專利名稱：人破骨細(xì)胞衍生的組織蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒別的多核苷酸、由該多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途，以及這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明的多肽為人破骨細(xì)胞衍生的組織蛋白酶(組織蛋白酶O)。本發(fā)明還涉及抑制這種多肽的作用的方法以及鑒定這種多肽的抑制劑的檢測方法。
骨骼再吸收作用涉及同時清除胞外基質(zhì)的無機(jī)和有機(jī)組分，這一過程主要發(fā)生于由破骨細(xì)胞的波動邊緣覆蓋的酸性吞噬體樣胞外區(qū)域內(nèi)，見Barron，et al.，J.Cell Biol.，1012210-22，(1985)。破骨細(xì)胞是多核巨細(xì)胞，其在骨骼再吸收作用中起關(guān)鍵作用。吸附于骨表面的破骨細(xì)胞在破骨細(xì)胞與骨基質(zhì)之間形成一酸性微環(huán)境，在這一微環(huán)境中溶有骨的無機(jī)和有機(jī)成分。據(jù)認(rèn)為有機(jī)成分，主要是I型膠原，是通過蛋白酶消化而溶解，有證據(jù)表明半胱氨酸蛋白酶可能在骨的有機(jī)成分的降解中起主要作用。在半胱氨酸蛋白酶中，組織蛋白酶B、L、N和S在酸性條件下可降解I型膠原，見Etherington，D.J.Biochem.J.，127，685-692(1972)。組織蛋白酶L在水解偶氮酪蛋白、彈性蛋白和膠原的活性方面是最有活性的溶酶體半胱氨酸蛋白酶。
組織蛋白酶是在結(jié)締組織的正常生理性和病理性降解中起作用的蛋白酶，組織蛋白酶在胞內(nèi)蛋白降解和轉(zhuǎn)化、骨骼重建和激素原活化中起主要作用，見Marx，J.L.，Science，235285-286(1987)。組織蛋白酶B、H、L和S是普遍表達(dá)的溶酶體半胱氨酸蛋白酶，屬于胃蛋白酶超級家族，其以恒定的水平發(fā)現(xiàn)于許多人類組織如腎、肝、肺和脾。組織蛋白酶的一些病理作用包括參與血管球性腎炎、關(guān)節(jié)炎和癌癥轉(zhuǎn)移，見Sloa，B.F.，andHonn，K.V.，Cancer Metastasis Rev.，3249-263(1984)。在腫瘤細(xì)胞中可見組織蛋白酶L和BmRNA和蛋白質(zhì)的水平有很大的升高。用腫瘤促進(jìn)因子和生長因子處理的成纖維細(xì)胞中也可誘導(dǎo)組織蛋白酶LmRNA，見Kane，S.E.and Gottesman，M.M.Cancer Biology，1127-136(1990)。
對骨吸收的體外研究表明組織蛋白酶L和B可能參與了這一組織的重建，在酸性條件下，這些溶酶體半胱氨酸蛋白酶消化胞外基質(zhì)蛋白如彈性蛋白、層粘連蛋白和I型膠原，破骨細(xì)胞需要這一活性以在由破骨細(xì)胞完成的骨再生之前降解有機(jī)基質(zhì)。一些天然和合成的半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以有效地抑制這一基質(zhì)的降解。
對分離組織蛋白酶及其在骨吸收中的作用已進(jìn)行了深入的研究，最近從來自兔骨骼中的純化破骨細(xì)胞中分離了OC-2，發(fā)現(xiàn)OC-2編碼與組織蛋白酶L和S在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的可能的半胱氨酸蛋白酶，見Tezuka，K.，et al.，J.Biol.Chem.，2691106-1109(1994)。
已研究了半胱氨酸蛋白酶和膠原蛋白酶的一種抑制劑，Z-Phe-Ala-CHN2，的影響分離的破骨細(xì)胞的再吸收活性的作用，并發(fā)現(xiàn)其在牙質(zhì)中抑制再吸收pit，見Delaisse，J.M.et al.，Bone，8305-313(1987)。另外，還檢測了人重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑在體外對骨吸收的影響，并發(fā)現(xiàn)可顯著抑制由甲狀旁腺素激發(fā)的骨吸收，見Lerner，U.H.and Grubb Anders，Journal of Boneand Mineral Research，7433-439(1989)。另外，已重組生產(chǎn)了編碼人半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶L的cDNA克隆并在T7表達(dá)系統(tǒng)中在E.coli中高水平表達(dá)。重組人組織蛋白酶原L已成功地以高水平表達(dá)并以組織蛋白酶原L和活性加工的組織蛋白酶L的形式純化。該肽原在組織蛋白酶L的折疊和/或加工中的可能的功能的資料以及需要該酶的輕鏈以具有蛋白酶活性的資料是通過表達(dá)和純化在這些區(qū)域中帶有結(jié)構(gòu)改變的突變體酶而獲得的，見Smith，S.M.and Gottesman，M.M.，J.Bio Chem.，26420487-20495，(1989)。還有報道在釀酒酵母中表達(dá)了有功能的人組織蛋白酶S并鑒定了該重組酶，見Bromme，D.et al.，J.BioChem.，2684832-4838(1993)。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了新的成熟多肽，其是破骨細(xì)胞衍生的組織蛋白酶，以及該多肽的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的人破骨細(xì)胞衍生的組織蛋白酶是人源的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了編碼這些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種通過重組技術(shù)生產(chǎn)這些多肽的方法。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了抗抑制這種多肽的作用的的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了這種多肽的拮抗劑，例如可用于抑制這種多肽的作用的小分子抑制劑，例如用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松癥。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了開發(fā)用于鑒別本發(fā)明的多肽的抑制劑的檢測體系的程序。
本發(fā)明的這些及其它方面根據(jù)本文的教導(dǎo)對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將是顯而易見的。
下述附圖旨在說明本發(fā)明的實施方案，并非限制本發(fā)明的范圍。


圖1示出組織蛋白酶O的多核苷酸序列和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列，所示的組織蛋白酶O是該蛋白的預(yù)期的前體形式，其中開始的約15個氨基酸代表前導(dǎo)序列，前115個氨基酸為序列原。使用標(biāo)準(zhǔn)的三字母縮寫表示氨基酸序列。
圖2示出組織蛋白酶O與其它人組織蛋白酶和兔OC-2的氨基酸同源性。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了分離的核酸(多核苷酸)，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽，或者編碼由1994年2月9日保藏的ATCC保藏為75671的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸可以得自衍生于人破骨細(xì)胞瘤細(xì)胞、胎盤、腎或肺的cDNA文庫，本文所述的多核苷酸從衍生自人破骨細(xì)胞瘤細(xì)胞的cDNA文庫中分離。該cDNA插入片段長1619bp，并含有一編碼長度為329個氨基酸的蛋白質(zhì)的開放讀框，所述的蛋白質(zhì)的開始的約15個氨基酸代表前導(dǎo)序列，前115個氨基酸為序列原，因此當(dāng)開始的115個氨基酸序列原(其包括約15個氨基酸的前導(dǎo)序列)被切除后，本發(fā)明的多肽的成熟形式由214個氨基酸組成。由該多核苷酸編碼的多肽在結(jié)構(gòu)上與人組織蛋白酶S相關(guān)，在整個編碼區(qū)有56％相同的氨基酸及71％的相似性。其還與兔OC-2組織蛋白酶結(jié)構(gòu)上相關(guān)，在整個編碼區(qū)有94％相同的氨基酸及97％的相似性。該多肽可在破骨細(xì)胞的溶酶體中或靠近破骨細(xì)胞的胞外發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，并且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1所示的編碼序列相同，或與保藏克隆的編碼序列相同，或者也可以是不同的編碼序列，該編碼序列由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，與圖1的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和另外的編碼序列如前導(dǎo)序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的另外的編碼序列)和非編碼序列如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即僅包括多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或編碼由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的該多核苷酸的等位基因變異體，或是該多核苷酸的非天然發(fā)生的變異體。本發(fā)明還涉及從圖1的多核苷酸序列或用PCR方法擴(kuò)增的圖1的序列的片段構(gòu)建的多核苷酸探針，其可用于篩選破骨細(xì)胞cDNA文庫以推導(dǎo)本發(fā)明的多肽。
因此，本發(fā)明包括編碼圖1所示的相同成熟多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，所述變異體編碼圖1的多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體、置換變異體和增加或插入變異體。
如上所述，多核苷酸可以具有為圖1所示的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列，或保藏克隆的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列。如本領(lǐng)域所公知的，等位基因變異體是多核苷酸的另一種形式，其可以置換、缺失或增加一個或多個核苷酸，但基本上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在同一讀框內(nèi)與有助于多肽從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌的多核苷酸融合，例如前導(dǎo)序列，其是用于控制多肽從細(xì)胞轉(zhuǎn)運的分泌序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種前蛋白(preprotein)，前導(dǎo)序列可以由宿主細(xì)胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸還可編碼一種蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸殘基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白為蛋白原并是蛋白質(zhì)的非活性形式，一旦序列原被切掉，則保留一活性成熟蛋白。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼一成熟蛋白，或編碼一具有序列原的蛋白或一具有序列原和前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸還可以具有在讀框內(nèi)與標(biāo)記序列融合的編碼序列，其可用于純化本發(fā)明的多肽。標(biāo)記序列可以是，例如，由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記物用于在細(xì)菌宿主中純化與該標(biāo)記物融合的成熟多肽，或者，例如，當(dāng)使用哺乳動物宿主如COS-7細(xì)胞時，標(biāo)記序列可以是血凝素標(biāo)記物(HA)。HA標(biāo)記物相應(yīng)于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及可與上述序列雜交的多核苷酸，條件是序列間具有至少50％、優(yōu)選70％的同一性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指雜交僅發(fā)生在序列間具有至少95％、優(yōu)選97％同一性的情況下。在一優(yōu)選的實施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼基本上保持了由圖1的cDNA或保藏的cDNA編碼的成熟多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。
本文所指的保藏物將根據(jù)國際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定期限保藏。這些保藏僅為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，而不是對根據(jù)35 U.S.C 112索取保藏物的許可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及該序列編碼的多肽的氨基酸序列引入本文作參考，并且在與本文的序列描述有抵觸時，其是參照。制造、使用或銷售保藏物需經(jīng)許可，而本文不授予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的組織蛋白酶O多肽，以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)指圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持這些多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括。蛋白原，其可通過裂解蛋白原部分而激活以生產(chǎn)有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中的一或多個氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選由保守的氨基酸殘基取代)，并且這種取代的氨基酸殘基可以由遺傳密碼編碼，也可不是由遺傳密碼編碼，或者(ii)其中的一或多個氨基酸殘基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物例如為增加多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。這種片段、衍生物和類似物被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地以分離的形式提供，并優(yōu)選純化至均一性。
術(shù)語“分離的”是指從其原始環(huán)境(例如，若其是天然存在的則是天然環(huán)境)中脫離的物質(zhì)。例如，存在于活體動物中的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但從一些或所有共存物質(zhì)中分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是某種組合物的一部分，并且如果這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，則其還是分離的。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，以及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等。遺傳工程化的宿主細(xì)胞可以在改良的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，改良培養(yǎng)基是為了激活啟動子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增組織蛋白酶O基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是先前用于選擇用來表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，其對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可通過重組技術(shù)用于生產(chǎn)多肽，因此，例如，該多核苷酸可以包括在任一種表達(dá)載體中特別是載體或質(zhì)粒中以表達(dá)多肽。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；酵母質(zhì)粒；衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA的結(jié)合體的載體；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和擬狂犬病毒。然而，也可使用任何其它載體，只要其在宿主中可復(fù)制和生存。
如上所述，可通過多種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，通常，通過本領(lǐng)域公知的程序?qū)NA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點。這些和其它程序?qū)儆诒绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
可通過各種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，一般地，該DNA序列通過本領(lǐng)域已知的程序插入合適的限制性內(nèi)切酶位點。這些程序和其它程序被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
表達(dá)載體中的DNA序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動子)連接以指導(dǎo)mRNA合成，作為這些啟動子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40啟動子，E.coli lac或trp啟動子，λ噬菌體PL啟動子和其它公知用于控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或者病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還含有一用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一個用于為選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型標(biāo)記的基因，如對于真核細(xì)胞培養(yǎng)為二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如為四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
可采用含有如上所述合適DNA序列以及合適啟動子或調(diào)控序列的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主以使宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。作為合適的宿主的例子，可以提及的有細(xì)菌細(xì)胞，如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏桿菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅和Sf9；動物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞等。選擇合適的宿主細(xì)胞被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
更具體地，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一或多種上述序列。該構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，在該載體中以正向或反向插入本發(fā)明的序列。在這一實施方案的一個優(yōu)選方面，該構(gòu)建體還包括調(diào)節(jié)序列，包括例如，與所述序列連接的啟動子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知大量的合適的載體和啟動子，它們是可商購的。以下舉出載體的例子，細(xì)菌的載體pQE70，PQE60，PQE-9(Qiagen)，Pbs，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLneo，pSV2cat，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它質(zhì)?；蜉d體，只要其可在宿主中復(fù)制和生存即可。
啟動子區(qū)可以選自使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)的載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體的任何所需基因，兩個合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細(xì)菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp；真核啟動子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR，和鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體和啟動子屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范疇。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))將構(gòu)建體導(dǎo)人宿主細(xì)胞。
可以用傳統(tǒng)的方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體以生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。或者，也可通過常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在合適的啟動子的控制下，可以在哺乳細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)成熟蛋白質(zhì)，也可采用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)使用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。原核和真核宿主使用的合適的克隆和表達(dá)載體見Sambrook，et al，Molecular ClonningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，該書引人本文作參考。
高等真核生物對編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可通過在載體中插入一增強(qiáng)子序列而得以增加，增強(qiáng)子是約10-300bp的順式作用的DNA因子，其作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄。其例子包括位于復(fù)制起點晚期側(cè)(100-270bp處)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，以及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點和允許宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，如E.coli的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表達(dá)基因的啟動子以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這種啟動子可以衍生于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白的操縱子。在合適的階段，雜合結(jié)構(gòu)序列裝配上翻譯起始和終止序列，以及優(yōu)選地，裝配一能指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)入周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列。任選地，雜合序列可以編碼一包括N-末端鑒別肽的融合蛋白質(zhì)，以賦予所需的特征，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性和純化簡便性。
用于細(xì)菌的表達(dá)載體的構(gòu)建是通過將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列與合適的翻譯起始和終止信號一起插入帶有功能啟動子的可操縱閱讀相而完成。載體包括一或多種表型選擇標(biāo)記及一個復(fù)制起點以確證載體保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中擴(kuò)增。合適的用于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，當(dāng)然，也可采用其它菌。
作為代表性而非限制性的例子，有用的細(xì)菌表達(dá)載體可以包括衍生于包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商購質(zhì)粒的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點，這些商購質(zhì)粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分與合適的啟動子及待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度改變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選定的啟動子，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時間。
典型地，細(xì)胞由離心收集，用物理或化學(xué)方法破碎，保留得到的粗提物以進(jìn)一步純化。
用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞可用任何常規(guī)方法破碎，如凍-融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎，或使用細(xì)胞裂解試劑，這些方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的。
也可使用各種哺乳細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系，以及其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳類表達(dá)載體包括復(fù)制起點，合適的啟動子和增強(qiáng)子，以及任何必需的核糖體結(jié)合位點，多腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’旁側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列?？墒褂迷醋許V40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點、早期啟動子、增強(qiáng)子、剪接體和多腺苷酸化位點以提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
可通過硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陽離子或陰離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析等方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化組織蛋白酶O。優(yōu)選的是在純化過程中存在低濃度(約0.1-5mM)的鈣離子(Price，etal.，J.Biol.Chem.，244917(1969))。如果需要，可使用蛋白質(zhì)重折疊步驟以完成成熟蛋白的構(gòu)型，最后，可采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是從高表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成過程的產(chǎn)物，或者通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，通過培養(yǎng)細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳類細(xì)胞)而生產(chǎn)。根據(jù)在重組生產(chǎn)過程中采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以用哺乳類或其它真核類的碳水化合物糖基化或是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可以包括一起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的序列還可用于染色體鑒定，該序列特異地定向于個別的人染色體的特定位置并可與之雜交。另外，目前需要鑒定染色體上的特定位點，而現(xiàn)在只有很少幾種基于實際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可以商購用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明的將DNA定位于染色體是將這些序列與相關(guān)疾病的基因聯(lián)系起來的非常重要的第一步。
簡而言之，可通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)而將序列定位在染色體上。使用cDNA的計算機(jī)分析快速選擇長度不超過基因組DNA的一個外顯子并因而不會使擴(kuò)增復(fù)雜化的引物，隨后使用這些引物對含有個別的人染色體的體細(xì)胞雜合子進(jìn)行PCR篩選。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合子能得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
體細(xì)胞雜合子的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的一個快速程序。采用本發(fā)明相同的寡核苷酸引物，可以類似的方式將來自特定染色體的一組片段或大基因組克隆的集合體進(jìn)行亞定位。其它的可類似用于染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流選的染色體進(jìn)行的預(yù)篩選，以及通過雜交預(yù)選以構(gòu)建染色體-特異cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的一步法染色體定位。這一技術(shù)可使用短至500或600個堿基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于與獨特的染色體位置結(jié)合以具有足夠的信號強(qiáng)度便于檢測。FISH需要使用衍生EST的克隆，越長越好。例如，2000bp是好的，更好為4000bp，而超過4000則可能不是獲得好結(jié)果所必須的，因其時間百分比不合理。此技術(shù)的綜述見Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精確定位于染色體某一位置，則可比較該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜資料的關(guān)系，這種資料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance inMan中發(fā)現(xiàn)(可在線從Johns Hopkins University Welch Medical Library獲得)。隨后可通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)鑒別基因與已定位于相同染色體區(qū)的疾病之間的關(guān)系。
接著，必須確定感染個體和未感染個體之間的cDNA或基因組序列的差異，如果在一些或所有感染個體中觀察到某一突變而未在任何正常個體中觀察到這種突變，則該突變可能是該疾病的致病原。
應(yīng)用目前的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)的分辨率，一種精確定位于與疾病有關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可以是50-500個潛在的致病基因中的一個(這假定作圖分辨率為1兆堿基，并且每20kb為一個基因)。
感染個體和未感染個體的比較通常是首先尋找染色體的結(jié)構(gòu)改變，如可從染色體涂片上觀察到的或者用基于該cDNA序列的PCR檢測到的缺失或易位。最后，需要對來自一些個體的基因進(jìn)行全測序以證實存在突變并從多態(tài)性中區(qū)分突變。
本發(fā)明還涉及用反義技術(shù)體內(nèi)抑制組織蛋白酶O，反義技術(shù)通過三螺旋形成或反義DNA或RNA可用于控制基因表達(dá)，這兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，用編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列的5’編碼區(qū)設(shè)計長度為10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計一DNA寡核苷酸以互補(bǔ)于轉(zhuǎn)錄涉及的基因的某區(qū)域(三螺旋-見Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；and Dervanet al，Science，2511360(1991))，從而防止組織蛋白酶O的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸與mRNA體內(nèi)雜交并阻斷mRNA分子翻譯成組織蛋白酶O(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。
或者，上述寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域公知的程序輸送到細(xì)胞，從而反義RNA或DNA可以體內(nèi)表達(dá)以通過上述方式抑制組織蛋白酶O的生產(chǎn)。
因此，組織蛋白酶O的反義構(gòu)建體抑制組織蛋白酶O的作用，并可以用于治療某些疾病，如骨質(zhì)疏松，因為骨吸收已被減慢或阻斷。這些反義構(gòu)建體還可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移，因為在一些腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶的水平有升高，在ras轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞中組織蛋白酶L的mRNA和蛋白質(zhì)增加。另外，有證據(jù)表明轉(zhuǎn)移性B16黑素瘤與非轉(zhuǎn)移性腫瘤相比均增量調(diào)節(jié)組織蛋白酶B。
多肽、其片段或其它衍生物、或其類似物、或表達(dá)其的細(xì)胞可用作免疫原生產(chǎn)抗體，這些抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體，以及Fab片段，或者Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中公知的各種程序生產(chǎn)這些抗體和片段。
抗對應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽或其體內(nèi)受體的抗體可以通過將多肽直接注射給動物或?qū)⒍嚯慕o予動物、優(yōu)選非人而獲得，如此獲得的抗體隨后與多肽本身結(jié)合。以這種方式，僅編碼多肽的一個片段的序列也可用于生產(chǎn)與完整天然多肽結(jié)合的抗體，這種抗體隨后可用于從表達(dá)該多肽的組織中分離該多肽。為制備單克隆抗體，可使用任何提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生產(chǎn)的抗體的技術(shù)，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kozbor et al.，1983，Immunology Today 4∶72)，以及生產(chǎn)人單克隆多肽的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(USP4.946，778)可以用來生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。
通過與多肽的結(jié)合，特異于組織蛋白酶O的抗體可進(jìn)一步用于抑制多肽的生物學(xué)作用，以這種方式，抗體可用于治療例如癌癥，因為在ras轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞中以及加入了佛波酯和生長因子后組織蛋白酶L的mRNA和蛋白質(zhì)增加。另外還可用這些抗體治療骨質(zhì)疏松，因為由組織蛋白酶O造成的骨吸收被抑制。
另外，這種抗體可檢測組織蛋白酶O的存在與否以及組織蛋白酶O的濃度水平，因此，其可用作診斷標(biāo)記以診斷如高轉(zhuǎn)化骨質(zhì)疏松、Paget′s癥、腫瘤骨裂解或其它代謝性骨疾病。這種抗體還可用作腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽的拮抗劑和抑制劑，該拮抗劑和抑制劑抑制或消除該多肽的功能。
因此，例如，拮抗劑可與本發(fā)明的多肽結(jié)合并抑制或消除其功能，拮抗劑例如可以是抗本發(fā)明的多肽的抗體，其通過與組織蛋白酶O結(jié)合而消除組織蛋白酶O的活性，或在某些情況下拮抗劑可以是寡核苷酸。抑制劑的一個例子是與多肽結(jié)合并占據(jù)多肽的催化位點的小分子抑制劑從而使催化位點不能與底物接觸，進(jìn)而防止組織蛋白酶O的生物學(xué)活性，這些小分子抑制劑的例子包括但不限于小肽或類肽分子。
以這些方式，拮抗劑和抑制劑通過阻止組織蛋白酶O的破壞骨骼的作用而可用于治療骨疾病如骨質(zhì)疏松。拮抗劑和抑制劑還可用于治療轉(zhuǎn)移性腫瘤，因為組織蛋白酶在增加轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長方面起作用。
拮抗劑和抑制劑可以與藥物學(xué)可接受載體形成組合物應(yīng)用，這種載體包括但不限于鹽水、緩沖的鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其結(jié)合物。優(yōu)選系統(tǒng)性給予組織蛋白酶抑制劑。在大鼠腹膜內(nèi)注射半胱氨酸蛋白酶抑制劑亮抑蛋白酶肽(0.36mg/kg體重)和E-64(0.18mg/kg體重)能降低血清鈣離子和羥脯氨酸的尿排出，見Delaisse et al.，BBRC，125441-447(1984)。也可直接在易于骨質(zhì)疏松的骨骼區(qū)域如股骨的近頸施用。
本發(fā)明還涉及用于鑒定上述特異于組織蛋白酶O并阻斷其功能的小分子抑制劑的檢測法?？墒褂锰烊坏鞍椎孜锘蚝铣呻臋z測組織蛋白酶O的蛋白裂解活性，抑制劑的阻止這一活性的能力可作為篩選鑒定具有治療過量骨吸收疾病活性的化合物的基礎(chǔ)，見Maciewicz，R.A.and Etheringtin，D.J.，Biochem.J.256433-440(1988)。
這種用于鑒定組織蛋白酶O的抑制劑的檢測法的一個例子是使用與顯色標(biāo)記偶聯(lián)的肽基底物，這種肽底物的一個示意性例子具有通式X-(Y)n-Z，其中X代表合適的氨基保護(hù)基團(tuán)如乙?；⒁宜狨セ蝓０?；Y是任何天然或非天然發(fā)生的氨基酸，其結(jié)合形成組織蛋白酶O識別的底物并在抑制劑不存在的條件下裂解；n代表任意整數(shù)，但通常至少為20；Z代表任何顯色或熒光顯色標(biāo)記如對硝基anelide或n-甲基香豆素，其在由組織蛋白酶O裂解Y基團(tuán)時可被監(jiān)測生色。如果一可能的抑制劑不能抑制組織蛋白酶O，底物(Y基團(tuán))被裂解，則Z在構(gòu)型上有一相應(yīng)改變，這一改變使得當(dāng)使用熒光顯色標(biāo)記時熒光計可檢測到熒光，當(dāng)使用現(xiàn)色標(biāo)記時分光光度計可檢測到顏色。當(dāng)抑制劑成功地抑制組織蛋白酶O使之不能裂解底物時，Y基團(tuán)未被裂解，Z不發(fā)生構(gòu)型改變，從而檢測不到熒光或顏色，表明抑制劑已抑制了組織蛋白酶O的作用。
以下將參照實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解的是，本發(fā)明不受這些實施例的限制。除非另有說明，所有的份或量均為重量份或重量。
為促進(jìn)對下述實施例的理解，以下將描述常用的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！钡拿菍⑿懽帜竝置于前面和/或后跟大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘呤巧藤彽玫降?，或者是公眾可以不受限制地得到的，或者可以根據(jù)公布的程序由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，與所述的這些等效的質(zhì)粒是本領(lǐng)域公知的，并對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用僅作用于DNA的特定序列的限制性酶對DNA的催化裂解。本文所用的各種限制性酶是可商購的，其反應(yīng)條件、輔因子和其它要求對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。為分析目的，典型地，1μg質(zhì)粒或DNA片段使用約2單位的酶，反應(yīng)體積為20μl緩沖液；為分離DNA片段用于構(gòu)建質(zhì)粒的目的，典型地，在較大體積中用20-250單位酶消化5-50μg DNA。對特定限制性酶的合適的緩沖液和底物由廠商提供。通常使用37℃1小時的溫育時間，但可根據(jù)供應(yīng)商的指示而變化。消化后，將反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需片段。
裂解片段的大小分離是根據(jù)Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。
“寡核苷酸”是指可化學(xué)合成的單鏈聚脫氧核苷酸或兩個互補(bǔ)的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成的寡核苷酸沒有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸則不能與另一寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有經(jīng)過脫磷酸化的片段連接。
“連接”是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，etal.，Id.，p.146)。除非另有說明，連接可以采用公知的緩沖液，在每0.5μg約等摩爾的待連接DNA片段使用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)的條件下進(jìn)行。
除非另有說明，使用Graham，F(xiàn).and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。實施例1 破骨細(xì)胞衍生的組織蛋白酶的表達(dá)和純化首先使用對應(yīng)于編碼組織蛋白酶O的DNA序列(ATCC#75671)的5’和3’末端的PCR寡核苷酸引物對該DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增以合成插入片段。5’寡核苷酸引物的序列為5’-GCTAAGGATCCTGGGGGCTCAAGGTT-3’，其含有一BamHI限制性酶位點，后接15個起始于甲硫氨酸起始密碼子后的組織蛋白酶O編碼序列的核苷酸；3’引物序列為5’-GCTAATCTAGATCACATCTTGGGGAA-3’，其含有互補(bǔ)于XbaI位點的序列以及組織蛋白酶O編碼序列的最后12個核苷酸。該限制性酶切位點對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Amp)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)控啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記(6-His)和限制性酶克隆位點。用BamHI和XbaI消化pQE-9載體，隨后將插入片段連接到載體上并保持起始于細(xì)菌RBS的讀框。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株ml 5/rep4(得自Qiagen，商標(biāo)ml 5/rep4)，該菌株含有多拷貝的表達(dá)lacI阻抑物并賦予卡那霉素抗性(Kan)的質(zhì)粒pREP4。在LB平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子并篩選氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中將含有所需構(gòu)建物的克隆培養(yǎng)過夜(O/N)，O/N培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的比例接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞至光密度600(O.D.600)為0.4-0.6。隨后加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度為1mM，通過使lacI阻抑物失活，IPTG誘導(dǎo)激活P/O，使基因表達(dá)水平提高。再培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞溶解在離液劑6M鹽酸胍和50mM NaPO4pH8.0中，在使得與含6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，通過鎳-螯合柱層析(Hochuli，E.etal.，Genetic Engineering，Principles & Methods，1287-98(1990))從溶液中純化溶解的組織蛋白酶O。在6M鹽酸胍，150mM NaPO4pH5.0中從柱中洗脫組織蛋白酶O(95％純)。實施例2 組織蛋白酶O在人組織中的表達(dá)模式使用由組織蛋白酶O的部分cDNA克隆產(chǎn)生的[35S]-標(biāo)記的有義或反義核糖探針作為Northern印跡分析的一部分以探查破骨細(xì)胞瘤組織(其代表單一mRNA種類)和脾組織的冷凍切片，見Current Protocols in Molecular Biology，vol.2，Ausubel et al.，editors，section 14.3。從破骨細(xì)胞瘤組織和脾中分離總RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠上電泳該RNA并轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上。預(yù)雜交后，在42℃將印跡與有義或反義[32P]標(biāo)記的核糖探針以2×106cpm/ml雜交過夜。嚴(yán)格清洗后(0.2×SSC，65℃)，印跡在X-光膠片上曝光。當(dāng)用于與破骨細(xì)胞瘤組織切片原位雜交時，在破骨細(xì)胞中觀察到特異的高水平表達(dá)；在單核細(xì)胞中觀察到一些表達(dá)，但基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞未表達(dá)可檢測到的組織蛋白酶O的mRNA。當(dāng)使用脾組織切片進(jìn)行原位雜交時，未觀察到組織蛋白酶O的表達(dá)。這些資料表明組織蛋白酶O的mRNA在破骨細(xì)胞中以高水平表達(dá)，并似乎選擇性地在這些細(xì)胞中表達(dá)。實施例3 用抗體對組織蛋白酶O進(jìn)行分析制備抗從組織蛋白酶O序列的足以與組織蛋白酶家族其它成員不同的區(qū)域合成的肽的抗體，以在Western印跡中對組織蛋白酶O進(jìn)行特異分析。將抗體親和純化并用于探測破骨細(xì)胞瘤組織的Western印跡。合成肽(AIDASLTSFQFYSK和YDESCNSDNLN)是根據(jù)組織蛋白酶O的預(yù)期序列(對應(yīng)于圖1的248-261和265-275位氨基酸)制備的，選擇該區(qū)域是因為其與組織蛋白酶家族的其它成員具有最低的同一性。該肽用戊二醛與匙孔嘁血藍(lán)蛋白偶聯(lián)，與佐劑混合并注射到兔中。用固定化肽對免疫血清進(jìn)行親和純化，見Drake et al.，Biochemistry，288154-8160(1989)。
組織樣品在SDS-PAGE樣品緩沖液中均質(zhì)并在14％SDS-PAGE上電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上，隨后用牛血清白蛋白封閉。用親和純化的抗肽抗體進(jìn)行免疫印跡，然后用堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二抗體并用顯色底物觀察。根據(jù)預(yù)染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)(Rainbow markers，Amersham)的遷移率確定分子量?？箖煞N不同肽的抗體識別一約29kDa的主帶和約27kDa的次要帶。免疫反應(yīng)性可由用來生產(chǎn)抗體的肽競爭證實信號的特異性。這表明組織蛋白酶O的mRNA確實在組織中表達(dá)，并產(chǎn)生大小與完全加工的組織蛋白酶O一致的蛋白質(zhì)(假定加工類似于相關(guān)的組織蛋白酶)。
根據(jù)以上的教導(dǎo)，對本發(fā)明作出各種改進(jìn)和變動是可能的，因此，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以不同于所述的方式實施。
序列表(1)一般信息(i)申請人HASTINGS，ET AL。(ii)發(fā)明名稱組織蛋白酶O(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELANE(D)州新澤西州(E)國家美國(F)郵編07068(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型35寸軟盤(B)計算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?8/208,007(B)申請日1994年3月8日(C)分類(v)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(vi)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注冊號36，134(C)案號/文檔號325800-95(viii)通訊信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1619堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TCAGATTTCC ATCAGCAGGA TGTGGGGGCT CAAGGTTCTG CTGCTACCTG TGGTGAGCTT 60TGCTCTGTAC CCTGAGGAGA TACTGGACAC CCACTGGGAG CTATGGAAGA AGACCCACAG120GAAGCAATAT AACAACAAGG TGGATGAAAT CTCTCGGCGT TTAATTTGGG AAAAAAACCT180GAAGTATATT TCCATCCATA ACCTTGAGGC TTCTCTTGGT GTCCATACAT ATGAACTGGC240TATGAACCAC CTGGGGGACA TGACCAGTGA AGAGGTGGTT CAGAAGATGA CTGGACTCAA300AGTACCCCTG TCTCATTCCC GCAGTAATGA CACCCTTTAT ATCCCAGAAT GGGAAGGTAG360AGCCCCAGAC TCTGTCGACT ATCGAAAGAA AGGATATGTT ACTCCTGTCA AAAATCAGGG420TCAGTGTGGT TCCTGTTGGG CTTTTAGCTC TGTGGGTGCC CTGGAGGGCC AACTCAAGAA480GAAAACTGGC AAACTCTTAA ATCTGAGTCC CCAGAACCTA GTGGATTGTG TGTCTGAGAA540TGATGGCTGT GGAGGGGGCT ACATGACCAA TGCCTTCCAA TATGTGCAGA AGAACCGGGG600TATTGACTCT GAAGATGCCT ACCCATATGT GGGACAGGAA GAGAGTTGTA TGTACAACCC660AACAGGCAAG GCAGCTAAAT GCAGAGGGTA CAGAGAGATC CCCGAGGGGA ATGAGAAAGC720CCTGAAGAGG GCAGTGGCCC GAGTGGGACC TGTCTCTGTG GCCATTGATG CAAGCCTGAC780CTCCTTCCAG TTTTACAGCA AAGGTGTGTA TTATGATGAA AGCTGCAATA GCGATAATCT840GAACCATGCG GTTTTGGCAG TGGGATATGG AATCCAGAAG GGAAACAAGC ACTGGATAAT900TAAAAACAGC TGGGGAGAAA ACTGGGGAAA CAAAGGATAT ATCCTCATGG CTCGAAATAA960GAACAACGCC TGTGGCATTG CCAACCTGGC CAGCTTCCCC AAGATGTGAC TCCAGCCAGC 1020CAAATCCATC CTGCTCTTCC ATTTCTTCCA CGATGGTGCA GTGTAACGAT GCACTTTGGA 1080AGGGAGTTGG TGTGCTATTT TTGAAGCAGA TGTGGTGATA CTGAGATTGT CTGTTCAGTT 1140TCCCCATTTG TTTGTGCTTC AAATGATCCT TCCTACTTTG CTTCTCTCCA CCCATGACCT 1200TTTTCACTGT GGCCATCAGG ACTTTCCCCT GACAGCTGTG TACTCTTAGG CTAAGAGATG 1260TGACTACAGC CTGCCCCTGA CTGTGTTGTC CCAGGGCTGA TGCTGTACAG GTACAGGCTG 1320GAGATTTTCA CATAGGTTAG ATTCTCATTC ACGGGACTAG TTAGCTTTAA GCACCCTAGA 1380GGACTAGGGT AATCTGACTT CTCACTTCCT AAGTTCCCTT CTATATCCTC AAGGTAGAAA 1440TGTCTATGTT TTCTACTCCA ATTCATAAAT CTATTCATAA GTCTTTGGTA CAAGTTTACA 1500TGATAAAAAG AAATGTGATT TGTCTTCCCT TCTTTGCACT TTTGAAATAA AGTATTTATC 1560TCCTGTCTAC AGTTTAATAA ATAGCATCTA GTACACATTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAA1619(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度329個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala-115-110-105Leu Tyr Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr His Trp Glu Leu Trp Lys-100-95 -90Lys Thr His Arg Lys Gln Tyr Asn Asn Lys Val Asp Glu Ile Ser-85 -80 -75Arg Arg Leu Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Tyr Ile Ser Ile His-70 -65 -60Asn Leu Glu Ala Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ala Met-55 -50 -45Asn His Leu Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met-40 -35 -30Thr Gly Leu Lys Val Pro Leu Ser His Ser Arg Ser Asn Asp Thr-25 -20 -15Leu Tyr Ile Pro Glu Trp Glu Gly Arg Ala Pro Asp Ser Val Asp-10 -5 15Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln10 15 20Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser Val Gly Ala Leu Glu Gly25 30 35Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu Asn Leu Ser Pro Gln40 45 50Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Asp Gly Cys Gly Gly Gly55 60 65Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Lys Asn Arg Gly Ile70 75 80Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Glu Glu Ser Cys85 90 95Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr Arg100 105 110Glu Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala115 120 125Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala Ser Leu Thr Ser130 135 140Phe Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Ser Cys Asn145 150 155Ser Asp Asn Leu Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Ile160 165 170Gln Lys Gly Asn Lys His Trp Ile Ile Lys Gln Ser Trp Gly Glu175 180 185Asn Trp Gly Asn Lys Gly Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys Asn190 195 200Asn Ala Cys Gly Ile Ala Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met205 210
權(quán)利要求
1.一種編碼組織蛋白酶O的分離的多核苷酸，所述的多核苷酸選自如下一組(a)編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的組織蛋白酶O多肽或者所述多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(b)編碼具有由ATCC保藏號75671所含cDNA編碼的氨基酸序列的組織蛋白酶O多肽或者所述多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的組織蛋白酶O。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述的多核苷酸編碼由ATCC保藏號75671的cDNA編碼的組織蛋白酶O多肽。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸，具有圖1所示的組織蛋白酶O的編碼序列。
8.權(quán)利要求2的多核苷酸，具有ATCC保藏號75671所保藏的組織蛋白酶O的編碼序列。
9.含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
10.用權(quán)利要求9的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
11.一種用于生產(chǎn)多肽的方法，包括用權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
12.一種生產(chǎn)能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求9的載體對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化。
13.可與權(quán)利要求2的DNA雜交并編碼具有組織蛋白酶O活性的多肽的分離的DNA。
14.一種多肽，選自如下一組(i)具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的組織蛋白酶O多肽及其片段、類似物和衍生物；(ii)由ATCC保藏號75671的cDNA編碼的組織蛋白酶O多肽及所述多肽的片段、類似物和衍生物。
15.權(quán)利要求14的多肽，其中該多肽是具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的組織蛋白酶O。
16.抗權(quán)利要求14的多肽的抗體。
17.抗權(quán)利要求14的多肽的拮抗劑/抑制劑。
18.治療需要抑制組織蛋白酶O的患者的方法，包括給予患者治療有效量的抗權(quán)利要求14的多肽的拮抗劑。
19.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求14的多肽和一藥物學(xué)可接受載體。
20.治療需要抑制組織蛋白酶O的患者的方法，包括給予患者治療有效量的抗編碼組織蛋白酶O的DNA或RNA的反義構(gòu)建體，以便抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯成組織蛋白酶O。
21.治療需要抑制組織蛋白酶O的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求16的抗體。
22.治療需要抑制組織蛋白酶O的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求17的拮抗劑/抑制劑。
23.一種鑒別組織蛋白酶O的抑制劑的方法，包括將組織蛋白酶O多肽的可能的抑制劑與式X-(Y)。-Z的肽基底物結(jié)合，其中(i)X是一氨基保護(hù)基團(tuán)；(ii)Y是任何天然存在或非天然存在的氨基酸；(iii)n是任何整數(shù)；以及(iv)Z是任何顯色或熒光顯色標(biāo)記；使組織蛋白酶O裂解Y氨基酸基團(tuán)足夠長時間；如果使用熒光顯色標(biāo)記則將肽基底物通過熒光計，如果使用顯色標(biāo)記則將肽基底物通過分光光度計；以及檢測由Z釋放的熒光或顏色的產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明公開了人破骨細(xì)胞衍生的組織蛋白酶(組織蛋白酶0)多肽和編碼這種組織蛋白酶0多肽的DNA(RNA)，還提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法。本發(fā)明還涉及這種多肽的抗體、拮抗劑和抑制劑，它們可用于防止這種多肽的作用并因此可用作治療骨疾病如骨質(zhì)疏松癥和癌癥如腫瘤轉(zhuǎn)移。
文檔編號A61K48/00GK1150754SQ94195094
公開日1997年5月28日 申請日期1994年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月8日
發(fā)明者格雷格·A·海斯廷斯, 馬克·D·亞當(dāng)斯, 克萊爾·M·弗雷澤, 諾曼·H·李, 厄文·F·科克尼斯, 朱迪絲·A·布萊克, 麗莎·M·菲次杰拉爾德, 弗雷德·H·德雷克, 馬克西安·高萬 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司, 史克比徹姆公司