桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，它是用干燥的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)粉末，超聲破碎，乙醇提取；再用石油醚、飽和正丁醇萃取獲得，在料液比為1：10，提取溫度為60℃，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間為40min條件下，提取皂苷的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，提取率最高，為9.172%；經(jīng)硅膠層析純化，獲得了桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A和Ebs-B，Ebs-A對(duì)人肺癌細(xì)胞系-A549、小鼠骨髓瘤細(xì)胞系-SP2/0、人皮膚黑色素瘤細(xì)胞系-A375的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，Ebs-B對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系-HeLa、人結(jié)腸癌細(xì)胞系-LOVO的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；而組分A、B均可有效殺死人肝癌細(xì)胞系-SMMC、膽管癌細(xì)胞系-QBC939。
【專利說(shuō)明】桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]桃對(duì)(Muonynius bungeanus ),衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物,別稱明開夜合、白杜，中文學(xué)名:絲棉木。其枝葉秀麗，紅果密集，可作庭園綠化樹種，同時(shí)也具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。葉可代茶，根和皮中含有多種藥用成分、殺蟲活性成分，同時(shí)也是硬橡膠資源，具有巨大的開發(fā)潛力。
[0003]皂苷iSapcmins)是存在于植物界的一類結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的苷類化合物，其苷元大多屬于具有螺留烷及其生源相似的留族化合物或三萜類化合物。大多數(shù)皂苷水溶液振搖后可產(chǎn)生持久性的泡沫，故稱皂苷。按照皂苷元的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可以將皂苷分為三萜皂苷和甾體皂苷。三萜類皂苷如人參皂苷、柴胡皂苷、桔梗皂苷等具有降低膽固醇、抗炎、抑制腫瘤、免疫、興奮或抑制中樞神經(jīng)、抑制胃液分泌等作用。留體皂苷如沿階草皂苷、知母皂苷等經(jīng)研究表明有抗腫瘤、抗真菌和細(xì)菌以及降低膽固醇等作用。以從植物中提取的留體皂苷為起始原料合成的留體激素類藥物用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心臟病、阿狄森氏病、紅斑狼瘡，可以止血、抗腫瘤和作避孕藥，還可以利用留體原料合成鎮(zhèn)痛藥、麻醉藥、殺蟲劑、冠心病藥等。也有將留體皂苷用作避孕藥和激素類等藥物的重要合成原料。
[0004]大量的研究表明，中藥皂苷類成分能解熱、降溫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、消炎、抗菌，還能夠刺激粘膜促進(jìn)分泌，通常用 作清熱解毒、止咳化痰、抗菌消炎藥，臨床多用于治療各種感冒、發(fā)燒、咳嗽等，如柴胡、桔梗、遠(yuǎn)志等。一些皂苷如三七皂苷對(duì)消腫止痛、改善心血管功能方面作用明顯；人參皂苷能明顯增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能，改善物質(zhì)代謝，促進(jìn)造血機(jī)能，調(diào)節(jié)人體的氣血平衡和代謝平衡。最近，備受關(guān)注的是皂苷在抗癌活性上的研究，研究證實(shí)，從人參中提取得到的人參皂苷有抗癌作用，人參莖葉皂苷可抑制腫瘤細(xì)胞的RNA和DNA的合成。越來(lái)越多的研究表明，皂苷不但具有廣泛的生物活性和藥理作用，而且還可以作為食品添加劑如天然甜味劑、保護(hù)劑、發(fā)泡劑、增味劑、抗氧劑等等。
[0005]桃葉衛(wèi)矛作為一種常見(jiàn)庭院觀賞類樹種，其果實(shí)資源非常豐富，但對(duì)其生物活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷。
[0007]桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，它是用下述方法制備的，它包括:
1)干燥的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)粉末，超聲破碎，乙醇提??；
2)石油醚萃??；
3)用飽和正丁醇萃??；
得桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷。
[0008]所述的步驟I)為:干燥的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)粉末，用80%乙醇浸泡24h，料液比為1:9-11 ;用超聲波清洗器，溫度為60°C，進(jìn)行超聲波浸提40min，過(guò)濾；
桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A和Ebs-B，它是由下述方法制備:
將上述的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，甲醇溶解，加入100-200目硅膠，充分吸附后加熱揮干甲醇后，以10%-90%的乙醇對(duì)硅膠柱進(jìn)行洗脫，得到洗脫峰標(biāo)記為1、洗脫峰II ；
合并收集洗脫峰I洗脫液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得到粗桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A ；
合并收集洗脫峰II洗脫液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得到粗桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-B ;
將粗桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A和Ebs-B再分別用dl52大孔樹脂柱純化。
[0009]桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A在制備治療肝癌-SMMC、膽管癌-QBC939、人肺癌-A549、小鼠骨髓瘤-SP2/0或人皮膚黑色素瘤-A375藥物中的應(yīng)用。
[0010]桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-B在制備治療肝癌-SMMC、膽管癌-QBC939、人宮頸癌細(xì)胞系-HeLa或人結(jié)腸癌細(xì)胞系-LOVO藥物中的應(yīng)用。
[0011]桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A在制備抗大腸桿菌、腸炎沙門氏菌或金黃色葡萄球菌藥物中的應(yīng)用。
[0012]桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-B在制備抗大腸桿菌、腸炎沙門氏菌或枯草芽孢桿菌藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供了桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，它是用干燥的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)粉末，超聲破碎，乙醇提?。辉儆檬兔?、飽和正丁醇萃取獲得，在料液比為1:10，提取溫度為60°C，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間為40min條件下，提取皂苷的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，提取率最高，為9.172%，經(jīng)硅膠層析純化，獲得了桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A和Ebs-B，Ebs-A對(duì)人肺癌細(xì)胞系-A549、小鼠骨髓瘤細(xì)胞系-SP2/0、人皮膚黑色素瘤細(xì)胞系-A375的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，Ebs-B對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系-HeLa、人結(jié)腸癌細(xì)胞系-LOVO的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；而組分A、B均可有效殺死人肝癌細(xì)胞系-SMMC、膽管癌細(xì)胞系-QBC939。
[0014]兩種皂苷組分抑菌原液對(duì)于大腸桿菌和腸炎沙門氏菌均有良好的抑制效果，而皂苷組分A能夠充分抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，抑菌圈明顯，但是對(duì)枯草芽孢桿菌則幾乎沒(méi)有抑制效果；皂苷組分B對(duì)于枯草芽孢桿菌也有明顯的抑制作用，同樣出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，對(duì)于金黃色葡萄球菌則沒(méi)有抑制效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2為桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷的硅膠層析洗脫曲線(上樣量2g)；
圖3 Ebs-A的dl52大孔樹脂柱純化洗脫曲線；
圖4 Ebs-B的dl52大孔樹脂柱純化洗脫曲線；
圖5皂苷組分A對(duì)SMMC的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；100X4)；
圖6皂苷組分B對(duì)HeLa的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；10X4)；
圖7皂苷組分B對(duì)LOVO的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；10X4);
圖8皂苷組分A對(duì)Sp2/0的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；10X4);
圖9皂苷組分A對(duì)A375的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；10X4);
圖10皂苷組分A對(duì)A549的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；10X4)
圖11皂苷組分A對(duì)QBC939的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；100X4)；圖12皂苷組分B對(duì)BHK的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；10X4);
圖13皂苷組分A對(duì)DK的細(xì)胞毒性作用(1:對(duì)照組；2:加樣組；10X4)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷的分離純化
1、桃葉衛(wèi)矛果實(shí)總皂苷粗品提取
桃葉衛(wèi)矛果實(shí)(吉 林農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)采集)，粉碎過(guò)40目篩。稱取2g干燥的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)粉末，用80%乙醇20ml浸泡24h，采用WD-9415B型超聲波清洗器(北京市六一儀器廠，40KHz, IOOkff)，溫度為60°C，進(jìn)行超聲波浸提40min，過(guò)濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取劑揮至無(wú)醇味，將所剩溶液用石油醚萃取3次，再用飽和正丁醇萃取3次，然后將正丁醇層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將正丁醇揮干，真空干燥，得總皂苷粗品。用甲醇將總皂苷粗品溶解，定容為50mL待用，用分光光度法在349nm處對(duì)桃葉衛(wèi)矛皂苷含量的進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的數(shù)據(jù)作分析對(duì)照。剩余提取液進(jìn)行減壓濃縮，即得粗皂苷產(chǎn)品。
[0017]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)確稱取人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg,用70%乙醇溶解并定容至50 mL,配置成0.2mg/mL的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 mL，再用70%乙醇定容至20 mL,以70%乙醇為空白，在波長(zhǎng)349 nm下，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)OD值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 1，得回歸方程為:Y=0.1453Χ-0.0071 ( R2=0.9993)。
[0018]皂苷含量計(jì)算:
在349nm下測(cè)定吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計(jì)算皂苷得率。
[0019]皂苷得率(mg/g)=C*V/W
C:由人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的皂苷濃度(mg/ml)
V:皂苷提取溶液體積(ml)
W:桃葉衛(wèi)矛樣品質(zhì)量(g)
經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，在料液比為1:10，提取溫度為60°C，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間為40min條件下，提取皂苷的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，提取率最高，為9.172%
2、桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷的分離純化
稱取提取的皂苷粗品2g，以甲醇溶解，向其中加入硅膠(100-200目)，拌樣，充分吸附后加熱揮干甲醇后上樣。以10%-90%的乙醇對(duì)硅膠柱進(jìn)行洗脫，流速lmL/min，自動(dòng)部分收集器收集，每管5mL，隔管于349nm處檢測(cè)OD值，記錄繪制洗脫曲線，見(jiàn)圖2。
[0020]得到兩個(gè)洗脫峰，標(biāo)記為1、II，按照洗脫峰合并收集洗脫液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到兩種皂苷組分，按出峰的先后順序標(biāo)記為Ebs-A、Ebs-B。經(jīng)硅膠層析純化所得后各皂苷組分中Ebs-A得率最高，為57.1%，Ebs-B得率為30.1%。
[0021]、D152大孔樹脂柱層析
將兩個(gè)組分分別加入D152大孔樹脂，充分吸附后，以10%-90%的乙醇對(duì)樹脂柱進(jìn)行洗脫，流速lmL/min，自動(dòng)部分收集器收集，349nm紫外檢測(cè)OD值，繪制洗脫曲線，見(jiàn)圖3、4。
[0022]圖3、4可以看出，經(jīng)過(guò)dlOl大孔樹脂層析柱的洗脫峰均呈現(xiàn)單一對(duì)稱峰形，說(shuō)明經(jīng)純化后的兩種皂苷組分均一。
[0023]通過(guò)對(duì)桃葉衛(wèi)矛果實(shí)總皂苷的最佳提取條件，提取出桃葉衛(wèi)矛果實(shí)總皂苷，然后通過(guò)硅膠柱將其進(jìn)行純化，并進(jìn)一步將所得組分通過(guò)D152大口樹脂進(jìn)行純化，得到兩個(gè)單一組分Ebs-A、Ebs-B,含量分別為0.876g,0.486g，得率依次為43.8%,24.3%。所得皂苷成分在349nm處有最高吸收峰，由于含C-12羰基的甾體皂苷元均有350nm的最大吸收峰，所以推測(cè)桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷為含C-12羰基的留體皂苷。
[0024]實(shí)施例2桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷的抑菌活性試驗(yàn) O培養(yǎng)基的配制
牛肉膏3.5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，ρΗ7.0~7.2，加熱煮沸，120 °C 滅菌 20 min。
[0025]2)測(cè)試樣品的制備
分別取桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷組分Ebs-A、Ebs-B適量，用無(wú)菌水溶解配制成濃度為50 mg/mL的皂苷溶液，為抑菌原液A、B。
[0026]3)菌種處理
預(yù)先將供試菌種接在斜面培養(yǎng)基上活化2次，37°C恒溫培養(yǎng)24 h。分別挑取I環(huán)己活化好的菌種放入10 mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩搖勻，制成濃度約為IO6~107cfu/mL的菌懸液，備用。
[0027]4)不同濃度皂苷提取液抑菌活性研究
分別取兩種桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷組分原液(50 mg/mL)，采用二倍稀釋法用對(duì)照溶液分別稀釋至25 mg/mL> 12.5 mg/mL、6.75 mg/mL,以無(wú)菌水作對(duì)照。無(wú)菌條件下,取菌懸液I mL倒入充分凝固的培養(yǎng)基，涂勻，取無(wú)菌濾紙(Φ=0.5 cm)浸沒(méi)于樣品試液中使其完全飽和，稍風(fēng)干，接于含菌培養(yǎng)皿中，每皿按梯度均勻鋪置5個(gè)濾紙片，處理后的抑菌平皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)24 h后觀察，測(cè)抑菌圈直徑并記錄。
[0028]5)抑菌結(jié)果
如表1所示，桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷兩種組分對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均有抑制作用，隨著皂苷組分溶液濃度的增大，抑菌圈直徑隨之增大；而皂苷組分A能夠充分抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，抑菌圈明顯；皂苷組分B對(duì)于枯草芽孢桿菌也有明顯的抑制作用，同樣出現(xiàn)了明顯的抑菌圈。
[0029]表1不同濃度桃葉衛(wèi)矛果實(shí)總皂苷試液的抑菌效果
【權(quán)利要求】
1.桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，它是用下述方法制備的，它包括: 1)干燥的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)粉末，超聲破碎，乙醇提??； 2)石油醚萃??； 3)用飽和正丁醇萃取； 得桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷。
2.權(quán)利要求1所述的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，其特征在于:所述的步驟I)為:干燥的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)粉末，用80%乙醇浸泡24h，料液比為1: 9-11 ;用超聲波清洗器，溫度為60°C，進(jìn)行超聲波浸提40min，過(guò)濾。
3.桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A和Ebs-B，它是由下述方法制備: 權(quán)利要求所述的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷，甲醇溶解，加入100-200目硅膠，充分吸附后加熱揮干甲醇后，以10%-90%的乙醇對(duì)硅膠柱進(jìn)行洗脫，得到洗脫峰標(biāo)記為1、洗脫峰II ； 合并收集洗脫峰I洗脫液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得到粗桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A ； 合并收集洗脫峰II洗脫液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得到粗桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-B ; 將粗桃葉衛(wèi)矛果實(shí) 皂苷Ebs-A和Ebs-B再分別用dl52大孔樹脂柱純化。
4.權(quán)利要求3所述的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A在制備治療肝癌-SMMC、膽管癌-QBC939、人肺癌-A549、小鼠骨髓瘤-SP2/0或人皮膚黑色素瘤-A375藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求3所述的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-B在制備治療肝癌-SMMC、膽管癌-QBC939、人宮頸癌細(xì)胞系-HeLa或人結(jié)腸癌細(xì)胞系-LOVO藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-A在制備抗大腸桿菌、腸炎沙門氏菌或金黃色葡萄球菌藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的桃葉衛(wèi)矛果實(shí)皂苷Ebs-B在制備抗大腸桿菌、腸炎沙門氏菌或枯草芽孢桿菌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07J75/00GK103965284SQ201410190229
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】李澤鴻, 劉繼陽(yáng), 于新海, 趙福廣, 劉瑩, 李振華, 劉洪章, 張文惠, 劉淑英, 陳屏, 韓鵬 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)