǎn)生促進其它細胞群生長和/或存活的物質(zhì)。在另一實施方案中，產(chǎn)生多個生物活性分子的多個細胞類型被膠囊化。這向受體提供了治療物質(zhì)的混合物或“cocktail”。本發(fā)明的裝置可以按照任何適宜方法形成。在一個實施方案中，泡沫支架可以作為單獨的元件預先形成并且插入到預加工的套，例如中空纖維膜中。任何適宜的熱塑性塑料或熱塑性彈性體泡沫支架材料可以預先形成用于插入到預加工的套內(nèi)。在一個實施方案中，我們優(yōu)選聚乙烯醇(PVA)海綿用作泡沫支架。數(shù)種PVA海綿是商業(yè)可得的。例如，PVA泡沫海綿#0-3，60μπι孔大小是適宜的 (Rippey Corp，Kanebo)。類似地，PVA 海綿可以從 Ivalon Inc. (San Diego，Cailf.)和 Hydrofera(Cleveland, Ohio)商業(yè)性得到。PVA海綿是水不溶性泡沫，它是通過充氣聚(乙烯醇)溶液與作為交聯(lián)劑的氣態(tài)甲醛反應形成。PVA上的羥基與醛基共價交聯(lián)形成聚合物網(wǎng)絡。當泡沫浸濕時是能彎曲的和彈性的并且當干燥時是半剛性的。作為備選，如US 6，627，422中所述可以使用支持網(wǎng)或紗。用于形成紗或網(wǎng)的內(nèi)部支架的絲由任何適宜的生物相同的基本上不可降解的材料形成。用于形成紗或編網(wǎng)的材料包括能夠形成纖維的任何生物相容性性聚合物，例如丙烯酸、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚對苯二甲酸乙二酯、尼龍、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、 聚丁烯酯、或者天然纖維例如棉、絲、甲殼質(zhì)或碳。任何適宜的熱塑性塑料聚合物、熱塑性彈性體或具有形成纖維特性的其它合成或天然材料可插入到預加工中空纖維膜或由扁膜片形成的中空圓柱中。例如，用于縫合材料或者用于制造人造血管的絲、PET或尼龍絲對于該類型的應用是高度有益的。在另外的實施方案中，金屬條或絲可用于編織。這些絲材料的每一種具有良好可控表面和幾何學特性，可以大批量生產(chǎn)，并且具有悠久的植入使用歷史。 在某些實施方案中，可將絲“編織”成提供細胞突出物可附著的粗糙表面和“爪手”。絲可用細胞外基質(zhì)分子包被或表面處理(例如等離子體輻射或者NaOH或KOH侵蝕)以增強細胞對絲的粘附。在一個實施方案中，優(yōu)選以非隨機單向定位組織的絲擰成束以形成不同厚度和外水體積的紗。外水體積定義為絲與絲之間存在的空隙。紗內(nèi)的外水體積應在20-95%之間變化，但優(yōu)選50-95 %之間變化。優(yōu)選的絲與絲之間的空隙空間在20-200 μ m之間，這足以使細胞沿著紗的長度放置在支架上，并且允許細胞粘附至絲上。包含絲的紗的優(yōu)選直徑在 5-100 μ m之間。這些絲應具有足夠的機械強度以擰成束并形成紗。絲的橫斷面形狀可變， 優(yōu)選為圓形、矩形、橢圓形、三角形和星形橫截面。在另一實施方案中，將絲或紗編織成網(wǎng)。可以在使用類似于線軸的包含單絲或復絲的運載器的縫辨機上生產(chǎn)網(wǎng)，在編織過程中運載器用于供給紗或絲成為網(wǎng)。運載器的數(shù)量是可調(diào)的并且可以纏繞相同的絲或者具有不同成分和結(jié)構的絲的組合。由經(jīng)緯密度限定的編織角通過運載器的旋轉(zhuǎn)速度和生產(chǎn)速度控制。在一個實施方案中，芯棒用于生產(chǎn)網(wǎng)的中空管。在某些實施方案中，編織成一層，在另外的實施方案中編織成多層結(jié)構。編織的拉伸強度是各個絲拉伸強度的線性總和。用于本發(fā)明的適宜的單絲的實例在US 6，627，422中可找到。一個實例是編織成辮的PET紗。該PET辮由34股，44旦復絲紗用16運載器的縫辨機以每英寸20交叉數(shù)(ppi) 的經(jīng)緯密度在760μπι O.D.芯棒上編織形成。PET紗還可用于非編織股。另一實例是尼龍單絲編織成辮。該尼龍辮由13股，40旦復絲紗用16運載器縫辨機以ISppi的經(jīng)緯密度在 760 μ m O.D.芯棒上編織而成。更多的實例包括不銹鋼復絲編織成辮。該不銹鋼辮由帶子用16運載器縫辨機以90ppi的經(jīng)緯密度在of 90ppi900ym 0. D.芯棒上編織而成。這些 PET、尼龍和不銹鋼辮的拉伸強度分別為2. 7,2. 4和3. 6kg拉斷力。在一個實施方案中，構建了管狀辮。在另外的實施方案中，將辮插入到中空纖維膜中。在更多的實施方案中，細胞置于中空纖維膜上。在另外的實施方案中，允許細胞滲過網(wǎng)管的壁以將細胞附著可用的表面積最大化。在該實施方案中，辮起著細胞支架基質(zhì)和裝置的內(nèi)部支持體兩種作用。辮支持的裝置的拉伸強度的增加顯著高于備選方法。細胞系許多不同的細胞系可以被膠囊化于本發(fā)明的裝置內(nèi)。這些細胞包括眾所周知的可公開得到的永生化細胞系、自發(fā)永生化細胞系以及分裂的原代細胞培養(yǎng)物。由于在一些實施方案中細胞系將要被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導，不得不將克隆進行選擇、擴大和儲存于細胞庫，所以優(yōu)選能夠經(jīng)歷明顯次數(shù)分裂的細胞或細胞系。具有長期增殖潛能的細胞系可以從很多種細胞產(chǎn)生，包括祖細胞和/或前體細胞。干細胞也是適宜的，包括多潛能和多能干細胞、胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞和造血干細胞。細胞系實例包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO) ；CHO-Kl ；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠成纖維細胞-3T3細胞；非洲綠猴細胞系(包括C0S-1，C0S-7，BSC-I，BSC-40，BMT-10和Vero)； 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12和PC12A) ；AT3，大鼠神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤(C6)；大鼠神經(jīng)元細胞系 RN33b ；大鼠海馬細胞系HiB5 ；生長因子擴增的干細胞；EGF-反應性神經(jīng)球；衍生自哺乳動物 CNS 的 bFGF-反應性神經(jīng)前體干細胞[Richards 等，PNAS 89:8591-8595(1992) ；Ray 等， PNAS90 :3602-3606(1993)]；胎兒細胞；原代成纖維細胞fchwann細胞；星形細胞；β-TC 細胞；Hep-G2紋狀體細胞；少突膠質(zhì)細胞及其前體；小鼠成肌細胞-C2C12 ；人神經(jīng)膠質(zhì)來源的細胞_Hs683 ；人神經(jīng)膠質(zhì)來源的細胞-A172 ；HEI193T ；豬成膠質(zhì)細胞；神經(jīng)元細胞；神經(jīng)元；星形細胞；中間神經(jīng)元；從人長骨分離的成軟骨細胞；人胚腎細胞HEK293 ；HeLa ；兔角膜來源的細胞(SIRC) ；ARPE-19和CAC細胞。對于哺乳動物重組生產(chǎn)優(yōu)選的細胞系包括CHO、CHO-U HEI193T、HEK293、COS、 PC12、HiB5、RN33b 和 BHK 細胞。本發(fā)明還考慮了在同一裝置中將兩種或更多種單獨轉(zhuǎn)染的細胞或細胞系膠囊化， 每一細胞系分泌至少一種想要的分子。此外，本發(fā)明考慮了將以一種以上表達構建體，例如本發(fā)明的兩種或更多種表達構建體轉(zhuǎn)染的一種細胞系膠囊化。備選地，可以植入單獨產(chǎn)生每一分子的單獨的裝置?？蓪⒃S多不同細胞類型膠囊化于根據(jù)本發(fā)明的裝置中。這些細胞包括眾所周知的可公開得到的永生化細胞系、自發(fā)永生化細胞系以及分裂的原代細胞培養(yǎng)物。由于在一些實施方案中細胞系將要被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導，不得不將克隆進行選擇、擴大和儲存于細胞庫，所以優(yōu)選能夠經(jīng)歷明顯次數(shù)分裂的細胞或細胞系。細胞的選擇依賴于預期應用。細胞可以天然產(chǎn)生想要的生物活性分子或者可以經(jīng)遺傳修飾而產(chǎn)生想要的活性分子。在優(yōu)選的實施方案中，細胞是人來源的以便降低在人受體中免疫反應的風險。即便細胞被膠囊化于半滲透性膜后面，非人細胞系固有地產(chǎn)生非人蛋白質(zhì)和代謝物，其雖然以低水平分泌但是會在人宿主中觸發(fā)免疫反應。在植入到非人哺乳動物中的情況下，優(yōu)選細胞與待植入膠囊的哺乳動物同一物種。在最廣的方面中，這包括任何的人細胞培養(yǎng)物或細胞系，不管是多克隆的還是單克隆的。單克隆細胞系是更優(yōu)選的，因為它們可以更好地表征。人細胞系可以是已經(jīng)通過插入異源性永生化基因而永生化的，它們可以是自發(fā)永生化的，或者它們可以是生長因子擴增的原代細胞或干細胞。對于間接體內(nèi)基因治療，優(yōu)選的細胞組包括神經(jīng)元細胞、神經(jīng)元前體細胞、神經(jīng)元祖細胞、成纖維細胞、造血細胞、造血干細胞、干細胞、胎兒細胞和胚胎干細胞。在一個實施方案中，細胞不是胚胎干細胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，人細胞系沒有通過插入異源永生化基因而永生化。 由于本發(fā)明涉及特別適用于細胞移植的細胞，不管是作為裸細胞或者優(yōu)選作為膠囊化細胞，此類永生化細胞系的優(yōu)選性差，因為如果它們攜帶已知癌基因的話，則存在它們以不受控方式在人體內(nèi)開始增殖并潛在形成腫瘤的風險。優(yōu)選地，細胞系能夠吞噬。通過吞噬作用細胞能夠清除裝置內(nèi)由衰退或瀕死細胞所脫落的碎片。優(yōu)選地，細胞系是接觸抑制的細胞系或者可以在膠囊內(nèi)分化的細胞系，例如干細胞。接觸抑制細胞系旨在指當在2-D培養(yǎng)中生長至匯合然后基本停止分裂的細胞系。這不排除有限數(shù)量的細胞逃脫2D層的可能性。接觸抑制細胞還可以在3D中生長，例如在膠囊內(nèi)。同樣，在膠囊內(nèi)，細胞生長至匯合然后顯著降低增殖率或者完全停止分裂。特別優(yōu)選類型的細胞包括在培養(yǎng)中因為它們的特性而接觸抑制并形成穩(wěn)定單層的上皮細胞。甚至更優(yōu)選的是視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE細胞)。RPE細胞的來源是通過從哺乳動物視網(wǎng)膜的原代細胞分離。收獲RPE細胞的方法明確定義(Li和Turner，1988， Exp. Eye Res. 47 :911-917 ；Lopez 等，1989，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 :586-588)并且認為是常規(guī)方法學。在大多數(shù)的RPE細胞共移植的公布報導中，細胞來源于大鼠(Li和 Turner, 1988 ；Lopez等，1989)。根據(jù)本發(fā)明，RPE細胞來源于人。除了分離的原代RPE細胞之外，培養(yǎng)的人RPE細胞系可用于實施本發(fā)明。所有正常的二倍體脊椎動物細胞具有有限的增殖能力，這是稱作Hayflick極限或細胞復制性衰老的現(xiàn)象。在人成纖維細胞中，該限制在50-80次群體倍增數(shù)后出現(xiàn)，之后細胞維持有活力但不分裂的衰老狀態(tài)許多月。這與大多數(shù)癌細胞的行為形成對比，其中癌細胞逃脫了限制其增殖能力的控制并且是有效的永生化。優(yōu)選細胞能夠經(jīng)歷一定數(shù)量的細胞分裂，因為它們可以被遺傳修飾和擴增以產(chǎn)生用于膠囊化細胞治療或移植治療的足夠細胞。因此，優(yōu)選的細胞系能夠經(jīng)歷至少50次倍增，更優(yōu)選至少60次倍增，更優(yōu)選至少70次倍增，更優(yōu)選至少80次倍增，更優(yōu)選至少90次
23倍增，例如大約100次倍增。對于膠囊化，細胞優(yōu)選地能夠在人體的低氧分壓水平上，例如在CNS內(nèi)存活并保持分泌治療分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞系能夠在低于5%，更優(yōu)選低于2%，更優(yōu)選低于
的氧分壓下存活。氧分壓對應于腦中的氧水平。用于膠囊化細胞生物遞送的細胞系應當具有盡可能多的下列特性(1)在應急條件下細胞應當是強壯的(膠囊化細胞應當是在血管和無血管組織腔內(nèi)，例如在腦實質(zhì)內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)或者心室內(nèi)或鞘內(nèi)流體間隙或者眼睛內(nèi)，特別是眼內(nèi)環(huán)境中是有功能的)。 (2)細胞應該能夠被遺傳修飾以表達治療分子。( 細胞應該能夠經(jīng)歷相對高數(shù)量的分裂并且具有相對長的壽命(細胞應當產(chǎn)生足夠的后代以便存入細胞庫、表征、工程改造、安全測試和臨床批量制造)。(4)細胞必須是人來源的(這增加了膠囊化細胞和宿主之間的相容性)。( 細胞應當表現(xiàn)出在裝置內(nèi)體內(nèi)具有大于80%的生存力超過1個月(這保證了長期遞送)。(6)膠囊化細胞應當遞送有效量的治療分子(這保證了治療的有效性)。(7) 當膠囊化時，細胞不應當引起明顯的宿主免疫反應(這保證了移植物的壽命)。(8)細胞應當是非致瘤性的(在裝置滲漏情況下為宿主提供額外的安全性)。在篩選和表征數(shù)個細胞系過程中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ARPE-19細胞系(Durm等，62Exp. Eye Res.155-69 (1996)， Dunn 等，39Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. 2744-9(1998)， Finnemann 等，94Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12932-7(1997)，Handa 等，66Exp. Eye. 411-9 (1998)， Holtkamp 等，112Clin. Exp. Immunol. 34-43(1998)，Maidji 等，70J. Virol. 8402-10(1996)) 具有用于基于膠囊化細胞的遞送系統(tǒng)的成功的平臺細胞的所有特征(US 6，361，771，Tao 等)。ARPE-19細胞系優(yōu)于所測試的其它細胞系。ARPE-19細胞系從美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到(ATCC號CRL-2302)。ARPE-19 細胞系來源于正常視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞的培養(yǎng)物并且表達視網(wǎng)膜色素上皮細胞特異性標志物CRALBP和RPE-65。ARPE-19細胞形成穩(wěn)定的單層，其表現(xiàn)出形態(tài)和功能極性。 ARPE-19細胞可以在完全生長培養(yǎng)基中，即細胞保存機構推薦的包含血清的培養(yǎng)基中生長。 完全生長培養(yǎng)基或者是含有90%的3mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清的Dulbecco改良fegle 培養(yǎng)基與Ham' sF12培養(yǎng)基的1 1混合物或者是含有包含10%胎牛血清、56mM終濃度碳酸氫鈉和2mM L-谷氨酰胺的HEPES緩沖液的Dulbecco改良fegle培養(yǎng)基與Ham' sF12 培養(yǎng)基的1 1混合物。細胞優(yōu)選在37°C、5%C02T培養(yǎng)。細胞有代表性地鋪于并生長于 Falcon組織培養(yǎng)基處理的6孔或12孔板中或T25或T75瓶中。對于傳代培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基，并且優(yōu)選用0. 05 %胰蛋白酶，0. 02 % EDTA溶液漂洗ARPE-19細胞，并且去除胰蛋白酶。 加入1至2ml的另外的胰蛋白酶溶液。培養(yǎng)物在室溫下(或者37°C下)孵育直到ARPE-19 細胞脫落。推薦1 3至1 5的傳代率?？梢允褂孟铝械娜胶Y選法測試用于膠囊化細胞治療的候選細胞的抵抗性。(a) 細胞生存力篩選(可以在使用人造水性體液(aAH)培養(yǎng)基或者人造腦脊髓液(aCSF)培養(yǎng)基的應激條件下評價細胞)。(b)體外ECM篩選(可以在體外的細胞外基質(zhì)(ECM)篩選中評價細胞)。(c)體內(nèi)裝置生存力篩選(可以在體內(nèi)膜篩選中評價膠囊化細胞)。使用數(shù)種人和非人細胞系進行的篩選和結(jié)果的詳細描述在US 6，361，771中找到(通過參考并入本文)。在上述的三種類型篩選中，證明ARPE-19優(yōu)于所測試的許多其它細胞系(見US6，361，771)。特別地，應當注意到，在當前技術水平中已經(jīng)用于分泌NGF的BHK細胞沒有通過細胞生存力篩選。在另一實施方案中，細胞系選自人永生化成纖維細胞系、人永生化間質(zhì)干細胞系、人永生化星形膠質(zhì)細胞系、人永生化中腦細胞系和人永生化內(nèi)皮細胞系，優(yōu)選以SV40T、 vmyc或端粒酶催化亞基(TERT)永生化。根據(jù)本發(fā)明的另一類型的優(yōu)選人細胞是永生化人星形膠質(zhì)細胞系。用于產(chǎn)生永生化人星形膠質(zhì)細胞系的方法先前已經(jīng)描述(Price TN,Burke JF,Mayne LV. A novel human astrocyte cell line (A735)with astrocyte-specific neurotransmitter function. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999May ；35 (5) :279-88.)。該方法可以用于產(chǎn)生星形膠質(zhì)細胞系。優(yōu)選對該方法做如下三種修改以產(chǎn)生另外的人星形膠質(zhì)細胞系?？梢允褂脧?-12周齡胎兒切下的人胎兒腦組織代替12-16周齡組織?？梢允褂糜郎騰-myc代替SV40T抗原?？梢允褂媚孓D(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移代替通過常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(包括磷酸鈣沉淀)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。生長因子擴增的細胞系具有依賴于所加入的促分裂原而連續(xù)增殖的優(yōu)勢。因此在將細胞填充至裝置內(nèi)之前或同時撤掉促分裂原，則細胞停止增殖并且在植入至人體內(nèi)后不再增殖。一些生長因子擴增的細胞系還可在撤掉促分裂原時分化。生長因子擴增的細胞系包括干細胞，例如神經(jīng)干細胞和胚胎干細胞。控制細胞在膠囊化裝置內(nèi)分布的方法也已經(jīng)討論過。見例如美國專利號 5，795，790，其通過參考并入本文。將細胞接受抑制細胞增殖、促進細胞分化或者影響細胞附著至人工生物器官內(nèi)生長表面的處理。此類處理包括步驟(1)遺傳操作細胞，( 將細胞暴露于抑制增殖的化合物或者誘導分化的化合物下或者使細胞不暴露于刺激增殖的化合物或抑制分化的化合物下；使細胞暴露于輻射下，和(3)以細胞外基質(zhì)分子、影響細胞增殖或粘附的分子或者惰性支架或其組合修飾膠囊化裝置的生長表面。這些處理可以組合使用。在優(yōu)選的處理中，將細胞暴露于刺激增殖的和抑制分化的化合物下，然后在將細胞膠囊化于半滲透性生物相容性膜內(nèi)之前消除這種接觸。當膠囊化裝置體內(nèi)植入宿主內(nèi)時，細胞增殖被抑制并且細胞分化被促進。長期穩(wěn)定性優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞系當作為膠囊化細胞體內(nèi)移植時能夠存活達長時間(數(shù)月并最多達一年或更長)。細胞系優(yōu)選還能夠保持以足以保證治療功效的水平分泌生物活性化合物達超過一個月、優(yōu)選大于三個月、更優(yōu)選大于六個月的時間。還優(yōu)選細胞能夠在膠囊化后保持生物活性化合物的適當分泌達至少一個月、更優(yōu)選至少三個月、更優(yōu)選至少六個月。分泌水平優(yōu)選每106個細胞每M小時至少200ng生物活性生長因子，例如NGF， 更優(yōu)選至少225ng、更優(yōu)選至少250ng、更優(yōu)選至少275ng、更優(yōu)選至少300ng、更優(yōu)選至少 325ng、更優(yōu)選至少350ng、更優(yōu)選至少375ng、更優(yōu)選至少400ng、更優(yōu)選至少425ng、更優(yōu)選至少450ng、更優(yōu)選至少500ng、更優(yōu)選525ng、更優(yōu)選550ng、更優(yōu)選575ng、更優(yōu)選600ng、 更優(yōu)選625ng、更優(yōu)選650ng、更優(yōu)選675ng、更優(yōu)選700ng、更優(yōu)選725ng、更優(yōu)選750ng、優(yōu)選775ng、更優(yōu)選800ng。分泌水平優(yōu)選每106個細胞每M小時至少50ng生物活性神經(jīng)肽，例如甘丙肽， 更優(yōu)選至少lOOng、更優(yōu)選至少150ng、更優(yōu)選至少175ng、更優(yōu)選至少200ng、更優(yōu)選至少 225ng、更優(yōu)選至少250ng、更優(yōu)選至少275ng、更優(yōu)選至少300ng、更優(yōu)選至少325ng、更優(yōu)選至少350ng、更優(yōu)選至少400ng、更優(yōu)選425ng、更優(yōu)選450ng、更優(yōu)選475ng、更優(yōu)選500ng、 更優(yōu)選525ng、更優(yōu)選550ng、更優(yōu)選575ng、更優(yōu)選600ng、更優(yōu)選625ng、更優(yōu)選650ng、更優(yōu)選675ng、更優(yōu)選700ng、更優(yōu)選725ng、更優(yōu)選750ng、更優(yōu)選775ng、更優(yōu)選800ng、更優(yōu)選825ng、更優(yōu)選850ng、更優(yōu)選875ng、更優(yōu)選900ng、更優(yōu)選925ng、更優(yōu)選950ng。當在膠囊水平測量時，膠囊(包含膠囊化細胞)優(yōu)選能夠每M小時分泌超過20ng 生物活性化合物。更優(yōu)選地，每個裝置每M小時的生物活性化合物的量為至少25ng、更優(yōu)選至少30ng、更優(yōu)選至少40ng、更優(yōu)選至少50ng、更優(yōu)選至少60ng、更優(yōu)選至少70ng、更優(yōu)選至少80ng、更優(yōu)選至少90ng、更優(yōu)選至少lOOng、更優(yōu)選至少125ng、更優(yōu)選至少150ng、更優(yōu)選至少175ng、更優(yōu)選至少200ng。這些數(shù)字指的是具有500-700 μ m內(nèi)經(jīng)的5_7mm長的圓柱形裝置并且加載50000個細胞的情況。用于膠囊化的細胞的遺傳工程可將細胞進行遺傳改造以過表達治療分子。術語“遺傳修飾”和“遺傳工程”指通過有意引入外源DNA而穩(wěn)定或瞬時改變細胞基因型。DNA可以是合成的或天然來源的，并且可包含基因、基因部分或其它有用的DNA序列。術語“遺傳修飾”意思不包括天然存在的改變，例如通過天然病毒活性、天然遺傳重組等發(fā)生的那些。細胞的任何有用的遺傳修飾處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，細胞可以被修飾以產(chǎn)生生物活性物質(zhì)或者提高生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量，例如神經(jīng)遞質(zhì)或生長因子等。遺傳修飾可以通過用病毒載體(反轉(zhuǎn)錄病毒、修飾的皰疹病毒、皰疹病毒、腺病毒、腺伴隨病毒等等)感染或者使用本領域已知方法的轉(zhuǎn)染(lipofection、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔等等) $3 (JALManiatis^, in Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory,N. Y.，1982))。例如，嵌合基因構建體可包含病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復序列(LTR)、猴病毒40 (SV40)、巨細胞病毒(CMV)；或哺乳動物細胞特異性啟動子。此外，載體可以包括藥物選擇標記，例如大腸桿菌氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，當其與測試基因共感染時提供對遺傳霉素(G418)，即蛋白質(zhì)合成抑制劑的抵抗。使用表達載體的轉(zhuǎn)染可對細胞進行遺傳修飾。如本文所使用，術語“載體”指能夠轉(zhuǎn)運已經(jīng)與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)粒”，其指向其中可以連接額外DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接入病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入到的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。其它類型的載體(例如非附加體哺乳動物載體)當被引入到宿主細胞內(nèi)時整合入宿主細胞的基因組中，并且因此隨著宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導與其有效連接的基因表達。此類載體在本文中被稱作“表達載體”。通常，表達載體在重組DNA技術中的使用常常以質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括諸如此類形式的表達載體，例如病毒載體(例如復制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)，它們具有等效的功能。
在一個方案中，包含基因的載體DNA在0. lxTE(lmM Tris pH 8. 0,0. ImMEDTA)中稀釋成40 μ g/ml的濃度。將22 μ 1的DNA加入到一次性無菌5ml塑料管內(nèi)的250 μ 1的 2 倍 HBSQ80mM NaCl, IOmM KCl, 1. 5mM Nei2HPO4，12mM 右旋糖，50mM HEPES)中。緩慢加入 31 μ 1的2Μ CaCl2并將混合物室溫孵育30分鐘(min)。在該30min的孵育過程中，于4°C、 800g下離心細胞5min。將細胞重懸于20倍體積的冰冷PBS中并分成IxlO7個細胞的等分試樣，再次離心。每一等分試樣細胞重懸于Iml的DNA-CaCl2懸浮液中，并室溫孵育20min。 然后將細胞在生長培養(yǎng)基中稀釋并于37°C、5% -7% CO2下孵育6-Mhr。再次離心細胞、在 PBS中洗滌并且再溶于IOml的生長培養(yǎng)基中48hr。用于直接DNA、質(zhì)粒多核苷酸或重組載體施用的適宜媒介物包括但不限于鹽或蔗糖、魚精蛋白、聚凝膠、聚賴氨酸、聚陽離子、蛋白質(zhì)、磷酸鈣或精脒。見例如WO 94/01139。還可使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術遺傳修飾細胞。對于標準的磷酸鈣轉(zhuǎn)染，將細胞機械性打散成單細胞懸液并以50%的匯合度(50，000-75，000個細胞/cm2)鋪于組織培養(yǎng)物處理的培養(yǎng)皿中并使其粘附過夜。在一個方案中，如下開展改良的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將無菌TE 緩沖液(IOmM Tris, 0. 25mM EDTA，pH 7. 5)中的DNA (15-25 μ g)用 TE稀釋至440 μ 1，并且向 DNA/TE緩沖液中加入60 μ 1的2MCaCl2 (用IM HEPES緩沖液調(diào)節(jié)pH至5. 8)。向該混合物中逐滴加入總共 500 μ 1 的 hHeBS (HEPES-緩沖鹽；275mM NaCl, IOmM KCl, 1. 4mM Na2HPO4, mM右旋糖，40mM HEPES緩沖液粉末，pH 6.92)。使混合物室溫靜置20min。用IxHeBS短暫洗滌細胞并向每一板中加入Iml的磷酸鈣沉淀的DNA的溶液，并于37°C孵育細胞20min。該孵育之后，向細胞中加入IOml的“完全培養(yǎng)基”，并將板置于孵育箱中(37°C，9. 5% CO2)孵育另外3-6小時。在孵育階段結(jié)束時通過吸取去除DNA和培養(yǎng)基。洗滌細胞，加入新鮮培養(yǎng)基，然后將細胞放回到孵育箱中。可以使用如WO 93/06222中所述的磷酸鈣共沉淀技術。此外，可將細胞遺傳工程改造成產(chǎn)生想要的分泌性因子。想要的分泌性因子可以由合成的或者重組的表達載體編碼。本發(fā)明的重組表達載體包含適宜在宿主細胞中表達核酸的形式的本發(fā)明核酸，這意味著重組表達載體包括基于待用于表達的宿主細胞而選擇的、與待表達核酸序列有效連接的一種或更多種調(diào)節(jié)序列。術語“重組”指用于組合多核苷酸以產(chǎn)生有用的生物產(chǎn)品的分子生物學技術，并且指通過該技術產(chǎn)生的多核苷酸和肽。多核苷酸可以是包含與編碼調(diào)節(jié)元件如啟動子、終止信號等等的多核苷酸有效連接的編碼想要的分泌性因子的多核苷酸的重組構建體(例如載體或質(zhì)粒)。在重組表達載體中，“有效連接的，，意思是指目的核苷酸序列以允許核苷酸序列表達(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或者當載體被引入到宿主細胞中時在宿主細胞中)的方式與一種或多種調(diào)節(jié)序列連接。術語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多腺苷化信號)。此類調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。調(diào)節(jié)序列包括指導核苷酸序列在許多種宿主細胞中組成型表達的那些和指導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中表達的那些(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領域技術人員應當意識到，表達載體的設計可依賴于諸如待轉(zhuǎn)化宿主細胞的選擇、預期的蛋白質(zhì)表達水平等因素。與編碼序列有效連接的控制序列如此連接， 以致于在與控制序列一致的條件下實現(xiàn)編碼序列的表達?！翱刂菩蛄小敝笇崿F(xiàn)與其連接的編碼和非編碼序列表達必需的多核苷酸序列?？刂菩蛄型ǔ０▎幼印⒑颂求w結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。此外，“控制序列”指控制編碼序列內(nèi)所編碼肽加工的序列；這些可以包括， 但不限于控制肽分泌、蛋白酶水解和糖基化的序列。術語“控制序列”旨在以最小限度包括其存在可影響表達的元件，并且還可包括其存在是有利的額外元件，例如，前導序列和融合配偶體序列。“編碼序列”是被轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽的多核苷酸序列。如果連接導致產(chǎn)生可連續(xù)翻譯的序列而沒有改變或打斷三聯(lián)閱讀框，則兩個編碼多核苷酸“有效連接”。如果連接導致基因表達元件具有正確的功能以使想要的分泌性因子表達，則多核苷酸與該基因表達元件有效連接?！稗D(zhuǎn)化”是向宿主細胞中插入外源多核苷酸(即“轉(zhuǎn)基因”)。外源多核苷酸被整合入宿主基因組內(nèi)。如果多核苷酸包含含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信息的核苷酸序列并且此類序列與編碼想要的分泌性因子的多核苷酸“有效連接”，則多核苷酸“能夠表達”想要的分泌性因子。然后可以通過例如根據(jù)常規(guī)方法，例如在標準教科書Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press 1989)中描述的方法制備細菌載體，來擴增編碼肽編碼區(qū)的多核苷酸。表達載體包括質(zhì)?；蚱渌d體?；虻谋磉_在轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后水平上控制。轉(zhuǎn)錄起始是基因表達中的早期和關鍵的事件。這依賴于啟動子和增強子序列并且受與這些序列相互作用的特異細胞因子的影響。許多基因的轉(zhuǎn)錄單位包含啟動子并且在一些情況下包含增強子或調(diào)節(jié)元件 (Banerji 等，Cell 27:299(1981) ；Corden 等，Science 209:1406(1980)；以及 Breathnach 和Chambon，Ann. Rev. Biochem. 50 :349 (1981))。對于反轉(zhuǎn)錄病毒，參與逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組復制的控制元件存在于長末端重復序列(LTR)中(Weiss等編，The molecular biology of tumor viruses :RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982))。 莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和Rous肉瘤病毒(RSV)LTR包含啟動子和增強子序列(Jolly 等，Nucleic Acids Res. 11 1855(1983) ；Capecchi 等， 在 Enhancer and eukaryotic gene expression 中，編者 Gulzman 禾口 Shenk,第 101-102 頁，Cold Spring Harbor Laboratories (NY1991).其它有效的啟動子包括來自巨細胞病毒(CMV)的那些和其它野生型病毒啟動子和來自人遍在蛋白C的W^iC啟動子(W0 98/32869)。已經(jīng)描述了許多非病毒啟動子的啟動子和增強子區(qū)(khmidt等，Nature314 285(1985) ；Rossi 和 deCrombrugghe，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :5590-5594 (1987))。維持和增強轉(zhuǎn)基因在靜止細胞中表達的方法包括使用啟動子，包括I型膠原(1和幻(Prockop ^P Kivirikko,N. Eng. J. Med. 311 :376(1984) ；Smith 和 Niles，Biochem. 19:1820(1980) ；de Wet 等，J. Biol. Chem.，258 :14385 (1983))、SV40 和 LTR 啟動子。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，啟動子是選自下列的組成型啟動子雞β肌動蛋白 (CAG)、遍在蛋白啟動子、CMV啟動子、JeT啟動子(US 6，555，674)、SV40啟動子、Mtl啟動子、人W^iC和延伸因子1 α啟動子(EF-1 α )。特別優(yōu)選的啟動子是體內(nèi)不接受下調(diào)的啟動子?？烧T導/可抑制啟動子的實例包括Tet-0n、Tet-Off、雷帕霉素可誘導啟動子、 Mx 1、Mo-MLV-LTR、孕酮、RU486。除了使用病毒和非病毒啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達外，可使用增強子序列提高轉(zhuǎn)基因表達水平。增強子不但可以增強它們天然基因的轉(zhuǎn)錄活性，而且還可增強一些外源基因的轉(zhuǎn)錄活性(Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2702(1973))。例如，在本發(fā)明中，膠原增強子序列可與膠原啟動子2(1) —起使用以增強轉(zhuǎn)基因表達。此外，在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)
28的增強子元件可用于增強轉(zhuǎn)基因表達。該增強子序列包含72個堿基對重復，如Gruss等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:943(1981) ；Benoist 和 Chambon，Nature 290 :304 (1981)，以及Fromm和Berg，J. Mol. Appl. Genetics，1 =457(1982)中所述，所有這些文獻通過參考并入本文。當該重復序列串聯(lián)存在于多種啟動子中時可增強許多不同的病毒和細胞基因的轉(zhuǎn)錄 (Moreau 等，Nucleic Acids Res. 9 :6047 (1981)。更多的表達增強序列包括但不限于Kozak共有序列、旱獺肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件、WPRE、SP163增強子、CMV增強子、來自tau、TH或APP基因的非翻譯的5，或3，區(qū)和雞 [β]_珠蛋白絕緣子或其它絕緣子。優(yōu)選的增強元件包括Kozak共有序列、WPRE和β珠蛋白絕緣子?？赏ㄟ^化學合成方法或者通過重組技術制備編碼想要的分泌性因子的多核苷酸。 多肽可通過例如Merrifield，85J. Amer. Chem. Soc. 2149-2154 (1963)中所描述的化學合成技術常規(guī)制備(見Memmer等，164Gene 49(1995))。其體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或翻譯會導致想要的分泌性因子產(chǎn)生的合成的基因，可以通過本領域眾所周知的技術構建(見Brown等， 68Methods in Enzymology 109-151 (1979))。編碼多核苷酸可以使用常規(guī)DNA合成儀器，例如 Applied Biosystems Model380A 或 380B DNA 合成儀(可從 Applied Biosystems, Inc.， 850Lincoln Center Drive, Foster City，Calif.，USA 商業(yè)性獲得)產(chǎn)生。簡言之，重組表達載體的構建采用標準的連接技術。對于分析證實所構建載體中序列的正確性，將基因使用例如Messing等的方法(核酸Res.，9 :309_，1981)、Maxam等的方法(Methods in Enzymology,65 =499,1980)或者本領域技術人員已知的其它適宜方法測序。對所切割片段大小的分離使用如Maniatis等所述的常規(guī)凝膠電泳(Molecular Cloning，第 133-134 頁，1982)開展。術語“生物學試劑”指任何試劑，例如病毒、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂類、碳水化合物、 核酸、核苷酸、藥物、前藥或?qū)ι窠?jīng)細胞具有作用的其它物質(zhì)，不管此類作用是有害的、有益的還是其它。對神經(jīng)細胞有益的生物學試劑是“神經(jīng)學試劑”，該術語包括可證明有效用于 CNS或眼睛細胞增殖、分化或功能或者治療神經(jīng)學或眼科疾病或病癥的任何生物學或藥學活性物質(zhì)。例如，術語可包括某些神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)受體、生長因子、生長因子受體等等以及用于合成這些試劑的酶。當遺傳修飾用于產(chǎn)生生物學試劑時，物質(zhì)可以是用于治療特定病癥例如CNS病癥的物質(zhì)。可將細胞進行遺傳修飾以表達生物活性試劑，例如生長因子、生長因子受體、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)合成基因、神經(jīng)肽和嗜鉻顆粒胺轉(zhuǎn)運體。例如，遺傳修飾細胞以致于它們分泌誘導增殖的生長因子或誘導分化的生長因子是所渴望的。生物學試劑可以是堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子、 表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α、轉(zhuǎn)化生長因子β、神經(jīng)生長因子、胰島素樣生長因子、 血小板來源的生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子、neurturin、persephin, NeublaStin(Artemin)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、佛波醇12-十四酸酯 13-乙酸酯、tryophotin、激活蛋白、促甲狀腺激素釋放激素、白細胞介素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、巨噬細胞炎性蛋白、硫酸肝素、雙調(diào)蛋白、視黃酸、腫瘤壞死因子α、成纖維細胞生長因子受體、表皮生長因子受體、或預期對潛在靶組織具有有用治療作用的其它試劑。生物學試劑的實例包括營養(yǎng)因子例如神經(jīng)膠質(zhì)來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、neurturin、artemin 和persephin ；與生長因子活性有關的細胞內(nèi)途徑的調(diào)節(jié)物例如星狀孢子素、CGP-41251等等；激素；多種蛋白質(zhì)和多肽例如白細胞介素；肝素樣分子；抗體如人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體的抗原結(jié)合片段例如Fv、scFv.Fab.Fab'或F(ab)2，以及多聚體形式，例如二聚體的IgA分子或五價的IgM、親和體和雙體、和對靶細胞例如神經(jīng)細胞具有影響的多種其它分子。在另一實施方案中，分泌性生物活性化合物是細胞合成的小分子。在這些實施方案中，結(jié)構基因編碼參與小分子生物合成的多肽。一個實例涉及用于多巴胺合成的酶的表達，包括AADC(芳香族氨基酸脫羧酶)、TH(酪氨酸羥化酶)和GCH1(GTP-環(huán)水解酶1)。另一實例涉及用于GABA合成的酶的表達，包括GAD (谷氨酸脫羧酶)。在另外的實施方案中，使用SiRNA技術下調(diào)基因的表達。在某些情況下這將導致生物活性化合物分泌的增加。例如結(jié)構基因可以編碼siRNA以便下調(diào)內(nèi)源蛋白質(zhì)，例如腺苷激酶，以促進腺苷合成和分泌?？蓪⒉溉閯游锛毎脑煲援a(chǎn)生多種神經(jīng)遞質(zhì)或者它們的受體例如血清緊張素、 L-多巴、多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素、速激肽、P物質(zhì)、內(nèi)啡肽、腦啡肽、組胺、N-甲基 D-天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、GABA、ACh等等。有用的合成神經(jīng)遞質(zhì)的基因包括TH、DDC、 DBH、PNMT, GAD、色氨酸羥化酶、ChAT和組氨酸脫羧酶。編碼證明可用于治療CNS病癥的多種神經(jīng)肽的基因包括P物質(zhì)、神經(jīng)肽-Y、甘丙肽、腦啡肽、血管升壓素、VIP、胰高血糖素、鈴蟾肽、CCK、促生長素抑制素、降鈣素基因相關肽等等。生物學試劑對受體宿主內(nèi)CNS或眼睛細胞的影響可體外鑒定，這基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞(例如大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞、培養(yǎng)的原代中樞神經(jīng)神經(jīng)元等)；或眼睛細胞(例如I0/LD7/4細胞系、ARPE-19細胞、培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細胞等)模型細胞培養(yǎng)物相對于對照培養(yǎng)物之間，在條件例如所表達表型的比值(神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞或神經(jīng)遞質(zhì)或其它標志物)、細胞生存力和基因表達改變方面的顯著差異。細胞的物理特征可通過使用顯微鏡觀察細胞和神經(jīng)突形態(tài)和生長來分析。誘導蛋白質(zhì)例如酶、受體和其它細胞表面分子或者神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸、神經(jīng)肽和生物胺的新表達或者水平增加，可以使用本領域已知可鑒定此類分子水平改變的任何技術分析。這些技術包括使用抗此類分子的抗體的免疫組織化學或者生物化學分析。此類生物化學分析包括蛋白質(zhì)測定、酶測定、受體結(jié)合測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、電泳分析、使用高效液相色譜(HPLC)的分析、Western印跡和放射免疫測定(RIA)。核酸分析例如Northern印跡和PCR可以用于檢查編碼這些分子或者編碼合成這些分子的酶的mRNA水平。同樣，可以通過免疫化學或者通過其他免疫學方法體內(nèi)檢測想要的分泌性因子的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄物。用于產(chǎn)生生物活性化合物的細胞的支持基質(zhì)本發(fā)明的方法還包括在植入至哺乳動物腦內(nèi)之前在支持基質(zhì)上體外培養(yǎng)產(chǎn)生生物活性化合物的細胞。經(jīng)設計在植入至腦內(nèi)前將細胞預粘附在微載體上增強了移植細胞的長期生存力并提供長期的功能益處。在支持基質(zhì)上培養(yǎng)細胞的方法和將所述細胞植入腦內(nèi)的方法描述于US 5，750，103中(通過參考并入本文)。為提高移植的細胞，即移植的分泌生物活性化合物的細胞的長期生存力，可以在移植前將待移植的細胞體外粘附至支持基質(zhì)上。支持基質(zhì)可以包含的材料包括這樣的材料，即在體外孵育后細胞粘附，并且細胞可以在其上生長，并且可以移植入哺乳動物體內(nèi)而沒有產(chǎn)生有毒的反應或?qū)⑵茐乃踩爰毎难装Y反應或者其它干擾它們的生物學或治療活性的反應。此類材料可以是合成的或者天然的化學物質(zhì)或者生物來源的物質(zhì)?；|(zhì)材料包括，但不限于，玻璃和其它硅氧化物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氨基甲酸酯、聚海藻酸鹽、聚砜、聚乙烯醇、丙烯腈聚合物、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚戊烯(polypentent)、尼龍、淀粉酶類、天然和改良明膠以及天然和改良膠原、天然和改良多糖類包括葡聚糖和纖維素(例如硝基纖維素)、瓊脂和磁石?？墒褂每晌招曰蛘叻俏招圆牧?。同樣還預期使用本領域眾所周知的細胞外基質(zhì)材料。細胞外基質(zhì)材料可以商業(yè)性獲得，或者如下制備，即通過培養(yǎng)分泌此類基質(zhì)的細胞、去除分泌性細胞并且使待移植的細胞與基質(zhì)相互作用并粘附在基質(zhì)上。待移植的細胞可以在其上生長，或者細胞可以與其混合的基質(zhì)材料可以是RPE細胞的天然產(chǎn)物。因此，例如，基質(zhì)材料可以是由待植入的 RPE細胞產(chǎn)生并分泌的細胞外基質(zhì)或者基膜材料。為了改善細胞粘附、存活和功能，可任選用本領域已知的因子包被固體基質(zhì)外表面以促進細胞粘附、生長或存活。此類因子包括細胞粘附分子、細胞外基質(zhì)例如，諸如纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、彈性蛋白、葡糖氨基聚糖或蛋白聚糖或生長因子。備選地，如果所植入細胞粘附其上的固體基質(zhì)由多孔材料構成，則促進生長或促進存活的一種或多種因子可以混合到基質(zhì)材料中，在體內(nèi)植入后所述因子可以從基質(zhì)材料中緩慢釋放。當粘附至根據(jù)本發(fā)明的支持物時，用于移植的細胞通常在支持物的“外表面”。支持物可以是固體的或多孔的。然而，甚至在多孔支持物中，細胞與外部環(huán)境直接接觸，而沒有介入膜或其它屏障。因此，根據(jù)本發(fā)明，盡管細胞粘附其上的表面可以是不在顆粒或珠自身外表的多孔支持材料內(nèi)折或轉(zhuǎn)曲形式，但是還是認為細胞在支持物的“外表面”上。支持物的形態(tài)優(yōu)選是球形的，如在珠中，但是可以是圓柱形、橢圓形、扁片或條、針或釘形等等。優(yōu)選的支持物基質(zhì)形式是玻璃珠。另一優(yōu)選的珠是聚苯乙烯珠。珠大小可以從直徑大約10 μ m至1mm，優(yōu)選地從大約90 μ m至大約150 μ m。對于多種微載體珠的描述見例如，F(xiàn)isher Biotech Source 87-88，F(xiàn)isher Scientific Co.， 1987,72-75 ]λ ；Sigma Cell Culture Catalog, Sigma Chemical Co.，St, Louis, 1991, 第 162-163 頁；Ventrex Product Catalog, Ventrex Laboratories, 1989 ；這些參考文獻通過參考并入本文。珠大小的上限可以由珠對不良宿主反應的刺激限定，不良刺激會干擾所移植細胞的功能或者導致周圍組織的損傷。珠大小的上限還可以由施用方法限定。此類限制可由本領域技術人員容易地確定。生物活性化合物的聚合物膠囊化細胞遞送的治療有用性.中樞神經(jīng)系統(tǒng)是經(jīng)歷慢性退化的部位。已知生長因子具有用于治療神經(jīng)退行性病癥的巨大治療潛能。例如，已經(jīng)被遺傳工程改造分泌生長因子的聚合物-膠囊化異種細胞可保護大鼠(Winn 等，91Proc. Natl. Acad. ki. USA 23M-8 (1994))、靈長類(Emerich 等，349J. Comp. Neurol. 148-64(1994))和年老的靈長類(Kordower 等，91Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10898-902(1994))中樞神經(jīng)系統(tǒng)不產(chǎn)生損害誘導的細胞損失。使用聚合物-膠囊化細胞裝置直接遞送多種生長因子至中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的廣范圍靶部位已經(jīng)產(chǎn)生治療效果，并且沒有證據(jù)表明產(chǎn)生副作用(Emerich等，130Exp. Neurol. 141-50(1994)，Emerich等，736Brain Res. 99-110(1996)，Emerich 等，349J. Comp. Neurol. 148-64(1994)，Hoffman 等，122Exp. Neurol. 100-6 (1993)，Kordower 等，72Neuroscience 63-77 (1996)，Kordower 等，91Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10898-902(1994)，Winn 等，91Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2324-8 (1994) )0通過研究在接受遞送生長因子至腦長達1年的動物中沒有發(fā)現(xiàn)副作用 (Lindner 等，5Cell Transplant. 205-23 (1996)，Winn 等，140Exp. Neurol. 126-38 (1996))， 這支持聚合物-膠囊化細胞遞送生長因子的安全性。這些研究甚至測試對神經(jīng)毒性極其敏感的學習行為時也沒有發(fā)現(xiàn)有副作用。微膠囊除了上述的大膠囊之外，本發(fā)明的神經(jīng)肽分泌細胞可以膠囊化于微膠囊中或者微球體中。本發(fā)明中的膠囊是具有小于1 μ L體積的膠囊。如本文所定義的微膠囊或微球體是每個膠囊容納小于104個細胞的膠囊。每個微膠囊可包含基本上少于104個細胞，例如每個膠囊少于1000個細胞，例如每個膠囊少于100 個細胞，例如每個膠囊少于50個細胞，例如每個膠囊少于10個細胞，例如每個膠囊少于5 個細胞。此種微膠囊結(jié)構上相對簡單，因為它們包含在基質(zhì)內(nèi)或多或少均勻分散細胞。還可將微膠囊包被以提供兩層以上的結(jié)構并保證沒有細胞突出穿過微膠囊的表面。由于微膠囊有代表性地是小的直徑，有代表性地小于500 μ m、例如小于450 μ m、 例如小于400 μ m、例如小于350 μ m、例如小于300 μ m、例如小于250 μ m、例如小于200 μ m、 例如小于150 μ m、例如小于100 μ m、例如小于50 μ m、例如小于25 μ m、例如小于20 μ m、例如小于ΙΟμπκ例如小于5μπ ，所以它們可以像液體懸浮液一樣操作并在治療部位注射。自殺系統(tǒng)當需要時，可將分泌生物活性化合物的細胞膠囊化的本發(fā)明的裝置從患者中取回。作為進一步的安全措施，可將細胞裝備自殺系統(tǒng)，這保證在向所述患者施用適宜藥物時細胞可以被選擇性地殺死。自殺系統(tǒng)對于根據(jù)本發(fā)明的裸細胞移植是特別優(yōu)選的，因為在移植后取出裸細胞的可能性非常有限。一個此類的自殺系統(tǒng)基于胸腺嘧啶核苷激酶。通過具有其中胸腺嘧啶核苷激酶組成型或誘導表達的內(nèi)置自殺系統(tǒng)，可通過向個體施用治療有效量的核苷類似物，例如AZT 殺死細胞。如果膠囊化細胞開始以不受控的方式增殖，則可以施用核苷類似物。人們可能僅僅因為不再需要分泌生物活性化合物的細胞，因為必須立即終止并且不能等待手術去除膠囊化細胞或者因為通過一些其它途徑進一步治療，而希望終止治療。在所移植或膠囊化細胞已經(jīng)在移植前有條件地永生化的情況下，理論上存在在移植后癌基因起始轉(zhuǎn)錄和所移植細胞因此變成致瘤型的風險。當細胞通過轉(zhuǎn)導處于可誘導啟動子控制下的癌基因而永生化時(例如Tet on-off系統(tǒng)，Mxl啟動子等)，胸腺嘧啶核苷激酶(TK)編碼序列插入至處于同一啟動子控制下的載體構建體中(例如通過使用IRES構建體)或者TK編碼序列插入到具有相同啟動子的另一載體中。這保證了當癌基因被轉(zhuǎn)錄時， TK也被轉(zhuǎn)錄并且通過施用前體藥物選擇性殺死轉(zhuǎn)導的和致瘤的細胞。在本領域描述了數(shù)個胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因?qū)嵗?。一個優(yōu)選的TK是HSV-胸腺嘧啶核苷激酶。其它優(yōu)選的激酶包括Munch-Petersen等2000，J. Biol. Chem. 275 6673-6679中描述的黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)胸腺嘧啶核苷激酶。該特殊激酶的突變體甚至更優(yōu)選，因為對于數(shù)種核苷類似物它們具有降低的LD5tl(WC) 01/88106)。另一組的優(yōu)選胸腺嘧啶核苷激酶包括WO 03/100045中描述的植物激酶。免疫刺激性細胞表面蛋白在一個實施方案中，提供除了表達生物活性化合物外還能夠表達免疫刺激性細胞表面多肽的膠囊化人細胞。當用于植入人患者內(nèi)而膠囊化時，表達這些免疫刺激性細胞表面多肽的細胞特別有用，因為從破裂的膠囊逃出的細胞會通過患者的免疫系統(tǒng)破壞。宿主免疫反應不會被完整裝置內(nèi)的表達免疫刺激性細胞表面多肽的重組細胞觸發(fā)。然而，在裝置損害的情況下，所釋放的細胞被吞噬細胞有效去除，沒有補體活化或免疫記憶產(chǎn)生。在特定的實施方案中，包含人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體膜結(jié)構域的嵌合多肽將人IgG1Fc以 “反向方向”錨定至細胞質(zhì)膜的表面，因此模擬調(diào)理素作用過程中的IgG構型。人IgG1嵌合多肽結(jié)合Fc受體以活化吞噬細胞，例如巨噬細胞，但是避免了還活化補體級聯(lián)反應的(“補體結(jié)合”)的不良特性。長期活化的補體系統(tǒng)會殺死宿主細胞，并且積累的證據(jù)表明該機制可以引起許多退化性疾病，包括炎癥和神經(jīng)變性疾病。本發(fā)明的該實施方案的更多細節(jié)描述于 US 6，197，294 中(Neurotech)。根據(jù)該實施方案，細胞系還包含含有與編碼融合蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子的構建體，所述融合蛋白包含連接在第二個細胞表面多肽氨基末端的免疫刺激性細胞表面蛋白，其中第二個細胞表面多肽包含跨膜區(qū)，其中當表達時融合蛋白表達在細胞表面上。優(yōu)選地免疫刺激性細胞表面多肽活化吞噬細胞，但是不錨定補體。在一個實施方案中，免疫刺激性細胞表面多肽是IgG的一個區(qū)，優(yōu)選Fc。第二個細胞表面多肽可以是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體鉸鏈區(qū)。實施例實施例1 甘丙At和NGF表汰質(zhì)粒的構律以及將表汰盒亞克降入Sleeping Beautv轉(zhuǎn)) 底物載體中，以通過哺乳動物細胞產(chǎn)生野生型甘丙肽和野生型NGF1)如下產(chǎn)生甘丙肽構建體通過重疊PCR產(chǎn)生IgSP-deltapi^pro-甘丙肽。在第一個擴增步驟中，編碼成熟甘丙肽和具有IObp IgSP FLAP(IgSP=小鼠Ig重鏈基因V-區(qū)信號肽序列)的C末端肽的甘丙肽序列，使用引物FLAP-IgSP-mature gala (SEQ ID NO 10)， 5' (5，-GGTGAATTCGGGCTGGACCCTGAACAGCGCG-3，)和 Deltapi^pro-甘丙肽-XhoI (SEQ ID NO 11)3' (5， -TATACTCGAGCAGGAATGGCTGACTCTGCATAAATTGGCC-3，)從 pCMV_SP0RT6_h 甘丙肽質(zhì)粒(從德國柏林的RZPD得到，克隆ID :IRATp970F0849D6)PCR擴增。在第二個PCR 反應中，包含帶有來自成熟甘丙肽5’的IObp甘丙肽FLAP的全長IgSP序列的片段，使用引物 IgSPkozakls+BamHI(SEQ ID NO 12) (5‘ -TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTAT C-3，)和 IgSP-甘丙肽 FLAP as (SEQ ID NO 13) (5，-GGGTCCAGCCCGAATTCACCCCTGTAGAAAG-3，)從PNUT-IgSP-hCNTF(US 6，361，771)擴增。在第三步中，步驟1和2的產(chǎn)物在最后的 PCR反應中混合，通過使用等摩爾量的前兩次PCR反應的產(chǎn)物和引物IgSHiozakls+BamHI和 Deltapr印ro-甘丙肽-XhoI 3'產(chǎn)生IgS P-deltapr印ro_甘丙肽片段。為了產(chǎn)生基于質(zhì)粒的表達載體，所得到的PCR片段克隆入用BamHIAhoI消化的pCAn中。pCAn載體來源于pcDNA3. 1 (Invitrogen)。將pcDNA3. 1中的CMV啟動子去除并且替換成人CMV增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子和第一個內(nèi)含子。此外，當在哺乳動物細胞中表達時，載體包含提供G418抗性的Neo基因。然后將IgSP-deltapr印ro_甘丙肽片段表達盒(即包括CAG啟動子以及新霉素抗性表達盒)從pCAn載體亞克隆入質(zhì)粒pT2BH中。 PT2BH是用于轉(zhuǎn)座酶 Sle印ing Beauty 的底物載體(Ivies 等，Cell，91 :501-10 (1997))。通過用BglII和EcoRV第一次消化pT2BH進行亞克隆。然后將pCAn-IgSP-deltapr印ro_甘丙肽載體用BsmBI消化，然后用Klenow大片段聚合酶進行填補反應。然后將平端的開口的載體用BglII消化以產(chǎn)生半平端的IgSP-deltapr印ro-甘丙肽+新霉素抗性表達盒片段， 將其克隆入BglII-EcoRV-消化的pT2BH載體中。2)如下產(chǎn)生人NGF構建體使用下列引物從分離自HEK293細胞的基因組DNA中 PCR 擴增人 pr印roNGF :hNGFs+BamHI (SEQ ID NO 14) 5，-TATAGGATCCCTCTGAGGGACCCAGAA ACT-3，和 hNGFas+XhoI (SEQ IDNO 15) :5，-TATACTCGAGCAGGTCAGGCTCTTCTCAC-3，。所得到的PCR片段用BamHI和BioI酶切并插入至表達載體pCAn (上述)的BamHI和BioI位點產(chǎn)生構建體pCAn. hNGF。使用BglII和&PI將來自pCAn. hNGF (還包含新霉素抗性表達盒)的表達盒切下作為半平端片段。Sle印ing Beauty轉(zhuǎn)座酶底物載體pT2BH用BglII和 EcoRV消化。將CAn. hNGF片段連接入BglII和EcoRV消化的載體主鏈中產(chǎn)生構建體pT2. CAn. hNGF。來自構建體的序列示于實施例2中。實施例2.實施例1中所述構建體的序列存在于構建體pCAn. I gSP_de Itaprepro-甘丙肽和 pT2. CAn. ISSP-deltaprepro-甘丙肽中的 IgSP-deltaprepro-甘丙肽核苷酸序列(SEQ ID NO 1)ATGAAGTGCAGCTGGGTGATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGTAAGGGGCTCCCAAGTCCCAAA CTTGAGGGTCCATAAACTCTGTGACAGTGGCAATCACTTTGCCTTTCTTTCTACAGGGGTGAATTCGGGCTGGACCC TGAACAGCGCGGGCTACCTGCTGGGCCCTCACGCCGTGGGCAACCACAGAAGCTTCAGCGACAAGAACGGCCTGACC AGCAAGCGGGAGCTGCGGCCCGAGGACGACATGAAGCCCGGCAGCTTCGACAGAAGCATCCCCGAGAACAACATCAT GCGGACCATCATCGAGTTTCTGAGCTTTCTGCACCTGAAAGAGGCCGGAGCCCTGGACCGGCTGCTGGATCTGCCTG CCGCTGCCTCCTCAGAAGACATCGAGCGGTCCTGAI gSP-de Itaprepro-甘丙肽是與沒有pr印ro序列但包括C末端尾的人甘丙肽融合的小鼠Ig重鏈基因V區(qū)信號肽(GenBank ID :M18950)。注意I gSP-de Itaprepro-甘丙肽序列包含內(nèi)含子。IgSP-甘丙肽轉(zhuǎn)錄物的翻譯(SEQ ID NO 2)MKCSffVIFFLMAVVTGVNS GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS KRELRPEDDMKPG SFDRSIPENNIMRTIIEFLSFLHLKEAGALDRLLDLPAAASSEDIERS成熟甘丙肽序列用粗體強調(diào)。存在于構建體pCAn. hNGF和pT2. CAn. hNGF中的人preproNGF核苷酸序列(SEQ ID NO 3)ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACACTCAGAG AGCAATGTCCCTGCAGGACACACCATCCCCCAAGTCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACTGCCCTTCG CAGAGCCCGCAGCGCCCCGGCAGCGGCGATAGCTGCACGCGTGGCGGGGCAGACCCGCAACATTACTGTGGACCCCAGGCTGTTTAAAAAGCGGCGACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACT CAGGATCTGGACTTCGAGGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCCCATCC CATCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACA TCAAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACC AAGTGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCAC GACTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCT GTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA人 DreoroNGF 轉(zhuǎn)錄物的翻譯(SEQ ID NO 4)MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHT IPQVHffTKLQHSLDTALRRARSAPA AAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSK R SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCR DPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR RA 成熟NGF序列用粗體強調(diào)。存在于dT2-來源的構津體中的IRZDR(L)左手(互補鏈)Sleeping Beauty(SB) 底物序列(SEQ ID NO 5)CAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACTTAAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACA AATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCC AACAATTGTTTACAGACAGATTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATTCCAGTGGGTCAGAAGTTTACATACA CTAA存在于pT2-來源的構建體中的IRZDR(R)右手SB底物序列(SEQ ID NO 6)TTGAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGGGAATGTGATGAAAGAAATAAAAGCTGAAATGAATCATTC TCTCTACTATTATTCTGATATTTCACATTCTTAAAATAAAGTGGTGATCCTAACTGACCTAAGACAGGGAATTTTTA CTAGGATTAAATGTCAGGAATTGTGAAAAAGTGAGTTTAAATGTATTTGGCTAAGGTGTATGTAAACTTCCGACTTC AACTGSB轉(zhuǎn)座酶SBlO的蛋白質(zhì)序列(野生型SleepingBeauty轉(zhuǎn)座酶)(SEQ IDNO 7)MGKSKEISQD LRKKIVDLHK SGSSLGAISK RLKVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGRRRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGRSARKKPLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFffRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVffR KKGEACKPKNTIPTVKHGGG SIMLffGCFAA GGTGALHKID GIMRKENYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKffVFQMDNDPKHT SKVVAKffLKD NKVKVLEffPS QSPDLNPIEN LffAELKKRVR ARRPTNLTQLHQLCQEEffAK IHPTYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY高活性SB轉(zhuǎn)座酶SBlOOx的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 8)MGKSKEISQD LRK R IVDLHK SGSSLGAISK RL A VPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGRRRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKG H SARKKPLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFffRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVffR KKGEACKPKNTIPTVKHGGG SIMLffGCFAA GGTGALHKID GIM DAVQ YVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKffVFQ H DNDPKHT SKVVAKffLKD NKVKVLEffPS QSPDLNPIEN LffAELKKRVR ARRPTNLTQLHQLCQEEffAK IHP1N YCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY突變用粗體和下劃線強調(diào)。
高活件SB轉(zhuǎn)座酶SB80x的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 9)MGKSKEISQD LRK R IVDLHK SGS SLGAISK RL A VPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGRRRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKG S SARKKPLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFffRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVffR KKGEACKPKNTIPTVKHGGG SIMLffGCFAA GGTGALHKID GIM DAVQ YVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKffVFQ H DNDPKHT SKVVAKffLKD NKVKVLEffPS QSPDLNPIEN LffAELKKRVR ARRPTNLTQLHQLCQEEffAK IHPNYC E KLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY突變用粗體和下劃線強調(diào)。實施例3.穩(wěn)定的分泌甘丙肽和NGF的哺乳動物細胞的產(chǎn)生活和所分泌神經(jīng)肽水平的比較使用實施例1中所述構建體在ARPE-19細胞中產(chǎn)生穩(wěn)定細胞系ARPE-19是人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系(Durm等，1996)，其于37°C和5 % CO2下生長于補充有 10%胎牛血清(Sigma-Aldrich，丹麥)的含 Glutamax 的 DMEM/Nutrient Mix F-12中(Invitrogen，丹麥)。通過胰蛋白酶消化和再接種(1 5接種率)，將細胞每周大約傳代2次。將細胞以2.虹106個細胞/瓶的密度接種于T150培養(yǎng)瓶中(Coming Costar, Biotech Line，丹麥)用于轉(zhuǎn)染研究。次日，每一培養(yǎng)瓶中的細胞使用Fugene6 (Roche，德國)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，以包含甘丙肽或NGF表達盒的pT2SB底物載體和SB-IOOx高活性轉(zhuǎn)座酶表達載體以或者3 1的比例(7. 5 μ g pT2載體和2. 5 μ g SB-IOOx)或者10 1 的比例(9yg pT2載體和0.9yg SB-IOOx)共轉(zhuǎn)染。為選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子，轉(zhuǎn)染后48小時，向培養(yǎng)基中加入800yg/ml G418。當克隆表現(xiàn)出界限清晰并彼此分開時，每一構建體調(diào)取大約200個克隆并轉(zhuǎn)移至48孔板中。當在這些板中匯合時，使用商業(yè)性甘丙肽ELISA試劑盒 (目錄號S-1210，Bachem)測試甘丙肽克隆中是否存在甘丙肽，并且使用商業(yè)性NGF ELISA 試劑盒(NGF Duoset, R&D Systems)測試NGF克隆中是否存在NGF。將最高產(chǎn)量的克隆在 T150培養(yǎng)瓶中進一步擴大培養(yǎng)并將等分試樣凍存于液氮中。MM從基于pCAn和基于pT2的克隆體外分泌甘丙肽和NGF最佳的甘丙肽和NGF克隆在培養(yǎng)高達8周中接受表達穩(wěn)定性研究(2D研究)。從圖1中明顯看出，與通過標準轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的克隆相比，使用SB轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)產(chǎn)生的克隆分泌令人驚奇的大量因子。從基于pCAn和基于pT2的克隆體內(nèi)分泌甘丙肽在Goettingen迷你豬模型中測試來自2D-研究的最穩(wěn)定的甘丙肽高 (SB-IgSP-24)和低(ppG-152)生產(chǎn)者克隆的體內(nèi)表達穩(wěn)定性能。使用NsGene的專利膠囊化細胞(EC)生物遞送技術將克隆膠囊化。簡言之，具有^OkD的分子量截留值(MWCO)的 14mm聚醚-砜(PEQ膜以250，000個細胞/裝置填充。在植入至豬海馬內(nèi)之前，使細胞沉降并在裝置上繁殖2周。4周后將裝置外植。圖2顯示與外植的裝置和體外平行運行的裝置相比，來自植入前裝置的所分泌的甘丙肽水平。明顯地，與使用標準轉(zhuǎn)染技術產(chǎn)生的克隆 PPG-152相比，來自使用SB技術產(chǎn)生的克隆SB-IgSP-M的甘丙肽分泌水平出乎意料的大 (外植體水平大約150ng/裝置Λ4小時對5ng/裝置/ 小時)。來自基于pCAn和基于pT2的克隆的體內(nèi)NGF分泌
36
在大鼠中測試來自2D研究的最穩(wěn)定NGF高生產(chǎn)者克隆(SB_NGF_78)和早期產(chǎn)生的最低生產(chǎn)者克隆(NGC-0295)的體內(nèi)表達穩(wěn)定性。通過使用NsGene的專利膠囊化細胞 (EC)生物遞送技術以100，000個細胞/裝置體充280kD MWCO, 7mm PES膜，將克隆膠囊化。 將裝置植入到大鼠紋狀體內(nèi)并且在外植之前保留8周。圖3顯示與外植的裝置和體外平行運行的裝置相比，來自植入前裝置的所分泌的NGF水平。與使用標準轉(zhuǎn)染技術產(chǎn)生的克隆 NGC-0295相比，來自使用SB技術產(chǎn)生的克隆SB-NGF-78的NGF分泌水平出乎意料的大(外植體水平大約80ng/裝置Λ4小時對Sng/裝置/ 小時)。比較實施例4 所測試其他增強轉(zhuǎn)基因表達的方法
權利要求
1.一種用于向受試者遞送分泌性生物活性化合物的膠囊，膠囊包括a.生物相容性外膜和內(nèi)核，b.所述內(nèi)核包含細胞，c.所述細胞包含含有下列任一結(jié)構基因的異源表達構建體I.編碼分泌性生物活性多肽的結(jié)構基因，或，ii.編碼促進細胞中產(chǎn)生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA的結(jié)構基因，d.所述基因位于作為轉(zhuǎn)座酶或者其它整合酶底物的兩個反向重復序列之間。
2.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中所述生物相容性膜允許所述化合物通過的半滲透性外膜。
3.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中所述內(nèi)核包含基質(zhì)。
4.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中所述細胞是真核細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選靈長類細胞，更優(yōu)選人細胞。
5.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中所述膠囊是具有小于IyL膠囊體積的微膠^ O
6.根據(jù)權利要求1或2的膠囊，其中所述膠囊是具有至少1μ L，例如1-10 μ L的膠囊體積的大膠囊。
7.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，每μL膠囊體積包含10，000和250，000個之間的細胞，更優(yōu)選50，000至200，000個細胞每μ L，更優(yōu)選100，000至200，000個細胞每μ L， 更優(yōu)選從15，000至50，000個細胞每μ L，更優(yōu)選從20，000至30，000個細胞每μ L。
8.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中膠囊體積是至少0.5μ L，優(yōu)選至少1 μ L，更優(yōu)選在0. 5-10 μ L范圍內(nèi)。
9.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，包含少于104個細胞，例如少于1000個細胞每個膠囊，例如少于100個細胞每個膠囊，例如少于50個細胞每個膠囊，例如少于10個細胞每個膠囊，例如少于5個細胞每個膠囊。
10.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中厚度最多達1000μ m。
11.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，具有少于500μ m，例如少于450 μ m，例如少于 400 μ m,例如少于350 μ m,例如少于300 μ m,例如少于250 μ m,例如少于200 μ m,例如少于150 μ m,例如少于100 μ m,例如少于50 μ m,例如少于25 μ m,例如少于20 μ m,例如少于 10 μ m,例如小于5 μ m的直徑。
12.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中所述膠囊包含內(nèi)核，內(nèi)核包含人細胞和用于將細胞置于半滲透性膜內(nèi)的基質(zhì)的組合物。
13.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中內(nèi)核包含具有互聯(lián)孔的網(wǎng)狀泡沫支架，泡沫的孔密度在20%和90%之間變化，細胞分散于孔中。
14.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中泡沫支架是水凝膠、熱塑性塑料或熱塑性彈性體。
15.根據(jù)權利要求2-14任一項的膠囊，其中半滲透性膜能夠防止核內(nèi)的細胞與膠囊外的細胞之間發(fā)生細胞與細胞接觸。
16.根據(jù)權利要求2-15任一項的膠囊，其中半滲透性膜是免疫隔離性的。
17.根據(jù)權利要求2-16任一項的膠囊，其中半滲透性膜是微孔性的。
18.前述權利要求任一項的膠囊，其中膜具有IOOOkDa或更小，如300kDa或更小，優(yōu)選 280kDa或更小的分子量截留值。
19.前述權利要求任一項的膠囊，其中所述膠囊包括套并且其中所述套的厚度是 2-200微米。
20.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，還包含拴繩錨。
21.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，還包含縫合孔。
22.根據(jù)權利要求20或21的膠囊，其中所述拴繩可以用于連接和取出膠囊。
23.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞是接觸抑制性細胞。
24.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞能夠吞噬。
25.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞是非致瘤性的。
26.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞在哺乳動物中，優(yōu)選在人中是非致瘤性的。
27.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞已經(jīng)通過插入異源永生化基因，優(yōu)選 SV40T、vmyc或端粒酶催化亞基TERT永生化。
28.根據(jù)權利要求116任一項的膠囊，其中細胞沒有通過插入異源永生化基因而永生化。
29.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞能夠在低氧分壓下，例如在少于5%氧分壓，更優(yōu)選少于2%，更優(yōu)選少于下存活。
30.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞源于原代培養(yǎng)。
31.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞能夠經(jīng)歷至少50次，更優(yōu)選至少60次， 更優(yōu)選至少70次，更優(yōu)選至少80次，更優(yōu)選至少90次，更優(yōu)選至少100次倍增。
32.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中細胞觸發(fā)低水平的人宿主免疫反應，優(yōu)選其中人抗體和/或補體依賴性細胞毒性在人中低于非人動物中。
33.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中裝置中的所有細胞源于單一細胞系。
34.根據(jù)權利要求33的膠囊，其中細胞系是人干細胞系。
35.根據(jù)權利要求33的膠囊，其中細胞系是人星形膠質(zhì)細胞系。
36.根據(jù)權利要求33的膠囊，其中細胞系是人中腦細胞系。
37.根據(jù)權利要求33的膠囊，其中細胞系是人上皮細胞系。
38.根據(jù)權利要求37的膠囊，其中上皮細胞系是視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞，包括但不限于原代RPE細胞。
39.根據(jù)權利要求38的膠囊，其中細胞系是ARPE-19來源的細胞系。
40.根據(jù)權利要求33-39任一項的膠囊，其中細胞系是人單克隆細胞系。
41.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中表達構建體包含啟動子。
42.根據(jù)權利要求41的膠囊，其中啟動子是組成型啟動子。
43.根據(jù)權利要求42的膠囊，其中所述組成型活性啟動子選自CAG、CMV、人W3iC、JeT、 RSV,EF-I α、SV40、Mtl。
44.根據(jù)權利要求41的膠囊，其中所述啟動子是可誘導啟動子。
45.根據(jù)權利要求44的膠囊，其中所述可誘導啟動子選自Tet-On，、Tet-Off, Mo-MLV-LTR、Mxl、孕酮、RU486、雷帕霉素可誘導啟動子。
46.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中表達構建體包含任何任選的增強表達的序列。
47.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因編碼治療相關基因。
48.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因選自甘丙肽、神經(jīng)肽Y、食欲素A、 食欲素B、腦啡肽、促生長素抑制素14、促生長素抑制素觀、血管活性腸肽、腸肽PHV-42、腸肽PHV-27、P物質(zhì)、神經(jīng)降壓肽、縮膽囊素58、縮膽囊素39、縮膽囊素33、縮膽囊素25、縮膽囊素18、縮膽囊素12、縮膽囊素8、縮膽囊素7、縮膽囊素5、P物質(zhì)、神經(jīng)肽K、神經(jīng)肽、、神經(jīng)激肽 A、TRH、NGF。
49.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因選自甘丙肽、縮膽囊素、神經(jīng)降壓肽、P物質(zhì)、神經(jīng)肽K、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)激肽A、血管活性腸肽、食欲素B。
50.根據(jù)權利要求48的膠囊，其中結(jié)構基因選自甘丙肽、神經(jīng)肽Y、食欲素A、食欲素B。
51.根據(jù)權利要求48-50任一項的膠囊，其中結(jié)構基因是甘丙肽。
52.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因編碼生長因子或營養(yǎng)因子。
53.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中因子是神經(jīng)營養(yǎng)因子。
54.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因編碼抗體或抗體的結(jié)合片段。
55.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因是NGF。
56.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中NGF編碼序列編碼帶有異源信號肽的成熟NGF。
57.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中NGF編碼序列編碼帶有異源前肽的成熟NGF。
58.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因編碼參與小分子生物合成的多肽，例如用于多巴胺合成的酶包括AADC (芳香族氨基酸脫羧酶)、TH(酪氨酸羥化酶)和 GCHl (GTP-環(huán)水解酶1)或者例如用于GABA合成的酶包括GAD (谷氨酸脫羧酶)。
59.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因編碼siRNA以下調(diào)內(nèi)源蛋白質(zhì)，例如腺苷激酶以促進腺苷合成和分泌。
60.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中表達構建體還包含選自下列的序列=Kozak 共有序列、WPRE、β-珠蛋白絕緣子、SP163增強子、來自tau、TH或APP基因的非翻譯5，或 3’引導區(qū)。
61.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中膠囊能夠以至少20ng/膠囊Λ4小時、例如 30ng/膠囊/24小時、例如至少40ng/膠囊/24小時、例如50ng/膠囊/24小時、例如至少 60ng/膠囊Ι Α小時、例如70ng/膠囊IlA小時、例如至少80ng/膠囊IlA小時、例如IOOng/ 膠囊Λ4小時、例如至少120ng/膠囊/ 小時、例如140ng/膠囊/ 小時、例如至少160ng/ 膠囊Λ4小時、例如180ng/膠囊Ι Α小時、例如至少190ng/膠囊IlA小時、例如200ng/膠囊Λ4小時分泌生長因子。
62.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中膠囊能夠以至少20ng/膠囊Λ4小時、例如30ng/膠囊/24小時、例如至少40ng/膠囊/24小時、例如50ng/膠囊/24小時、例如至少75ng/膠囊/24小時、例如IOOng/膠囊/24小時、例如至少125ng/膠囊/24小時、例如 150ng/膠囊Ι Α小時、例如至少175ng/膠囊IlA小時、例如200ng/膠囊IlA小時分泌神經(jīng)肽。
63.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中結(jié)構基因的拷貝數(shù)是1、大于1、例如2-25、 例如2-5、例如5-10、例如10-15、例如15-20、例如20-25。
64.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中兩個反向重復序列是IR/DR，所述IR/DR是轉(zhuǎn)座酶的識別位點。
65.根據(jù)權利要求64的膠囊，其中IR/DR包含鑒定為SEQID NO :5和SEQ ID NO 6的核苷酸序列或者與SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6具有70%同一性的核苷酸序列。
66.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中轉(zhuǎn)座酶是非病毒的。
67.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中轉(zhuǎn)座酶是Sle印ingBeauty、Frog Prince、 Το12、ΦC31、piggyback、Minos、mariner、Hermes 或這些轉(zhuǎn)座酶的任何變體。
68.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊用于治療。
69.根據(jù)前述權利要求任一項的膠囊，其中所述膠囊用于植入至非人中。
70.根據(jù)權利要求68的膠囊，其中所述膠囊用于植入至人中。
71.根據(jù)前述權利要求68至70任一項的膠囊，其中所述植入是向腦中植入。
72.一種包含下列任一結(jié)構基因的異源表達構建體的細胞系i.編碼分泌性生物活性多肽的結(jié)構基因，或ii.編碼促進細胞中產(chǎn)生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA的結(jié)構基因；所述基因位于作為轉(zhuǎn)座酶底物的兩個反向重復序列之間。
73.根據(jù)權利要求72的細胞系，其中細胞系選自干細胞、星形膠質(zhì)細胞、中腦細胞、間質(zhì)細胞、造血細胞、成纖維細胞細胞、單克隆細胞或上皮細胞。
74.根據(jù)權利要求72的細胞系，其中所述細胞是真核細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選靈長類細胞，更優(yōu)選人細胞。
75.根據(jù)權利要求72或73的細胞系，當匯合時分泌至少200ng/106個細胞/24小時、 例如250ng/106個細胞/24小時、例如至少500ng/106個細胞/24小時、例如600ng/106個細胞Λ4小時、例如至少700ng/106個細胞Ι Α小時、例如750ng/106個細胞IlA小時、例如至少775ng/106個細胞Λ4小時、例如800ng/106個細胞/ 小時的所述生物活性多肽或者促進細胞產(chǎn)生分泌性生物活性化合物的多肽。
76.根據(jù)前述權利要求72-75任一項的細胞系，其粘附至基質(zhì)。
77.權利要求76的細胞系，其中基質(zhì)選自玻璃和其他硅氧化物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氨基甲酸酯、聚海藻酸鹽、聚砜、聚乙烯醇、丙烯腈聚合物、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚戊烯(polypentent)、尼龍、淀粉酶類、天然和改良明膠和天然和改良膠原、 天然和改良多糖類，包括葡聚糖和纖維素(例如硝基纖維素)、瓊脂和磁石。
78.權利要求76的細胞系，其中用促進細胞粘附、生長或存活的因子，包括但不限于細胞粘附分子、細胞外基質(zhì)分子例如，諸如，纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、彈性蛋白、葡糖氨基聚糖或蛋白聚糖或生長因子包被固體基質(zhì)外表面。
79.權利要求76的細胞系，其中促進生長的因子和/或促進存活的一種或多種因子整合入基質(zhì)材料中。
80.權利要求76的細胞系，其中基質(zhì)的構型優(yōu)選是球形、圓柱形、橢圓形、扁片或條、針或釘形等等。
81.權利要求76的細胞系，其中所述基質(zhì)包含珠并且其中珠大小范圍為直徑從大約~ 10 μ m至1mm，優(yōu)選從大約90 μ m至大約150 μ m。
82.—種產(chǎn)生重組蛋白的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權利要求72-81的細胞和回收所述重組蛋白。
83.權利要求82的方法，其中細胞系選自中國倉鼠卵巢細胞、CH0-K1、幼倉鼠腎細胞、 小鼠成纖維細胞-3T3細胞、非洲綠猴細胞系、大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤、AT3、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤、大鼠神經(jīng)元細胞系和大鼠海馬細胞系。
84.—種產(chǎn)生能夠分泌生物活性化合物的細胞系的方法，所述方法包括a.以第一和第二表達構建體轉(zhuǎn)染細胞；b.所述第一表達構建體包含編碼轉(zhuǎn)座酶的閱讀框；c.所述第二表達構建體編碼分泌性生物活性多肽或者編碼促進細胞中產(chǎn)生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA ；d.所述第二表達構建體位于作為所述轉(zhuǎn)座酶底物的兩個反向重復序列之間；e.使所述座酶瞬時表達，由此使所述第二構建體整合入所述人細胞的基因組中。
85.根據(jù)權利要求84的方法，其中所述細胞是真核細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選靈長類細胞，更優(yōu)選人細胞。
86.根據(jù)權利要求84的方法，其中所述第一和第二表達構建體位于不同的質(zhì)粒上。
87.根據(jù)權利要求84的方法，其中所述第一和第二表達構建體位于同一質(zhì)粒上。
88.權利要求84至87任一項的方法，其中所述第二表達構建體還編碼選擇標記基因。
89.權利要求88的方法，其中所述選擇標記基因選自綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、DS-redMST熒光蛋白、螢光素酶(LUC)、 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)和β-半乳糖苷酶(IacZ)。
90.前述權利要求84至89任一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)座酶選自Sle印ingBeauty,Frog Prince、Το12、ΦC31、piggyback、Minos、mariner、Hermes 禾口這些轉(zhuǎn)座酶的任何變體。
91.權利要求90的方法，其中所述Sle印ingBeauty變體選自包含與SEQ ID NO 7有 1至20個氨基酸不同的氨基酸序列的SBlOX變體，包括選自下列的突變或突變組的至少一種K14R ；K13D ；K13A ；K30R ；K33A ；T83A ；I100LR115HR143LR147EA205K/,H207V,,K208RH207V/,K208R,,D210ER214D/,K215A/,E216V-M243H -M243Q -E267D -T314N ；和 -G317E。
92.權利要求90的方法，其中所述Sle印ingBeauty變體是包含SEQ ID N08中所公開氨基酸序列的變體27。
93.權利要求90的方法，其中所述Sle印ingBeauty變體是包含SEQ ID N09中所公開氨基酸序列的變體觀。
94.前述權利要求84至93任一項的方法，其中轉(zhuǎn)染導致每個細胞3-5個拷貝數(shù)。
95.前述權利要求84至93任一項的方法，其中轉(zhuǎn)染導致每個細胞6-10個拷貝數(shù)。
96.前述權利要求84至95任一項的方法，其中表達構建體處于組成型啟動子控制下。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達重組蛋白的細胞系的產(chǎn)生，所述細胞系用于分泌性治療分子的裸細胞生物遞送和膠囊化細胞生物遞送。在一個實施方案中，細胞系是人的細胞系。在本發(fā)明的另一方面中，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)用于產(chǎn)生用于生物活性多肽分泌的細胞系。
文檔編號C12N5/00GK102361971SQ201080013486
公開日2012年2月22日 申請日期2010年1月21日 優(yōu)先權日2009年1月23日
發(fā)明者拉爾斯·U·沃爾伯格, 菲利普·庫斯克 申請人:Ns基因公司