本發(fā)明屬于醫(yī)療技術領域，尤其是一種用于研究破骨細胞融合的熒光蛋白標記方法。

背景技術：

在本技術之前，用于觀察破骨細胞融合的技術主要有兩類：1.借助延時攝影顯微鏡(time-lapsemicrescope)進行活細胞攝影；2.借助病毒包裝原理進行研究。具體如下：

延時攝影技術：即借助延時攝影顯微鏡每間隔一定時間采集明場中活細胞的圖像，借此研究是否發(fā)生了破骨細胞的融合。但是明場情況下即便放大倍數(shù)很高也無法清晰直觀地觀察破骨細胞融合過程中細胞形態(tài)、細胞核數(shù)目等細節(jié)，更不能定量分析多少細胞發(fā)生了融合。因此無法研究干預因素對破骨細胞融合過程中細胞的形態(tài)、細胞核數(shù)目、融合的細胞數(shù)目等方面的影響。

例如下例已發(fā)表的研究，如圖7。

在明場環(huán)境下只能觀察到細胞間類似“相互靠近”的距離變化，而后發(fā)生了細胞形態(tài)的模糊改變。無法觀察到具體的細胞結構、細胞核數(shù)目的改變；更無法定量分析此刻有多少細胞發(fā)生了融合。

病毒包裝原理：即將包裝障礙的熒光報道基因標記的病毒質粒和輔助包裝質粒分別轉染到破骨前體細胞系raw264.7中，若破骨前體細胞系發(fā)生了融合則會產生包裝完成（具有感染能力）的成熟的熒光報道基因標記的病毒上清液。將這個上清液加到模式細胞系的培養(yǎng)基中，則模式細胞系被上述病毒感染后可在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達。但這個過程是間接地研究破骨細胞融合，完全不能觀察到破骨細胞融合過程中細胞形態(tài)、細胞核數(shù)目等細胞形態(tài)學改變。并且也無法直接定量破骨細胞的融合數(shù)目。并且過程繁復耗時，病毒包裝的技術復雜，所需實驗儀器和試劑較多；更嚴重的是存在病毒感染的生物安全問題，不是每一個實驗室都能開展研究（僅限具有病毒研究的生物安全等級較高的研究室）。

實驗示意圖如圖8。

研發(fā)過程中遇到的難題：如何能夠可視地、清晰地觀察到破骨細胞融合的全程。并且在這個過程中還能觀察到細胞形態(tài)、細胞核數(shù)目的改變。更難地是還要能用于定量研究干擾因素對破骨細胞融合效率的影響。

如果能夠得到便捷、清晰、直觀、可視、便捷的技術去觀察破骨細胞融合過程中細胞的形態(tài)、細胞核數(shù)目等細胞行為的改變；同時最好還能定量研究干預因素對破骨細胞融合效率的影響的方法，是現(xiàn)在的需求和發(fā)展趨勢。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種用于研究破骨細胞融合的熒光蛋白標記方法，可以直觀可視地觀察破骨細胞融合過程，從而觀察破骨細胞形態(tài)、細胞核數(shù)目及可以定量研究融合的細胞數(shù)目；也可以利用本熒光標記方法直觀可視地觀察到這些因素對融合過程、融合效率和融合中細胞行為產生了哪些影響，從而為研究破骨細胞融合提供了簡便、可靠的工具。

解決以上技術問題的本發(fā)明中的一種用于研究破骨細胞融合的熒光蛋白標記方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）將含ctsk-cre轉基因的小鼠原代骨髓單核細胞（bonemarrowmonocytes,bmms）和含rosa^mtmg的轉基因小鼠原代骨髓單核細胞以3:1-1:3的比例混合培養(yǎng)；

（2）進行破骨分化向誘導；

（3）熒光顯微鏡觀察。

所述步驟（1）中混合培養(yǎng)前先cre重組酶能特異性識別loxpdna序列，使loxp位點間的基因序列被刪除或重組，從而實現(xiàn)條件性基因打靶，混合培養(yǎng)后ctsk-cre轉基因的小鼠原代骨髓單核細胞與rosa^mtmg的轉基因小鼠原代骨髓單核細胞發(fā)生融合，最終產生綠色熒光蛋白。

ctsk在骨骼系統(tǒng)中是破骨細胞特異性表達的基因，因此cre重組酶只在破骨細胞中表達。而rosa^mtmg轉基因小鼠的細胞在無cre重組酶時細胞膜表達紅色熒光蛋白，而在cre重組酶存在的情況下則通過上述cre/loxp系統(tǒng)原理剪切掉紅色熒光蛋白的基因而啟動綠色熒光蛋白基因的表達，此時的細胞膜上表達綠色熒光蛋白。

所述步驟（1）中培養(yǎng)條件為：含10%fbs，1%p/s的dmem培養(yǎng)基，37℃恒溫孵箱，5%二氧化碳，95%氧氣。

所述培養(yǎng)條件中，混合后細胞總量達到以下要求：a、96孔板細胞總量為3000-8000，培養(yǎng)基體積為100ul；b、其他的孔板或者培養(yǎng)皿應根據(jù)其底面積與96孔板的底面積進行比例換算，得到最終的混合細胞量。

所述步驟（2）中誘導過程：混合培養(yǎng)的第一天在培養(yǎng)基中加入濃度為50ng/ml的mscf（巨噬細胞集落刺激因子macrophagecolony-stimulatingfactor）,混合培養(yǎng)第三天全換液，液體為所述步驟（1）中配制的培養(yǎng)基，并加入50ng/mlmcsf+50ng/mlrankl（核因子κb受體活化因子配體）。

所述步驟（1）中ctsk-cre轉基因的小鼠原代骨髓單核細胞和含rosa^mtmg的轉基因小鼠原代骨髓單核細胞以3:1-1:3的比例混合培養(yǎng)。

所述步驟（3）熒光顯微鏡觀察中紅色熒光采用tdtomato適用的檢測參數(shù)，激發(fā)峰554nm，發(fā)射峰581nm；綠色熒光采用egfp適用的檢測參數(shù)，激發(fā)峰488nm，發(fā)射峰507nm。

本發(fā)明中破骨分化向誘導后第三天起開始觀察。

本發(fā)明中將兩種轉基因小鼠的骨髓單核細胞混合破骨向誘導培養(yǎng)，借助熒光顯微鏡即可觀察到破骨細胞融合的過程（含ctsk-cre的細胞若與含rosa^mtmg的細胞融合，則融合后的細胞中既含有cre又含有rosa^mtmg；故融合后的細胞膜表達綠色熒光蛋白），并且能夠可視化的得到融合過程中破骨細胞數(shù)目形態(tài)的變化以及定量分析發(fā)生了融合的破骨細胞數(shù)目（定量計數(shù)綠色熒光陽性的細胞數(shù)目）。

本發(fā)明中還可以借助細胞核熒光染料如hoechst或dapi，從而觀察融合過程中細胞核數(shù)目的改變。在熒光顯微鏡下觀察前，可用終濃度為100ng/ml的dapi染色1分鐘或用終濃度為1ug/ml的hoechst染色20分鐘，去除染料后用pbs清洗3次，然后加入100ul的pbs于熒光顯微鏡下進行觀察。

在觀察融合的方法中，本發(fā)明中方法直觀、簡單，具有無需進行細胞染色、不需要進行轉染的優(yōu)勢。并且可以利用有無綠色熒光出現(xiàn)作為融合與否的標準，準確性和可重復性高，遠遠超過通過延時攝影顯微鏡觀察細胞形態(tài)的方法，也避免了觀察者對細胞形態(tài)的誤判造成結果的偏差。

附圖說明

下面結合附圖及具體實施方式對本發(fā)明做更進一步詳細說明：

圖1為本發(fā)明中的原理示意圖

圖2為本發(fā)明中實施例1的細胞熒光圖

圖3-圖6為本發(fā)明中實施例2的細胞熒光圖

圖7為本發(fā)明中延時攝影技術的觀察圖

圖8為本發(fā)明中病毒包裝實驗示意圖

其中標識為：1.綠色熒光陽性標記

具體實施方式

本發(fā)明中cre重組酶能特異性識別loxpdna序列，使loxp位點間的基因序列被刪除或重組，從而實現(xiàn)條件性基因打靶。利用cre/loxp系統(tǒng)原理，將含ctsk-cre轉基因的小鼠原代骨髓單核細胞（bonemarrowmonocytes,bmms）和含rosa^mtmg的轉基因小鼠原代骨髓單核細胞混合培養(yǎng)，并進行破骨分化向誘導。因ctsk在骨骼系統(tǒng)中是破骨細胞特異性表達的標志，因此cre重組酶只在破骨細胞中表達。而rosa^mtmg轉基因小鼠的細胞在無cre重組酶時細胞膜表達紅色熒光蛋白，而在cre重組酶存在的情況下則通過上述cre/loxp系統(tǒng)原理剪切掉紅色熒光蛋白的基因而啟動綠色熒光蛋白基因的表達，因此此時的細胞膜上表達綠色熒光蛋白。因此將上述兩種轉基因小鼠的骨髓單核細胞混合破骨向誘導培養(yǎng)的這個過程中，借助熒光顯微鏡即可觀察到破骨細胞融合的過程（含ctsk-cre的細胞若與含rosa^mtmg的細胞融合，則融合后的細胞中既含有cre又含有rosa^mtmg；故融合后的細胞膜表達綠色熒光蛋白），并且能夠可視化的得到融合過程中破骨細胞數(shù)目形態(tài)的變化以及定量分析發(fā)生了融合的破骨細胞數(shù)目（定量計數(shù)綠色熒光陽性的細胞數(shù)目）。借助細胞核熒光染料如hoechst或dapi還可以觀察融合過程中細胞核數(shù)目的改變。

原理示意如圖1。

下面結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明作詳細的說明：

實施例1

將ctsk-cre轉基因小鼠與rosa^mtmg轉基因小鼠的骨髓單核細胞分離，以1:1的比例混合培養(yǎng)。

混合培養(yǎng)后ctsk-cre轉基因的小鼠原代骨髓單核細胞與rosa^mtmg的轉基因小鼠原代骨髓單核細胞發(fā)生融合。cre重組酶能特異性識別loxpdna序列，使loxp位點間的基因序列被刪除或重組，從而實現(xiàn)條件性基因打靶，最終產生綠色熒光蛋白。

培養(yǎng)條件為：dmem培養(yǎng)基（含10%fbs，1%p/s），37℃恒溫孵箱，5%二氧化碳，95%氧氣。

培養(yǎng)條件中，混合后細胞總量達到以下要求：a、96孔板細胞總量為3000-8000，培養(yǎng)基體積為100ul；b、其他的孔板或者培養(yǎng)皿應根據(jù)其底面積與96孔板的底面積進行比例換算，得到最終的混合細胞量。

混合培養(yǎng)的第一天加入mscf（終濃度為50ng/ml），第三天全換液，培養(yǎng)基中加入50ng/mlmcsf+50ng/mlrankl。

并從第三天起觀察融合細胞的形態(tài)，細胞核數(shù)目和融合細胞的數(shù)目改變。結果如下圖2。

熒光顯微鏡觀察中紅色熒光采用tdtomato適用的檢測參數(shù)，激發(fā)峰554nm，發(fā)射峰581nm；綠色熒光采用egfp適用的檢測參數(shù)，激發(fā)峰488nm，發(fā)射峰507nm。

在熒光顯微鏡下觀察，破骨向分化誘導培養(yǎng)的第3天觀察到一定量的綠色熒光陽性細胞出現(xiàn)。細胞形態(tài)較修長，胞體較小，細胞核多為1-2個。第4-5天觀察到綠色熒光陽性的細胞體積變大，細胞核數(shù)目也增加為2-8個。第6天開始細胞形態(tài)開始出現(xiàn)不對稱性（極性），并且在第7天觀察到融合后多核的綠色熒光細胞相互接近，細胞伸出“偽足樣”細胞突連通，細胞核數(shù)目繼續(xù)增加。第8-10天融合后的綠色熒光細胞的體積更大，細胞形態(tài)較融合初期發(fā)生了明顯的改變，同時細胞核的數(shù)目在第10天為10-16個。

利用這種熒光標記方法第一次使得整個融合過程中破骨細胞的形態(tài)、細胞的移動和融合的細胞行為（如融合前細胞相互接近、融合后的細胞還可以繼續(xù)融合等）清楚地可視化。利用原有的延時攝影技術因其信息有限，模糊粗略且需要依靠觀察者大量的實驗經驗去判斷哪些是融合后細胞，所以無法清晰直觀地觀察到細胞行為的改變和細胞形態(tài)的變化。因此本熒光標記方法直觀，可視，可靠性高，操作簡單。

實施例2

將ctsk-cre轉基因小鼠與rosa^mtmg轉基因小鼠的骨髓單核細胞分離，以1:1的比例混合培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件為：dmem培養(yǎng)基（含10%fbs，1%p/s），37℃恒溫孵箱，5%二氧化碳，95%氧氣。

培養(yǎng)條件中，混合后細胞總量達到以下要求：a、96孔板細胞總量為3000-8000，培養(yǎng)基體積為100ul；b、其他的孔板或者培養(yǎng)皿應根據(jù)其底面積與96孔板的底面積進行比例換算，得到最終的混合細胞量。

混合培養(yǎng)的第一天加入mscf（終濃度為50ng/ml），第三天全換液。

分為不同rankl濃度組和不同pth濃度組，以研究rankl濃度和pth濃度對破骨細胞融合數(shù)目和效率的影響。培養(yǎng)基中加入50ng/mlmcsf，而rankl濃度或pth濃度由低到高分別為5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，150ng/ml,200ng/ml。并從第三天起觀察融合融合后綠色熒光陽性細胞的數(shù)目改變。其中，熒光顯微鏡觀察中紅色熒光采用tdtomato適用的檢測參數(shù)，激發(fā)峰554nm，發(fā)射峰581nm；綠色熒光采用egfp適用的檢測參數(shù)，激發(fā)峰488nm，發(fā)射峰507nm。

結果如下圖3-圖6。

由上述結果可知：破骨細胞融合的數(shù)目隨著rankl濃度的增加而增加，呈現(xiàn)正相關的濃度依賴效應；而破骨細胞融合的數(shù)目與pth的濃度不存在濃度依賴效應。雖然大量的研究已經說明了rankl對于破骨細胞形成的重要作用，但是因為原有技術的局限尚無報道關于rankl對于破骨細胞融合過程的影響。而利用本熒光標記方法首次使得融合的觀察直觀可視化，從而利用簡單地熒光顯微鏡觀察即可在本方法的基礎上可視化地研究rankl對于融合效率和融合過程的影響。

因此，在將來研究可能影響破骨細胞融合的實驗時，也可以利用本熒光標記方法直觀可視地觀察到這些因素對融合過程、融合效率和融合中細胞行為產生了哪些影響，從而為研究破骨細胞融合提供了簡便、可靠的工具。

實施例3

其它內容如實施例1，將ctsk-cre轉基因小鼠與rosa^mtmg轉基因小鼠的骨髓單核細胞分離，以3:1的比例混合培養(yǎng)。

實施例4

其它內容如實施例1，將ctsk-cre轉基因小鼠與rosa^mtmg轉基因小鼠的骨髓單核細胞分離，以1:1的比例混合培養(yǎng)。

同時借助細胞核熒光染料如hoechst或dapi，從而觀察融合過程中細胞核數(shù)目的改變。在熒光顯微鏡下觀察前，可用終濃度為100ng/ml的dapi染色1分鐘或用終濃度為1ug/ml的hoechst染色20分鐘，去除染料后用pbs清洗3次，然后加入100ul的pbs于熒光顯微鏡下進行觀察。從而可以觀察到融合過程中細胞核數(shù)目的改變，從而獲得更多信息使研究更推進一步。