一種低多聚體的人免疫球蛋白快速生產(chǎn)工藝的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種制備低多聚體的人免疫球蛋白的低溫乙醇法快速生產(chǎn)工藝。該工藝的特點(diǎn)有：1）蛋白質(zhì)分離工序少，兩步完成蛋白質(zhì)分離的操作，第一步分離組分I+Ⅱ+Ⅲ，第二步分離組分Ⅱ；2）整個(gè)生產(chǎn)工藝的溫度控制，高溫工序最高溫度不高于35℃；3）最長(zhǎng)工藝時(shí)間控制，通過(guò)控制三個(gè)高溫工序的工藝時(shí)間，融漿投料、低pH病毒滅活及產(chǎn)品包裝生產(chǎn)，控制了人免疫球蛋白的多聚體含量，不高于2%。采用本法生產(chǎn)的人免疫球蛋白產(chǎn)品的蛋白純度高，可達(dá)到98%以上，生產(chǎn)工序時(shí)間短，蛋白質(zhì)分離及超濾的時(shí)間可在70小時(shí)內(nèi)完成。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種低多聚體的人免疫球蛋白快速生產(chǎn)工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人免疫球蛋白的低溫乙醇法的快速分離制備工藝，該工藝采用兩步蛋白質(zhì)分離技術(shù)，在整個(gè)生產(chǎn)工藝的溫度控制，最高溫度不高于35°c，通過(guò)控制三個(gè)高溫工序的工藝時(shí)間，融漿投料、低PH病毒滅活及產(chǎn)品包裝生產(chǎn)，控制了人免疫球蛋白的多聚體含量，不高于2%。
【背景技術(shù)】
[0002]人免疫球蛋白是從上千位健康獻(xiàn)漿員的合格血漿中提取的一種由人體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后產(chǎn)生的免疫物質(zhì)所制成的生物制劑，含有廣譜抗病毒、細(xì)菌或其他病原體的IgG抗體，能迅速提高受者血液中IgG水平，增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力和免疫調(diào)節(jié)功能。
[0003]人免疫球蛋白的主要成分為球蛋白(IgG)，IgG由2條輕鏈和2條重鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合組成。高溫及蛋白酶類(lèi)處理容易引起IgG聚合或降解，產(chǎn)生高分子聚合物和蛋白片斷。蛋白片斷不會(huì)引起嚴(yán)重不良反應(yīng)。歐洲藥典和中國(guó)藥典等都未直接規(guī)定IgG片斷的含量。但大量多聚合物會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，甚至死亡。
[0004]溫度對(duì)人免疫球蛋白質(zhì)量的影響是明顯的，主要是通過(guò)形成多聚體而影響蛋白活性及產(chǎn)品質(zhì)量的。液體的人免疫球蛋白(包括靜注人免疫球蛋白、人免疫球蛋白、特種人免疫球蛋白在內(nèi))在4°C的穩(wěn)定性已通過(guò)了注冊(cè)驗(yàn)證，通常在3年內(nèi)是穩(wěn)定的。但當(dāng)溫度升高(25-35°C)，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，將會(huì)產(chǎn)生裂解片段，這些裂解片段通常不會(huì)引起嚴(yán)重副反應(yīng)。37°C孵放7天或45°C以上溫度孵放I天，免疫球蛋白將形成聚合體和裂解片斷；60°C以上高溫使免 疫球蛋白快速聚合，形成大量二聚體或多聚合體，使生物學(xué)活性及部分理化性質(zhì)明顯降低和改變，生物學(xué)活性受到嚴(yán)重影響，小鼠異常毒性試驗(yàn)出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)；100°C水浴30min時(shí)，形成大量高分子聚合體，生物學(xué)活性喪失，小鼠異常毒性試驗(yàn)動(dòng)物死亡。動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)與多聚體的量直接相關(guān)。邱芳、吳澤良、李育瓊等的研究也得出了多聚體的含量與溫度相應(yīng)的時(shí)間有關(guān)，當(dāng)多聚體含量達(dá)到80%，可致家兔死亡。
[0005]目前，有大量的人免疫球蛋白分離制備的工藝研究，不乏是低溫乙醇分離法或者是其與層析法結(jié)合的技術(shù)，或者強(qiáng)調(diào)了兩步病毒去除/滅活的運(yùn)用。這些研究都從不同層面增加了人免疫球蛋白的生產(chǎn)工序的復(fù)雜程度，延長(zhǎng)了產(chǎn)品生產(chǎn)的工藝時(shí)間，產(chǎn)品的純度、質(zhì)量得不到保證，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量關(guān)注程度不夠。為此，建立一種快速的、有質(zhì)量保證的人免疫球蛋白分離制備工藝很為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明人在廣泛關(guān)注低溫乙醇法蛋白質(zhì)分離技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的同時(shí)，也關(guān)注了人免疫球蛋白產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制技術(shù)，確保工藝溫度和工藝時(shí)間的嚴(yán)格控制，確保產(chǎn)品的質(zhì)量，主要表現(xiàn)是控制人免疫球蛋白多聚體的含量不超過(guò)2%，確保產(chǎn)品不會(huì)因?yàn)槎嗑垠w的含量偏高而出現(xiàn)不良反應(yīng)或者副作用。[0007]結(jié)合人免疫球蛋白穩(wěn)定性、不良反應(yīng)、蛋白結(jié)構(gòu)特性的研究，為了確保人免疫球蛋白的產(chǎn)品質(zhì)量，本發(fā)明采用了三個(gè)方面的特征性的工藝控制手段:
1)采用兩步蛋白質(zhì)分離技術(shù)，蛋白質(zhì)分離工序少，兩步完成蛋白質(zhì)分離的操作，第一步分離組分I+ II +III，第二步分離組分II ；
2)整個(gè)生產(chǎn)工藝的溫度控制，高溫工序的最高溫度不高于35°C；
3)最長(zhǎng)工藝時(shí)間控制，通過(guò)控制三個(gè)高溫工序的工藝時(shí)間，融漿投料、低pH病毒滅活及產(chǎn)品包裝生產(chǎn)，控制了人免疫球蛋白的多聚體含量，不高于2%?？刂频鞍踪|(zhì)分離及超濾配制的工藝時(shí)間為70小時(shí)左右。
[0008]在上述三個(gè)特征性步驟的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的人免疫球蛋白的生產(chǎn)過(guò)程包括:融漿投料、制備組分I+ II +II1、制備組分I+II1、制備組分I1、純化組分I1、超濾與配制、低PH病毒滅活、二次超濾配制、灌裝即得。
[0009]I)融漿投料，溫度不高于35°C，持續(xù)時(shí)間不超過(guò)4小時(shí)。
[0010]2)制備組分I+ II + III的工藝參數(shù)為:pH為6.5至7.8、乙醇含量為15%至24%、溫度控制為-6.(TC至-2.5°C，蛋白質(zhì)濃度范圍為:4.0%至7.8%。
[0011]3)制備組分I+ III，將上述組分I+ II + III用8-14倍體積的注射用水溶解，調(diào)節(jié)參數(shù)為:pH為5.0至5.6、乙醇含量為15%至24%、溫度控制為-1.(TC至4.5°C，靜置時(shí)間2至24小時(shí)。
[0012]4)制備組分II，以上述分離組分I+III的上清液為原料，按照每I升體積加入10-25mL lmol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，工藝參數(shù)為:pH為7.0至7.8、乙醇含量為25%至34%、溫度控制為-10.(TC至-5.5°C，靜置時(shí)間2至24小時(shí)。
[0013]5)純化組分II，以上述制備分離的組分II為原料，用8-14倍的注射用水溶解，調(diào)節(jié)溶解所得的溶液PH為3.5至4.8。分離除去雜蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液。
[0014]6)超濾與配制，用分子截流量為50kD的超濾膜，超濾濃縮，以注射用水連續(xù)超濾6-10次。超濾完成后，用注射用水調(diào)配蛋白溶液，使其蛋白質(zhì)含量為應(yīng)為52±10g/L，并調(diào)節(jié)pH為3.5至4.8。
[0015]7)低pH病毒滅活，將經(jīng)除菌過(guò)濾并密封好的人免疫球蛋白置于恒溫為23_25°C條件下，靜置21天。每7天取樣I次，測(cè)定pH和蛋白質(zhì)含量，應(yīng)無(wú)明顯變化。。
[0016]8) 二次超濾配制，低pH病毒滅活完成后，對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行二次超濾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的體積。按照終體積的10%加入麥芽糖，確保蛋白質(zhì)含量不低于50克/L，調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)范圍。用無(wú)菌操作工藝灌裝-軋蓋即得。
[0017]本發(fā)明的人免疫球蛋白生產(chǎn)工藝適用于生產(chǎn)的產(chǎn)品品種包括有:人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白、帶狀皰疹人免疫球蛋白、Ro (D)人免疫球蛋白、靜注人免疫球蛋白(pH4)。
[0018]技術(shù)收益
采用本發(fā)明的生產(chǎn)方法，可以獲得如下的收益:
1)本發(fā)明有效的控制了工藝時(shí)間，生產(chǎn)工序時(shí)間短，蛋白質(zhì)分離及超濾的時(shí)間可在70小時(shí)內(nèi)完成；
2)通過(guò)溫度控制、工 藝時(shí)間的控制，控制了人免疫球蛋白的多聚體含量，不高于2%；
3)采用本法生產(chǎn)的人免疫球蛋白產(chǎn)品的蛋白純度高，可達(dá)到98%以上，滿(mǎn)足中國(guó)藥典的技術(shù)指標(biāo)的要求。
[0019]實(shí)施實(shí)例
實(shí)施例1:以人血漿為原料的人免疫球蛋白的制備 O融漿投料，溫度不高于35°c，持續(xù)時(shí)間為1-3小時(shí)；
2)制備組分I+II + III的工藝參數(shù)為:pH為7.2、乙醇含量為19%、溫度控制為-3.(TC，蛋白質(zhì)濃度范圍為5.8%；
3)制備組分I+III，將2)步驟分離得到的組分I+II +III用12倍體積的注射用水溶解，調(diào)節(jié)參數(shù)為:pH為5.0、乙醇含量為23%、溫度控制為2.5°C，靜置時(shí)間2小時(shí)；
4)制備組分II，以3)步驟分離組分I+III后的上清液為原料，按照每I升體積加入22mL lmol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，工藝參數(shù)為:pH為7.6、乙醇含量為28%、溫度控制為-9.5°C，靜置時(shí)間2小時(shí)；
5)純化組分II，以上述4)步驟制備分離的組分II為原料，用14倍的注射用水溶解，調(diào)節(jié)溶解所得的溶液pH為3.8。分離除去雜蛋白、硅藻土，得人免疫球蛋白溶液；
6)超濾與配制，用分子截流量為50kD的超濾膜，超濾濃縮，以注射用水連續(xù)超濾10次。超濾完成后，用注射用水調(diào)配蛋白溶液，使其蛋白質(zhì)含量為應(yīng)為52g/L,并調(diào)節(jié)pH為4.3 ；
7)低pH病毒滅活，將經(jīng)除菌過(guò)濾并密封好的人免疫球蛋白置于恒溫為23-25°C條件下，靜置21天。每7天 取樣I次，測(cè)定pH和蛋白質(zhì)含量，應(yīng)無(wú)明顯變化；
8)二次超濾配制，低pH病毒滅活完成后，對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行二次超濾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的體積。按照終體積的10%加入麥芽糖，確保蛋白質(zhì)含量不低于50克/L，調(diào)節(jié)pH為7.2。用無(wú)菌操作工藝灌裝-軋蓋即得。
[0020]實(shí)施例2:以人血漿為原料的靜注人免疫球蛋白(pH4)的制備 O融漿投料，溫度不高于35°C，持續(xù)時(shí)間60-80分鐘；
2)制備組分I+II +III的工藝參數(shù)為:pH為7.2、乙醇含量為18%、溫度控制為-3.0°C°C,蛋白質(zhì)濃度范圍為5.8%；
3)制備組分I+III，將上述2)步驟分離得到的組分I+II +III用12倍體積的注射用水溶解，調(diào)節(jié)參數(shù)為PH為5.1、乙醇含量為20%、溫度控制為-0.2°C，靜置時(shí)間2小時(shí)；
4)制備組分II，以上述3)步驟分離組分I+III后的上清液為原料，按照每I升體積加入24mL lmol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，工藝參數(shù)為pH為7.2、乙醇含量為28%、溫度控制為-9.(TC至-7.5°C，靜置時(shí)間2小時(shí)；
5)純化組分II，以上述4)步驟制備分離的組分II為原料，用12倍的注射用水溶解，調(diào)節(jié)溶解所得的溶液pH為4.0。分離除去雜蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液；
6)超濾與配制，用分子截流量為50kD的超濾膜，超濾濃縮，以注射用水連續(xù)超濾10次。超濾完成后，用注射用水調(diào)配蛋白溶液，使其蛋白質(zhì)含量為應(yīng)為52g/L,并調(diào)節(jié)pH為4.0 ;
7)低pH病毒滅活，將經(jīng)除菌過(guò)濾并密封好的人免疫球蛋白置于恒溫為23-25°C條件下，靜置21天。每7天取樣I次，測(cè)定pH和蛋白質(zhì)含量，應(yīng)無(wú)明顯變化；
8)二次超濾配制，低pH病毒滅活完成后，對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行二次超濾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的體積。按照終體積的10%加入麥芽糖，確保蛋白質(zhì)含量不低于50克/L，調(diào)節(jié)pH為4.0。用無(wú)菌操作工藝灌裝-軋蓋即得。
[0021]實(shí)施例3:以組分I+ II + III為原料的人免疫球蛋白的制備1)制備組分I+III，將組分I+II +III用12倍體積的注射用水溶解，調(diào)節(jié)pH為5.1、乙醇含量為24%、溫度控制為1.5°C，靜置時(shí)間2小時(shí)；
2)制備組分II，以I)步驟分離組分I+III后的上清液為原料，按照每I升體積加入21mLlmol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，調(diào)節(jié)pH為7.4、乙醇含量為26%、溫度控制為-9.5°C,靜置時(shí)間2小時(shí)；
3)純化組分II，以上述2)步驟制備分離的組分II為原料，用10倍的注射用水溶解，調(diào)節(jié)溶解所得的溶液pH為3.8。分離除去雜蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液；
4)超濾與配制，用分子截流量為50kD的超濾膜，超濾濃縮，以注射用水連續(xù)超濾10次。超濾完成后，用注射用水調(diào)配蛋白溶液，使其蛋白質(zhì)含量為應(yīng)為55g/L,并調(diào)節(jié)pH為3.8 ;
5)低pH病毒滅活，將經(jīng)除菌過(guò)濾并密封好的人免疫球蛋白置于恒溫為23-25°C條件下，靜置21天。每7天取樣I次，測(cè)定pH和蛋白質(zhì)含量，應(yīng)無(wú)明顯變化；
6)二次超濾配制，低pH病毒滅活完成后，對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行二次超濾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的體積。按照終體積的10%加入麥芽糖，確保蛋白質(zhì)含量不低于50克/L，調(diào)節(jié)pH為7.2。用無(wú)菌操作工藝灌裝-軋蓋即得。 [0022]實(shí)施例4:以組分I+ II + III為原料的靜注人免疫球蛋白(pH4)的制備
1)制備組分I+III，將組分I+II +III用12倍體積的注射用水溶解，調(diào)節(jié)參數(shù)為pH為5.1、乙醇含量為20%、溫度控制為1.2°C，靜置時(shí)間2小時(shí)；
2)制備組分II，以上述I)步驟分離組分I+III后的上清液為原料，按照每I升體積加入24mL lmol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，調(diào)節(jié)為pH為7.0、乙醇含量為28%、溫度控制為-9.(TC至-7.5°C，靜置時(shí)間2小時(shí)；
3)純化組分II，以上述2)步驟制備分離的組分II為原料，用12倍的注射用水溶解，調(diào)節(jié)溶解所得的溶液PH為4.0。分離除去雜蛋白、硅藻土，得人免疫球蛋白溶液；
4)超濾與配制，用分子截流量為50kD的超濾膜，超濾濃縮，以注射用水連續(xù)超濾10次。超濾完成后，用注射用水調(diào)配蛋白溶液，使其蛋白質(zhì)含量為應(yīng)為56g/L,并調(diào)節(jié)pH為4.0 ；
5)低pH病毒滅活，將經(jīng)除菌過(guò)濾并密封好的人免疫球蛋白置于恒溫為23-25°C條件下，靜置21天。每7天取樣I次，測(cè)定pH和蛋白質(zhì)含量，應(yīng)無(wú)明顯變化；
6)二次超濾配制，低pH病毒滅活完成后，對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行二次超濾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的體積。按照終體積的10%加入麥芽糖，確保蛋白質(zhì)含量不低于50克/L，調(diào)節(jié)pH為4.0。用無(wú)菌操作工藝灌裝-軋蓋即得。
【權(quán)利要求】
1.一種低多聚體的人免疫球蛋白快速生產(chǎn)工藝，其特征在于該工藝的特點(diǎn)有: 1)蛋白質(zhì)分離工序少，兩步完成蛋白質(zhì)分離的操作，第一步分離組分I+II +III，第二步分離組分II ； 2)整個(gè)生產(chǎn)工藝的溫度控制，高溫工序最高溫度不高于35°C； 3)最長(zhǎng)工藝時(shí)間控制，通過(guò)控制三個(gè)高溫工序的工藝時(shí)間，融漿投料、低pH病毒滅活及產(chǎn)品包裝生產(chǎn)，控制了人免疫球蛋白的多聚體含量，不高于2%。
2.按權(quán)利要求1所述的一種低多聚體的人免疫球蛋白快速生產(chǎn)工藝，其特征在于人免疫球蛋白的制備步驟為:融漿投料、制備組分I+ II +II1、制備組分I+II1、制備組分I1、純化組分I1、超濾與配制、低PH病毒滅活、二次超濾配制、灌裝即得； O融漿投料，溫度不高于35°C，持續(xù)時(shí)間不超過(guò)4小時(shí)； 2)制備組分I+II + III的工藝參數(shù)為:pH為6.5至7.8、乙醇含量為15%至24%、溫度控制為-6.(TC至-2.5°C，蛋白質(zhì)濃度范圍為:4.0%至7.8% ； 3)制備組分I+III，將上述組分I+II +III用8-14倍體積的注射用水溶解，調(diào)節(jié)參數(shù)為:pH為5.0至5.6、乙醇含量為15%至24%、溫度控制為-1.(TC至4.5°C，靜置時(shí)間2至24小時(shí)； 4)制備組分II，以上述分離組分I+III的上清液為原料，按照每I升體積加入10-25mLlmol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，工藝參數(shù)為:pH為7.0至7.8、乙醇含量為25%至34%、溫度控制為-10.(TC至-5.5°C，靜置時(shí)間2至24小時(shí)； 5)純化組分II，以上述制備分離的組分II為原料，用8-14倍的注射用水溶解，調(diào)節(jié)溶解所得的溶液pH為3.5至4.8 ;分離除去雜蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液； 6)超濾與配制，用分子截流量為50kD的超濾膜，超濾濃縮，以注射用水連續(xù)超濾6-10次；超濾完成后，用注射用水調(diào)配蛋白溶液，使其蛋白質(zhì)含量為應(yīng)為52± 10g/L，并調(diào)節(jié)pH為 3.5 至 4.8 ; 7)低pH病毒滅活，將經(jīng)除菌過(guò)濾并密封好的人免疫球蛋白置于恒溫為23-25°C條件下，靜置21天；每7天取樣I次，測(cè)定pH和蛋白質(zhì)含量，應(yīng)無(wú)明顯變化； 8)二次超濾配制，低pH病毒滅活完成后，對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行二次超濾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的體積；按照終體積的10%加入麥芽糖，確保蛋白質(zhì)含量不低于50克/L，調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)范圍；用無(wú)菌操作工藝灌裝-軋蓋即得。
3.按權(quán)利要求1，本工藝適用于生產(chǎn)的產(chǎn)品品種包括有:人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、巨細(xì)胞病毒人免疫球蛋白、帶狀皰疹人免疫球蛋白、Ro (D)人免疫球蛋白、靜注人免疫球蛋白(pH4)。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK103980345SQ201410189936
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】石正國(guó), 張庭喜, 孔維權(quán), 王連群, 呂紹玉, 朱瑞芳, 金三中 申請(qǐng)人:貴州中泰生物科技有限公司