專利名稱：：以pae技術(shù)開發(fā)的抗人rankl單抗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與人核因子KB受體活化因子配體(ReceptorActivatorforNuclearFactorkBLigand,RANKL)結(jié)合的重組抗體,描述了這類抗體對成骨細(xì)胞形成的影響以及在自身免疫疾病、惡性腫瘤以及激素治療引起的骨質(zhì)疏松和股侵蝕等骨病治療中的潛在用途。
背景技術(shù)：
：骨的形成和重建是一個(gè)涉及RANK、RANKL和OPG(osteoprotegerin,成骨素)的十分復(fù)雜的生物學(xué)過程。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞通過各自在骨吸收和骨形成中的作用決定骨量、骨結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度。骨重建是一個(gè)在空間上相關(guān)協(xié)調(diào)的縱貫一生的過程，此間舊的骨質(zhì)被破骨細(xì)胞移走并被具有成骨細(xì)胞的成骨過程所取代。在許多病理狀態(tài)下，再吸收腔的重新填充不完全，這就導(dǎo)致了隨著每一個(gè)重建循環(huán)骨量的凈流失。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和其他情況與重建速率的提高有關(guān)，這種提高使得骨丟失加快并增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)。RANK，也稱為TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)因子(TRANCE)、成骨素配體(OPG)和ODF(成骨細(xì)胞分化分子)，是一種功能性受體，主要出現(xiàn)在破骨細(xì)胞前體和破骨細(xì)胞的表面。許多研究結(jié)果證明，RANKL是一個(gè)在骨吸收中起重要作用的因子，具有加速破骨細(xì)胞分化并引起骨吸收的作用。RANK和RANKL在許多生理功能的調(diào)節(jié)上起著至關(guān)重要的作用，例如骨的動態(tài)平衡、免疫功能、血管疾病和乳腺發(fā)育[3，5-8]。發(fā)現(xiàn)在許多退行性骨病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)和銀屑病關(guān)節(jié)炎中有RANKL的過量表達(dá)。RANKL在免疫系統(tǒng)中也有重要作用，它在輔助性T淋巴細(xì)胞中過量表達(dá)，并被認(rèn)為與樹突狀細(xì)胞成熟有關(guān)。詳細(xì)情況參見(I)BuckleyKA,FraserWD,2003,ReceptoractivatorfornuclearfactorkappaBligandandosteoprotegerinregulatorsofbonephysiologyandimmuneresponses/potentialtherapeuticagentsandbiochemicalmarkers.Ann.Clin.Biochem.39(Pt6):551-6.(2)WhyteMP,MummS,2005,HeritabledisordersoftheRANKL/0PG/RANKsignalingpathway.J.ofmusculoskeletal&neuronalinteractions4(3):254-67.0PG,也稱OCIF(破骨細(xì)胞形成抑制因子)，是一種能抑制破骨細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，為TNFa受體超家族中成員。OPG抑制破骨細(xì)胞前體向成骨細(xì)胞的分化，并可調(diào)節(jié)離體和活體中破骨細(xì)胞的吸收作用。OPG是一種RANK同源物，通過與成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合而起作用，這樣就阻斷了成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞與破骨細(xì)胞前體之間RANKL-RANK配體的相互作用，這樣就阻止了破骨細(xì)胞前體分化為成熟破骨細(xì)胞。//重組人OPG可特異性地作用于骨組織，可提高骨的礦物質(zhì)密度和骨體積。2001年在航天飛機(jī)的微重力條件下測定了OPG對小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)它可以預(yù)防吸收作用的增加，并可保持礦化作用。OPG被用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女和溶骨性骨轉(zhuǎn)移病人降低骨吸收的試驗(yàn)。詳細(xì)情況見KhoslaS，2001，MinireviewTheOPG/RANKL/RANKSystem.Endocrinology,142:5050_5055。OPG可以直接與RANK結(jié)合，并競爭性抑制RANKL與RANK的結(jié)合過程，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和功能。另一方面，OPG可以與RANKL/RANK形成三聚體復(fù)合物，從而直接抑制RANKL/RANK的功能。已發(fā)現(xiàn)，在RANKL或RANK缺失的小鼠中存在骨吸收異常和骨硬化。OPG缺失的小鼠會發(fā)生骨質(zhì)疏松，但注射重組OPG后骨密度得到改善。這些結(jié)果支持RANKL/RANK/0PG構(gòu)成了破骨細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)系統(tǒng)[1，2，5，6]。在動物模型進(jìn)行的研究證明，RANKL阻斷劑可預(yù)防或改善骨質(zhì)疏松、慢性炎癥和惡性腫瘤引起的骨丟失和骨侵蝕，以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、骨髓瘤、骨病和溶骨性轉(zhuǎn)移的研究為基礎(chǔ)，有可能成為人類疾病的治療方法[BekkerPJ,etal,2005,JBoneandMineralRes.,202275-2282,and1，3]。這種因子在成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞以及活化的淋巴細(xì)胞中表達(dá)。RANKL的抑制因子也具有預(yù)防RA和骨轉(zhuǎn)移動物模型中出現(xiàn)的病灶性骨侵蝕。詳見KearnsAE,etal,2008,ReceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligandandosteoprotegerinregulationofboneremodelinginhealthanddisease.EndocrRev.29(2):155-92.在闡明0PG/RANK/RANKL功能及其關(guān)系的基礎(chǔ)上，骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移、骨髓瘤和RA病人的骨質(zhì)疏松、骨丟失和骨侵蝕的機(jī)理已經(jīng)得到基本的闡明。所有這些使我們有可能設(shè)計(jì)和/或開發(fā)治療由多種疾病引起的股侵蝕和骨質(zhì)疏松癥的新的方法[1，3，6]。Amgen公司開發(fā)了Denosumab,這是一種以單克隆抗體技術(shù)為基礎(chǔ)研制的以RANKL為祀點(diǎn)的新一代治療骨質(zhì)疏松和骨侵蝕的藥物(詳見USPatentApplicationNo.20040033535)。骨質(zhì)缺少癥(osteopenia)是指骨的礦物質(zhì)密度低于正常的情況。這可能是由于骨質(zhì)合成速率降低或者骨質(zhì)破壞速率增加或者兩者共同造成的，許多醫(yī)生認(rèn)為這是骨質(zhì)疏松癥的前兆，也被視為絕經(jīng)后或老年性骨質(zhì)疏松癥的前兆。但是，并非每一個(gè)被診斷為骨質(zhì)缺少癥的人都會發(fā)展成骨質(zhì)疏松癥。更準(zhǔn)確地說，骨質(zhì)缺少癥的定義是，骨礦物質(zhì)密度在T值在I.0至2.5的狀態(tài)(詳見1.ffikipedia,thefreeencyclopediaonline；2.WHOScientificGrouponthePreventionandManagementofOsteoporosis(2000Geneva)3.PreventionandmanagementofosteoporosisreportofaWHOscientificgroup"(pdf)http://whqIibdoc.who,int/trs/WHOTRS921.pdf.Retrieved2007-05-31).)如果身體不能形成足量的新骨，過多的舊骨被吸收，或者兩者兼有之，就會發(fā)生骨質(zhì)疏松癥。鈣和磷酸鹽是骨質(zhì)正常形成所需要的兩種必需礦物質(zhì)。整個(gè)青年期，人體利用這些礦物質(zhì)產(chǎn)生骨質(zhì)。如果身體不能得到充足的鈣，或者不能從食物中吸收足夠的鈣，骨的生產(chǎn)或骨組織將受到影響。隨著年齡變老，鈣和磷酸鹽將被身體從骨質(zhì)中吸收回身體，從而使骨組織變脆。這將導(dǎo)致骨質(zhì)變脆，易碎，即使沒有受傷也容易骨折。骨質(zhì)疏松癥的主要原因是絕經(jīng)期婦女雌激素降低和男性睪丸激素降低。50歲以上的婦女和70歲以上的男性發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)更大。有許多因素可以引起骨質(zhì)流失或骨侵蝕。老齡化和婦女絕經(jīng)炎癥，例如類風(fēng)關(guān)，在許多情況下可引起股侵蝕骨質(zhì)硬化癥。惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移和骨髓瘤，可因如下方面而引起股侵蝕(I)因吸收導(dǎo)致溶骨性損傷并在骨組織留下微小的空洞；(2)在不正常的位置引發(fā)異常的骨生長，并導(dǎo)致骨質(zhì)硬化癥。某些激素療法，例如每天服用皮質(zhì)留類藥物(強(qiáng)的松，甲基強(qiáng)的松)超過三個(gè)月，或者服用某些抗癲癇藥物(antiseizuredrugs)。甲狀旁腺功能允進(jìn)飲食失調(diào)，導(dǎo)致I丐攝入不足臥床不起已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與絕經(jīng)和老年性骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的因素，包括伴隨老年化和鈣的攝入量不足而導(dǎo)致的腸道對鈣和其他礦物質(zhì)吸收不足。一些治療方法包括激素治療或膳食補(bǔ)充劑可以延遲這種過程。最近，抗吸收制劑如雙林酸鹽和選擇性雌激素受體修飾劑(SERMs)被用于預(yù)防和治療骨量降低。因此，把這些治療方法與調(diào)節(jié)RANKL活性的分子結(jié)合起來，可能對治療某些骨質(zhì)缺少癥是有用的。單抗治療單抗治療就是用抗體單抗(即mAb)與靶標(biāo)細(xì)胞特異性結(jié)合的治療方法。這將刺激患者的免疫系統(tǒng)攻擊那些細(xì)胞。對任何一種細(xì)胞外或細(xì)胞表面的靶標(biāo)都有可能開發(fā)一種特異性單抗，因此目前正在進(jìn)行的對各種重大疾病如類風(fēng)關(guān)、多發(fā)性硬化和各種惡性腫瘤治療性單抗的研究開發(fā)工作很多。有許多途徑可以把單抗用于治療。例如，單抗治療可以用來破壞惡性腫瘤細(xì)胞，并可通過阻斷特異的細(xì)胞受體防止腫瘤生長。在這類治療方法中還有許多變通，例如放射免疫治療，在此放射性物質(zhì)定位于靶標(biāo)細(xì)胞系，并釋放致死劑量的化學(xué)物質(zhì)。過去十年里，單抗治療獲得兩巨大成功，并在許多重大疾病治療上顯示出巨大的潛力和前景，包括但不限于惡性腫瘤、心血管疾病、炎癥、黃斑變性(maculardegeneration)、移植排斥、多發(fā)性硬化和病毒感染，并顯示出良好的前景。由于其無與倫比的療效，安全性和巨量的市場需求，這類產(chǎn)品的種類正以極高的速度膨脹[9，10，11，12].。至今，獲取單抗的主要途徑是涉及嚙齒類(如小鼠和兔)、靈長類如(如獼猴、猿和猴等)的雜交瘤技術(shù)。在醫(yī)療應(yīng)用中遇到的一個(gè)問題是，這些獲得單抗的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)a(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。盡管鼠科動物的抗體與人的極為相似，但是仍有差異。因此，人的免疫系統(tǒng)把鼠源抗體作為外源物質(zhì)，很快就把它們從循環(huán)系統(tǒng)中清除，并引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。這種情況被稱為產(chǎn)生HACA(人抗嵌合)抗體或者HAMA反應(yīng)。解決這一問題的方法之一是直接從人或者人的細(xì)胞生產(chǎn)抗體。劍橋大學(xué)的AbrahamKarpas利用他的人骨髓瘤細(xì)胞系Kapas_707H建立了人_人雜交瘤技術(shù)，該技術(shù)可以用于生產(chǎn)人單抗的研究。這種細(xì)胞系具有使人體產(chǎn)生的多數(shù)抵抗感染、癌癥，艾滋病和其他病原物的抗體永生化的潛力(KarpasA,etal.,2005,Studiesoffournewhumanmyelomacelllines.LeukLymphoma46(1):101-12)。但是,這在起初并不容易，因?yàn)橐话銇碚f，用抗原免疫人體以產(chǎn)生抗體被認(rèn)為是不符合倫理的，即使對非人動物進(jìn)行免疫也有爭論。另外，產(chǎn)生抗人的組織或人的蛋白的人抗體也不是容易的。另一個(gè)十分重要且明顯的問題是，即使人的免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生很大的分泌抗體的細(xì)胞群，當(dāng)用人開發(fā)新的單抗時(shí)仍然存在這樣的瓶頸在人體內(nèi)，靶點(diǎn)特異性的前體B細(xì)胞的豐度極低，與對人雜交瘤構(gòu)建的需求相比，人體中靶點(diǎn)特異的陽性前體細(xì)胞的比例很低。因此，前體B細(xì)胞的分離、純化和富集成為人雜交瘤中的關(guān)鍵技術(shù)之一。自1980年以來，已經(jīng)嘗試了各種各樣的用重組DNA技術(shù)解決這一問題的方法。其中一種方法把編碼單克隆鼠源抗體的結(jié)合區(qū)的DNA與人體產(chǎn)生抗體的DNA融合。然后用哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)物來表達(dá)這一DNA，產(chǎn)生了半鼠源半人源的抗體。(細(xì)菌不能擔(dān)當(dāng)此任，因?yàn)樗鼈儾荒墚a(chǎn)生這類糖基化蛋白)。過去，科學(xué)家僅僅能夠制造鼠源單抗，由于會引起HAMA反應(yīng)，這種抗體在沒有進(jìn)行人源化的情況下不能用于免疫治療?；蚬こ谈脑爝^的小鼠，也稱之為轉(zhuǎn)基因小鼠，可以用于產(chǎn)生人源抗體[16]，這種技術(shù)已經(jīng)被許多商業(yè)組織所采用I.其UltiMab平臺已投放市場[17]。2.Abgenix-其Xenomouse技術(shù)已投放市場。Abgenix已于2006年4月被Amgen、兼并[18].3.公司的VelocImmune技術(shù)[19]。2OO6年8月，PharmaceuticalResearchandManufacturersofAmerica報(bào)道，美國公司有160種不同的單抗在進(jìn)行臨床研究或在等待FDA批準(zhǔn)[20]。正如過去十年許多成功案例證明的，人源化動物是一種有力的且可重復(fù)的工具。從發(fā)現(xiàn)單抗可以離體產(chǎn)生到現(xiàn)在，科學(xué)家已經(jīng)把目標(biāo)放在產(chǎn)生“全人源”抗體以避免人源化和嵌合抗體的副作用。已發(fā)現(xiàn)兩種成功途徑-噬菌體展示產(chǎn)生的抗體和基因工程改造過的小鼠以產(chǎn)生更像人的抗體。劍橋抗體技術(shù)公司(CAT)是治療性單抗最成功的商業(yè)組織之一。CAT的科學(xué)家證明，噬菌體展示可以用來在線狀噬菌體表達(dá)抗體可變區(qū)。這一結(jié)果發(fā)表在Nature[10]。其他的重要文獻(xiàn)包括參考文獻(xiàn)22，CAT把它的展示技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展成幾種已專利的抗體發(fā)現(xiàn)/功能基因組學(xué)工具，稱之為Proximol[12]和ProAb。ProAb技術(shù)是1997年11月公開的，包括了以帶病和不帶病組織對抗體庫進(jìn)行高通量篩選，而Proximol則利用了一種自由基酶促反應(yīng)在臨近一個(gè)特定蛋白質(zhì)的位置進(jìn)行標(biāo)記[14][15]。抗體庫和噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成為利用非雜交瘤技術(shù)開發(fā)高質(zhì)量抗體的有效方法。在過去二十年里，這些技術(shù)在開發(fā)治療性單抗方面獲得了巨大的進(jìn)步，例如，美國007175996專利及其他文獻(xiàn)公布的定向分子進(jìn)化技術(shù)。這些技術(shù)正在成為抗體成熟等的不可缺少的工具[13，14，15].。RANKL拮抗劑及其在臨床上的應(yīng)用正如上面所述，RANKL是引起骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵因子，大量的研究結(jié)果證明，它是伴隨AnkylosingSpondylitis,Psoriasis,Rhumatoidarthritis的股侵蝕和在全球老年人以及絕經(jīng)后婦女中非常普遍的骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵因子[16，17，18，19，20]。骨質(zhì)疏松癥和股侵蝕發(fā)病人群很大，而且致殘率很高，正在開發(fā)預(yù)防和治療藥物的組織如雨后春筍般涌現(xiàn)[21]。至今，已有若干RANKL拮抗劑進(jìn)入臨床前或臨床研究，例如配體-Fe融合蛋白和抗人RANKL單抗。其中有一些，例如重組OPG和重組治療性單抗，獲得了極有前景的結(jié)果本發(fā)明披露了一種開發(fā)治療性抗體的方法。這種方法包括(I)對一個(gè)全人源Naive組合抗體庫進(jìn)行掏篩，(2)利用程序化人工分子進(jìn)化(PAE)技術(shù)對從上述抗體庫中獲得的單抗的未和力進(jìn)行改進(jìn)，(3)確定具有聞技術(shù)指標(biāo)，主要是聞未和力的單抗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種輕鏈，包含有SEQIDNO2所示的氨基酸序列或其片段。本發(fā)明提供了一種重鏈，包含有SEQIDNO4所示的氨基酸序列或其片段。本發(fā)明提供了一種輕鏈，包含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列或其片段。本發(fā)明提供了一種重鏈，包含有SEQIDNO3所示的核苷酸序列或其片段。本發(fā)明提供了一種對人RANKL特異的全長抗體輕鏈，包含有SEQIDNO5所示的核苷酸序列或其一個(gè)片段。本發(fā)明提供了一種對人RANKL特異的全長抗體重鏈，包含有SEQIDNO6所示的核苷酸序列或其一個(gè)片段。本發(fā)明提供了上述人RANKL特異抗體的一種Fab片段，更佳地，這種Fab是PEG化形式。本發(fā)明提供了上述抗體的全長或Fab形式用于治療絕經(jīng)后婦女或老年人骨質(zhì)疏松或由炎癥疾病、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移、激素治療或其他原因引起的股侵蝕的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有多種藥物，包括雙磷酸鹽類和某些中藥用于治療骨質(zhì)疏松癥和股侵蝕，其療效良好，但仍然有如下一些問題。雙磷酸鹽類(也稱為二磷酸鹽)是一類預(yù)防骨質(zhì)流失的藥物，用來治療骨質(zhì)疏松癥和類似的疾病。骨質(zhì)處于不斷的更新代謝過程中，并由產(chǎn)生骨質(zhì)的成骨細(xì)胞和降解骨質(zhì)的破骨細(xì)胞維持平衡。雙磷酸鹽能夠抑制破骨細(xì)胞對骨質(zhì)的降解。破骨細(xì)胞本身也在不斷更新，正常情況下可通過凋亡這種細(xì)胞的自殺機(jī)制進(jìn)行自身破壞。雙磷酸鹽可以促使破骨細(xì)胞凋亡。雙磷酸鹽的應(yīng)用包括預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松、變形性骨炎(osteitisdeformans)(又稱Paget骨病或畸形性骨炎)、骨轉(zhuǎn)移(有或沒有高血鈣癥)、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、骨發(fā)生不完全以及其他導(dǎo)致骨質(zhì)脆弱的情況。雙磷酸鹽類有以下副作用(詳見http://en.wikipedia.org/wiki/Bisphosphonate#Side-effects)。(I)口服雙磷酸鹽類可引起腸胃不適、食道炎癥和損傷，這是口服含氮制劑的主要問題。服藥后端坐30至60分鐘可防止這種情況發(fā)生。(2)首次靜脈注射雙磷酸鹽類后可出現(xiàn)發(fā)熱和流感癥狀，認(rèn)為這是由于它激活YST細(xì)胞引起的。這些癥狀在以后施藥后不會重復(fù)出現(xiàn)。(3)(3)有輕微破壞電解質(zhì)平衡的風(fēng)險(xiǎn)，但是不需要特別關(guān)注。(4)在慢性腎衰竭中，這類藥物被排泄很慢，需要調(diào)整劑量。(5)雙磷酸鹽類與頜骨壞死有關(guān)，下頜骨的發(fā)生率是上頜骨的兩倍，多數(shù)病例發(fā)生在癌癥病人大劑量靜脈注射之后。牙科手術(shù)(涉及骨的)之后有大約占60%，為此建議，雙磷酸鹽治療應(yīng)當(dāng)推遲到牙科手術(shù)之后，以消除潛在的感染點(diǎn)(可能在任何手術(shù)之前使用抗生素).(6)已報(bào)道了許多骨、關(guān)節(jié)、肌(與)骨骼嚴(yán)重疼痛的患者，這促使進(jìn)行改變標(biāo)示(labelingchanges)。(7)最近的研究指出，雙磷酸鹽(特別是唑來磷酸鹽和阿侖磷酸鹽)的使用是婦女心室纖維顫動的危險(xiǎn)因子。對雙磷酸鹽的炎癥反應(yīng)或血鈣水平的波動揭示了可能的機(jī)理。有研究估計(jì)，3%的心室纖維顫動病例可能是使用阿侖磷酸鹽引起的。但是，直到目前，雙磷酸鹽的有利效果仍然高于這種可能的危險(xiǎn)，盡管嚴(yán)重心室纖維顫動副作用的高危人群(例如心力衰竭、冠狀動脈疾病或糖尿病患者)需要特別護(hù)理。FDA仍未肯定雙磷酸鹽和心室纖維顫動之間的因果關(guān)系。(8)基質(zhì)金屬蛋白酶2可能是與雙磷酸鹽相關(guān)的頜骨壞死的候選基因，因?yàn)樗且种婆c骨質(zhì)異常和心室纖維顫動相關(guān)的唯一已知基因，而這兩種情況都是雙磷酸鹽的副作用。(9)有觀點(diǎn)認(rèn)為，長期使用雙磷酸鹽可導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換(boneturnover)的嚴(yán)重抑制或過度抑制，特別是在股骨粗隆區(qū)。認(rèn)為在骨質(zhì)中存在的微裂縫不能愈合，最終融合放大，導(dǎo)致發(fā)生非典型骨折。這種骨折有難以愈合的傾向，并且通常需要某些類型的骨質(zhì)刺激，例如骨移植，作為次級過程。這種并發(fā)癥并不多見，總骨折減少的好處仍然存在。與現(xiàn)有一線藥物如福善美(Fosamax,由MERK公司出產(chǎn)的雙磷酸鹽藥物)相比,本發(fā)明的產(chǎn)品具有不同的作用機(jī)理，具有更好的療效和安全性。同時(shí)，其他藥物需要每周一次，但本產(chǎn)品一年僅需要注射兩次。本發(fā)明從一個(gè)人抗體庫中分離了一種全人源抗人RANKL抗體，并用PAE技術(shù)對其進(jìn)行了進(jìn)一步改造，從而開發(fā)了一種具有高親合力的治療性單抗，命名為PAE30A。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PAE30A具有中和人RANKL并可在體外和體內(nèi)抑制破骨細(xì)胞的分化、活性和存活。首先，這一產(chǎn)品是一種全人源抗體，其免疫原性顯著降低，使其與嵌合或人源化的單抗相比副作用大大減輕。在醫(yī)療中應(yīng)用的一個(gè)問題是，生產(chǎn)單抗的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的是鼠源抗體。盡管鼠源抗體與人源的很相似，但是它們之間仍有不同。因此，人的免疫系統(tǒng)把鼠源抗體視為外源物質(zhì)，很快把它們從循環(huán)系統(tǒng)中清除掉，從而引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。這種反應(yīng)被稱為產(chǎn)生HACA(人抗嵌合)抗體或HAMA(人抗鼠)抗體。第二，本發(fā)明利用了Fab片段作為這一產(chǎn)品的一種替代形式，這將降低產(chǎn)品的成本而不失去其上述優(yōu)勢。此外，這種結(jié)構(gòu)形式?jīng)]有可能帶來副作用的CDC和ADCC效應(yīng)。第三，這種Fab形式采用了PEG化表面修飾技術(shù)，使其在血液循環(huán)系統(tǒng)中的存活期大大延長，使得這種產(chǎn)品成為緩釋的。PEG化是把聚乙二醇多聚鏈共價(jià)結(jié)合到其他分子(通常是藥物或治療性蛋白)上的過程。PEG化過程通常是把PEG的活性衍生物與目標(biāo)大分子一起溫育來完成。PEG與藥物或治療性蛋白的共價(jià)結(jié)合可以“掩蓋”這種制劑受到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊(降低免疫原性和抗原性)，增加流體動力學(xué)體積(在溶液中的大小)，并通過降低腎臟清除作用而延長其循環(huán)時(shí)間。PEG化還可以為疏水藥物或蛋白提供水溶性。參考文獻(xiàn)I.SchwaberJ，EPCohen，1973，HumanXmousesomaticcellhybridclonesecretingimmunoglobulinsofbothparentaltypes.Nature244(5416):444-7.2.CambrosioA，PKeating,1992,BetweenfactandtechniqueThebeginningsofhybridomatechnology.JHistoryofBiology25(2)175.3.KOhlerG，CMilstein，1975，Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature256:495.4.RiechmannL，MClark，HWaldmann,GWinter，1988，Reshapinghumanantibodiesfortherapy.Nature,332:323-7.PMID3127726.5.SiegelDL,2002,Recombinantmonoclonalantibodytechnology.TransfusioncliniqueetbiologiquejournaldelaSocietefrancaisedetransfusionsanguine9(1):15-22.PMID11889896.6.SchmitzU，AVersmold,PKaufmann,HGFrank，2000，Phagedisplayamoleculartoolforthegenerationofantibodies-areview.Placenta21SupplA:S106-12.7.ModifiedfromCarterPImprovingtheefficacyofantibody-basedcancertherapies.NatRevCancer2001；1:118-1298.TakimotoCH,ECalvo,2008,PrinciplesofOncologicPharmacotherapy!finPazdurR，WagmanLD,CamphausenKA,HoskinsWJCancerManagementAMultidisciplinaryApproach.11ed.2008.9.McCafferty,JGriffiths,A,Winter,G,Chiswell,D,1990,Phageantibodiesfilamentousphagedisplayingantibodyvariabledomains.Nature348:552-554.10.http://bfgp.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/1/2/18911.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1196848912.http://www.ukbusinesspark.co.uk/cay92125.htm13.http://www.sciencedirect.com/science_ob=ArticleURL&—udi=B6T76-3WBNNJS-6&—user=I0&_rdoc=1&—fmt=&—orig=search&—sort=d&—docanchor=&view=c&_searchStrld=960781456&_rerun0rigin=google&—acct=C000050221&—version=l&_urlVersion=0&—userid=10&md5=eacedcd4604792172fcl8143a590a45414.http://www.chidb.com/newsarticles/issue3—I.ASP15.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/749410916.http://www.medarex.com/Development/UltiMAb.htm17.http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detaiI.jspyear=2006&releaseID=83775418.http://www.regeneron.com/velocimmune.html19.PhRMAReportsIdentifiesMorethan400BiotechDrugsinDevelopment.PharmaceuticalTechnology,August24,2006.Retrieved2006-09-04.20.EdwardMSchwarz,TRChristopher,2007,Clinicaldevelopmentofanti-RANKLtherapy,ArthritisResearch&Therapy,9SupplI.21.MarksJD,HRHoogenboom，TPBonnert,JMcCafferty,ADGriffiths,GWinter，1991，By-passingimmunizationhumanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage.JMolBiol,222:581-597.22.CarmenandLJermutus，2002，Conceptsinantibodyphagedisplay!f.BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics1(2):189-203.圖I.哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖?？股鼗駻MP和復(fù)制起點(diǎn)0來自PUC57，真核啟動子Pcmv來自人巨細(xì)胞病毒，SV40Ori和SV40polyA信號來自SV40病毒，抗生素基因Neo來自pcDNA3.I(Invitrogen)。圖2.HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖,顯示純化后目標(biāo)單抗的質(zhì)量。如圖所示,產(chǎn)生的蛋白只有一條帶，積分結(jié)果證明其純度大約為98%。圖3.本發(fā)明的抗體抑制破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以具有與IgG2的Fe相同的單抗PAE36為陰性對照，AMG162為陽性對照。單抗?jié)舛葹?.00，I.00，5.00，10.00，20.00，40.00，80.00，160.00ng/ml。數(shù)據(jù)顯示，3K7F5/Full(在其他描述中也稱為PAE30Full和3K7F5/Fab(也稱為PAE30Fab)可中和RANKL對破骨細(xì)胞形成的刺激效應(yīng)，更為重要的是，這種效應(yīng)具有密切的劑量依賴效應(yīng)。此外，這一數(shù)據(jù)還清楚地顯示，3K7F5/Full和3K7F5/Fab的這種抑制效應(yīng)比其陽性對照更有效。具體實(shí)施例方式提供的以下實(shí)施例，包括實(shí)施的試驗(yàn)和獲得的結(jié)果僅僅用于說明之目的，而不可解釋為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的基本技術(shù)策略包括(I)從一個(gè)全人抗體庫分離對人RANKL具有高親和力的特異性可變區(qū)，(2)利用PAE技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)其親和力，(3)通過一系列離體和活體試驗(yàn)，評價(jià)對骨質(zhì)疏松和股侵蝕的治療價(jià)值。實(shí)施例I:淘篩對人RANKL特異的可變區(qū)片段(I)全人源組合Naive抗體庫的構(gòu)建用來自不同省份、不同民族供血者的3000多份血樣，參照下述文獻(xiàn)提供的方法構(gòu)建了超大規(guī)模抗體庫。用含7%DMSO的YT培養(yǎng)基把從構(gòu)建的抗體庫制備的噬菌體裂解產(chǎn)物稀釋至10E10后，分成I毫升的小份，_80°C保存?zhèn)浜笥谩.HoogenboomHR,andGWinter,1992,By-passingimmunisationhumanantibodiesfromsyntheticrepertoiresofgermlineVHgenesegmentsrearrangedinvitro.JMolBiol，227(2):381-388.2.GriffithsAD,SCWilliams,0Hartley,IMTomlinson，PWaterhouse,WLCrosby,REKontermann,PTJones，NMLow,TJAllison，TDProspero，HRHoogenboom,ANissim，JPLCox，JLHarrison，MZaccolo，EGherardi,GWinter，1994，Isolationofhighaffinityhumanantibodiesdirectlyfromlargesyntheticrepertoires.EMBOJ，13:3245-3260.3.Nissim,A，HRHoogenboom，IMTomlinson，GFlynn,CMidgley,DLane,GWinter，1994，Antibodyfragmentsfroma‘singlepot^phagedisplaylibraryasimmunochemicalreagents.EMBOJ，13:692-698.4.MarksJD,HRHoogenboom，TPBonnert,JMcCafferty,ADGriffiths,GWinter，1991，By-passingimmunizationhumanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage.JMolBiol,222:581-597.5.HaidarisCG,JMalone，LASherrill,JMBliss，AAGaspari,RAInsel，MASullivan，2001，RecombinanthumanantibodysinglechainvariablefragmentsreactivewithCandidaalbicanssurfaceantigens.JImmunolMethods.257(1-2)185-202.(2)對人RANKL進(jìn)行淘篩I.解凍I支TGl菌株并轉(zhuǎn)移至50毫升三角瓶中，加入新鮮的LB培養(yǎng)基至15毫升，37°C225轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)16小時(shí)。2.在40°C培養(yǎng)箱中快速解凍I支上述保存的噬菌體裂解液，加入到上述TGl培養(yǎng)物，37°C225轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)16小時(shí)。3.12000RPM離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一滅菌過的50毫升離心管，4°C保存?zhèn)溆?。其滴度?yīng)達(dá)到2X10E11或更高。4.用重組人sRANKL(Orbigen生產(chǎn))包被一25毫升細(xì)胞培養(yǎng)瓶至少2小時(shí)，然后加入至少3XIOElO噬菌體顆粒。5.37°C溫育I小時(shí)。6.輕輕倒出上清，用含1%Tween-20的IXPBS洗滌10次。7.加入I毫升新制備的處于對數(shù)期的TGl細(xì)菌，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。8.重復(fù)上述步驟3至7四次。9.上述細(xì)胞稀釋至100000細(xì)胞/ml，然后均勻涂鋪到含1%AMP的I.5%瓊脂板上，培養(yǎng)至能分辨出單個(gè)菌落。10.挑選有噬菌班的菌落，接種到10塊96孔深孔板進(jìn)行培養(yǎng)。11.培養(yǎng)完畢，5000RPM離心深孔板20分鐘，然后把上清轉(zhuǎn)移到新的96孔板，封口后4C保存?zhèn)溆谩?2.用濃度為10ug/ml的重組人RANKL包被10塊96孔板，每孔10微升。然后加入上述噬菌體上清I微升，37°C溫育I小時(shí)后，用含1%Tween-20的PBS洗滌10次。13.每孔加入IiilHRP標(biāo)記的羊抗M13單抗，37°C溫育30分鐘后用含I%Tween-20的PBS洗滌10次。14.每孔加入20微升含0.025%DAB的PBS和I微升I%H202,37°C溫育20分鐘后讀取595nm處的光密度。15.選取顏色反應(yīng)最強(qiáng)的孔相對應(yīng)的克隆即為親和力相對高的陽性克隆。本步驟從876個(gè)陽性克隆中鑒定出12個(gè)讀數(shù)相對較高的克隆。如有必要，本步驟可以AMG162作為陽性對照。16.為了測定親和力，從上述12個(gè)克隆制備了少量蛋白樣品。三重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果證明，6E2和3K7的親和力最高。用Scatchard方法(Munsonetal,1980,Anal.BioChem,107220)進(jìn)行的分析證明，其親和力高達(dá)4.27X10E-9和3.56X10E_9nM，相比較而言，后者更好。(3)用PAE技術(shù)進(jìn)行分子進(jìn)化上述結(jié)果表明，3K7的親和力在亞納摩爾水平。用已在PCT/CN2009/074839和CN200910198282.X中詳細(xì)描述的程序化分子進(jìn)化技術(shù)對3K7的親和力進(jìn)行了改良以滿足治療性抗體的要求。為此，對3K7重鏈和輕鏈的⑶R2和⑶R3進(jìn)行突變，構(gòu)建了噬菌體展示的次級抗體庫，以AMG162為陽性對照，以人sRANKL為抗原對該庫進(jìn)行了淘篩。經(jīng)過四輪突變和淘篩，獲得了15個(gè)親和力比陽性對照高的克隆。正如親和力測定結(jié)果所示，受檢的兩個(gè)克隆3K7B8和3K7F5的親和力分別為0.42X和0.17X10E_12nM，明顯高于其陽性對照的平行測定結(jié)果5.23X10E-12nM。克隆3K7F5按照實(shí)施例6的方法測序后用于后續(xù)試驗(yàn)。測序結(jié)果如SEQIDNO.I至SEQIDNO4所示。SEQIDNO.I是輕鏈的可變區(qū)的DNA序列，SEQIDNO.2是推測的輕鏈氨基酸序列。SEQIDNO.3是重鏈的可變區(qū)的DNA序列，SEQIDNO.4是推測的重鏈氨基酸序列。把目標(biāo)基因克隆到哺乳動物表達(dá)載體I.用PR0MEGA公司的質(zhì)粒DNA制備試劑盒從100毫升含有3K7F5質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物制備質(zhì)粒DNA。2.用適合的內(nèi)切酶酶切上述質(zhì)粒，在I.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離片段，重鏈為360bp，輕鏈為320bp。然后用Promega公司或等效的DNA回收試劑盒從膠中回收DNA片段。3.用重疊PCR方法把上述獲得的可變區(qū)片段與相應(yīng)的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼片段拼接成全長的重鏈和輕鏈基因。重疊PCR方法在以下文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述(I)YoungLandDongQ,2004,Two-steptotalgenesynthesismethod,NAR,32(7)e59DOI10.1093/nar/gnh058；(2)RomanRydzanicz,X.SharonZhaoandPhilipE.Johnson,2005,AssemblyPCRoligomaker:atoolfordesigningoligodeoxynucIeotidesforconstructinglongDNAmoleculesforRNAproduction,NAR,V33,W521-ff525doi:10.1093/nar/gki380.恒定區(qū)DNA序列以大寫字母示于SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。這些DNA序列已經(jīng)事先克隆到了pBluescriptIISK的SmaI位點(diǎn)，分別記作pLightCon和pHeavyCon。序列已經(jīng)通過測序驗(yàn)證，并在后續(xù)的重疊PCR中用作模板以與上述獲得的可變區(qū)片段構(gòu)成全長的重鏈和輕鏈。恒定區(qū)與可變區(qū)片段之間的重疊區(qū)域應(yīng)當(dāng)達(dá)到20±16bps，其Tm值應(yīng)當(dāng)為60土1°C。PCR循環(huán)為95°C預(yù)變性2分鐘，然后進(jìn)入20個(gè)循環(huán)95°C10秒-56°C35秒-72°C45秒，最后72°C后延伸5分鐘。連接到恒定區(qū)后形成的重鏈和輕鏈的全長序列示于SEQIDNO.5和SEQIDNo.6。把上述全長重鏈和輕鏈插入到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體phCMV-II(示于圖1，其他哺乳動物表達(dá)載體如Invitrogen的pcDNA3.I,Promega的pCi-Neo也可使用)的相應(yīng)位點(diǎn)。在5’-和3’-分別帶有NheI和NotI位點(diǎn)的重鏈和輕鏈用Nhel/Notl酶切后分別連接到用該酶組合預(yù)切過的PhCMVII上，然后，分離單克隆并進(jìn)行測序驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化DH5a菌株并測序驗(yàn)證。獲得的正確質(zhì)粒記作phCMV_II/3K7F5L和phCMV-II/3K7F5H。這個(gè)克隆用于后續(xù)的試驗(yàn)。實(shí)施例2:重組單抗蛋白的制備I.無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA的制備用帶有phCMV-II/3K7F5L和phCMV-II/3K7F5H質(zhì)粒的細(xì)菌接種IOOmlLB培養(yǎng)基,用Qiagen公司的UltrapurePlasmidDNAPurificationKit制備質(zhì)粒DNA。2.轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)CHO細(xì)胞用上述制備的質(zhì)粒DNA、Invitrogen公司的LipoFamine2000轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程采用廠家提供的方法進(jìn)行。也可使用PEI35000等替代物。3.轉(zhuǎn)染條件(I)向5ml新配制的Ex302培養(yǎng)基(購自Sigma-AIdrich)加入CHODHFR(-)細(xì)胞(ATCCNo.CRL-9096)至終密度2X10E5細(xì)胞/ml。37°C培養(yǎng)48小時(shí)后，450Xg離心10分鐘收集細(xì)胞。(2)加入Iml新鮮的DMEM培養(yǎng)基，輕輕敲打管底以重懸細(xì)胞。然后，用上述準(zhǔn)備的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。(3)48小時(shí)后取樣，取50ul用ELISA檢測表達(dá)情況。如果表達(dá)比較好，則進(jìn)入下一步。(4)加入45ml新鮮EX302培養(yǎng)基，并加入G418至終濃度50ug/ml，37°C培養(yǎng)96小時(shí)。4.抗體的純化。2000RPM離心10分鐘，收集上清。然后，上清順序通過HiTrapProteinAHP、CaptoS和CaptoQ柱。用SDS-PAGE電泳檢定洗脫物的純度。純度應(yīng)達(dá)到95%以上。5.洗脫物拋光用HPSuperdex200，10/300層析對洗脫物進(jìn)行最后的“拋光”，獲、得的產(chǎn)物的純度應(yīng)能達(dá)到>98%(見圖2)。最后拋光過的高純度洗脫物可以在-80°C備用。實(shí)施例3=Fab形式的表達(dá)和重組蛋白的制備(I)構(gòu)建表達(dá)載體帶有上述SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的DNA片段克隆到pC0M3H載體(WuSC,LinYJ,CnouJW,LinCl2004，ConstructionandcharacterizationofaFabrecombinantproteinforJapaneseencephalitisvirusneutralization.Vaccine.25，23(2)163-71)。在5’-帶有NheI和NotI位點(diǎn)的輕鏈用Nhel/Notl酶切后連接到用相同的酶組合預(yù)切過的PC0M3H。然后帶有XhoI和SpeI的重鏈用同樣的酶組合酶切后連接到其XhoI/SpeI位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，在含IPTG/X-gal和氨芐青霉素的瓊脂平板上檢定和分離單克隆，經(jīng)酶切確認(rèn)選中的克隆。把ー個(gè)正確克隆接種到500ml含氨芐青霉素的的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后用ImMIPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生Fab。誘導(dǎo)2小時(shí)候收取上清。(2)純化Fab和PEG化用KappaSelect(GE公司)/離子交換層析/分子篩根據(jù)廠家說明書純化Fab，獲得的廣物按APChampmanetal(1999)[Therapeuticantibodyfragmentswithprolongedinvivohalflife.NatureBiotech.17:780-783]的方法進(jìn)行PEG化和純化,獲得的純化后的PEG化抗人RANKL單抗，即3K7F5Fab_PEG，_80°C儲藏備用。實(shí)施例4:抗體中和能力和親和カ的體外研究I.重組3K7F5及其Fab形式的中和能力(I)對離體破骨細(xì)胞的抑制作用RAW264.7(ATCCNo.TIB-71，Manassas,Va.)是ー種嚙齒類巨噬細(xì)胞系，經(jīng)RANKL誘導(dǎo)可分化成破骨細(xì)胞樣細(xì)胞。Simonetetal.(1997,Cell89:309)和Laceyetal.(1998，Cell93:165)描述了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法。TRAP試驗(yàn)破骨細(xì)胞是多核的TRAP陽性細(xì)胞。RAW264.7是ー種通用的檢測骨質(zhì)疏松癥治療效果的細(xì)胞系。本試驗(yàn)中，在24孔板上按照每孔IX10E4接種RAW細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后加入50ng/mlRANKL以及從10至500ng/ml系列濃度的本發(fā)明的抗體。此后，沒三天更換一次培養(yǎng)基。第六天用上述的TRAP試驗(yàn)方法進(jìn)行TRAP檢測。顯色反應(yīng)后，用Citrate/acetone固定I分鐘,然后用AS-BI作為底物37C處理I小時(shí),然后用Mayer’s蘇木精(SigmaChemicalCo.,St.Louis,Mo.)染色兩分鐘后進(jìn)行干燥、ニ甲苯透明，中性樹脂封片后顯微觀察，計(jì)數(shù)TRAP陽性細(xì)胞(S3核/細(xì)胞的多核破骨細(xì)胞)的數(shù)量。為了檢測本發(fā)明抗體對破骨細(xì)胞形成的抑制功能，向培養(yǎng)物中加入不同劑量的純化抗體，AMG162作為陽性對照，Rituxan作為陰性對照。培養(yǎng)過程中，每三天更換一次培養(yǎng)基。如圖3所示，本發(fā)明的人RANKL特異性單抗能夠中和RANKL的作用，并可次級破骨細(xì)胞的生成。重要的是，這ー結(jié)果說明，本發(fā)明所述抗體的加入抑制了RAW(破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的前體)細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，而這種抑制作用具有量效關(guān)系。這說明，本發(fā)明的抗體具有抗破骨細(xì)胞生成的特性。親和カ分析用Scatchard法(Munsonetal,1980,Anal.BioChem,107:220)對3K7F5/Full和3K7F5/Fab的親和カ進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，其親和カ達(dá)到了8.7Xand6.5X10-12M，而在平行試驗(yàn)中AMG162大約為0.37XIOM0這說明，3K7F5/Full和3K7F5/Fab的親和カ不但比廣泛接受的0.InM的治療性單抗標(biāo)準(zhǔn)高，也高于陽性對照。實(shí)施例5:模式動物試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)72只體重在120至180克的3月齡雌性SD大鼠去卵巣后依體重隨機(jī)分成12組，每組6只。E30PAFull和PAE30Fab(受試組)用來檢測抑制作用，AMG162(ー種抗人RANKLIgG2單抗)為陽性對照，PAE36為陰性對照。PAE36是ー種人⑶20特異性的IgG2單抗，與RANKL不結(jié)合。所有組的動物均在手術(shù)后第三天接受ー個(gè)劑量的抗體注射，劑量分別為0.8，I.6or2.4mg/kg。陰性和陽性對照組分別以相同的方式接受PAE36andAMG162。第84天處死動物，取右側(cè)股骨105°C干燥至恒重后稱重，并測定骨密度和骨鈣含量。腿骨密度用雙能X射線吸收儀(DEXA;PiximusMouseDensitometer,GEMedicalSystems)測定腿骨密度(g/cm2)。測定了整個(gè)股骨和每個(gè)股骨的三個(gè)亞區(qū)，即近端1/3、中部1/3和遠(yuǎn)端1/3的BMD，即單位投影骨面積的礦物質(zhì)含量(g/cm2)。股骨鈣含量用TRACE1200(AuroraBiomedCo.)原子吸收光譜儀測定了股骨的丐含量(mg/g)。統(tǒng)計(jì)分析除特別注明的外，所有數(shù)值均以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用StudentT檢驗(yàn)(SPSSforWindows11.0.1，SPSSInc.，Chicago,IL)對處理組與陽性或陰性對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。對處理組其他變量比較的顯著性檢驗(yàn)采用多變量分析(一般性線性模型)方法進(jìn)行。當(dāng)主效應(yīng)達(dá)到顯著水平(P<0.05)時(shí),用處理組Tukeypost-hoc比較法(p<0.05)進(jìn)行。為了檢驗(yàn)鼠體質(zhì)量和子宮質(zhì)量是否與骨質(zhì)特性有混淆效應(yīng)，所有數(shù)據(jù)均以鼠體質(zhì)量和子宮質(zhì)量作為協(xié)變量進(jìn)行了多變量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于下表。表?？贵w對去卵巢大鼠骨密度和骨鈣含量的影響(土S，n=6)劑量陽性對照陰性對照3K7F5/Full(PAE30A)3K7F5/Fab(mg/kg)(AMG162)(PAE36)(PAE30Fab)0.80.2212±0.0110**0.1961±0.01510.2218±0.0163**++0.2218±0.015**++骨密度------1.60.2218±0.0122**0.1967±0.01620.2225±0.0142**++0.2223±0.015**++(g/cm2)---:---2.40.2223±0.0121林0.1972±0.01560.2229±0.0171**++0.2228±0.017**++0.873.72±1.86**57.84±2.1273.69±3.22**++73.56±2.98林++骨鈣-----1.673.72±1.86**57.84±2.1276.11±8.35**++75.89±7.52**++(mg/g)-----2.473.72±1.86**57.84土2.1277.63±3.27**++77.03±2.97**++*與陰性對照比較；+與陽性對照比較；*或+指P<0.05，林或++指p<0.01.結(jié)果指出，與陰性對照相比，3K7F5/Full，3K7F5/Fab及陽性對照能夠顯著增加骨密度和骨鈣含量(P<0.01);與陽性對照相比，3K7F5/Full和3K7F5/Fab增加骨密度和骨鈣含量的潛カ更高(P<0.01)。另外，3K7F5/Full和3K7F5/Fab見未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。統(tǒng)計(jì)分析表明，(I)去卵巢可顯著降低骨密度和骨鈣含量，說明去卵巢是ー種有效而合理的建模方法；(2)與陽性對照相比，3K7F5/Full和3K7F5/Fab都可以更有效地增加骨密度和骨鈣；(3)所有三種抗RANKL抗體，即陽性對照、3K7F5/Full和3K7F5/Fab均有明顯的劑量依賴性，即存在量效關(guān)系。上述離體和活體試驗(yàn)均證明，3K7F5/Full和3K7F5/Fab兩者都能以良好的量效關(guān)系提高模型動物的骨密度和骨鈣含量，所有這些都是其在其他實(shí)驗(yàn)中潛力的反映。實(shí)施例6:抗人RANKL單抗3K7F5的DNA測序用BigDye測序試劑盒(PE公司產(chǎn)品)對上述抗人RANKL單抗的可變區(qū)進(jìn)行了測序。序列SEQIDNo.I至4是輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列以及推測的氨基酸序列。在推測的氨基酸序列中，主要由根據(jù)Kabat方法確定的CDR區(qū)組成的與抗原結(jié)合的區(qū)域示于以下序列推測的輕鏈氨基酸序列中的CDR區(qū)氨基酸序列(108氨基酸殘基)EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRVSQSARGRYFGffYQQKPGQAPRLLIYGGSSRPTGIPDRFSGSGSGTDFTLTLSRLEPEDFAVFYCQQYLSSPKTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:2)。推測的輕重鏈氨基酸序列中的CDR區(qū)氨基酸序列(122氨基酸殘基)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYVMSWLRQAPGKGLEWVSGLTGSVGSTYYLDSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSVRIEDTPLYYCVKDPGTTVIMSffFDPffGQGTLVTVSS(SEQIDNO:4)。下劃線部分為重鏈和輕鏈的⑶R區(qū)。權(quán)利要求1.一種抗RANKL單抗或其片段，其輕鏈可變區(qū)含有SEQIDNO:7_9所示的⑶R區(qū)為抗原結(jié)合位，其重鏈可變區(qū)含有SEQIDNO10-12所示的⑶R區(qū)為抗原結(jié)合位。2.如權(quán)利要求I所述的抗RANKL單抗或其片段，其特征在于，所述片段是scFv，F(xiàn)ab,Fab’，或抗體片段，或包含所述⑶R區(qū)或與其有85%以上相似性的一部分的全長抗體。3.如權(quán)利要求I所述的抗RANKL單抗或其片段，其特征在于，所述輕鏈包含SEQIDNO:2所示的輕鏈氨基酸序列或其片段，所述重鏈包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列或其片段。4.如權(quán)力要求I所述的抗RANKL單抗或其片段，其特征在于，所述單抗或其抗原結(jié)合片段是PEG化的或非PEG化的，以與多聚物鏈接。5.與RANKL相關(guān)的骨質(zhì)疏松和/或股侵蝕的一種治療和/或預(yù)防方法，是給患者施用含有權(quán)利要求I所述的具有生物活性的抗RANKL抗體或抗體片段。全文摘要本發(fā)明公開了高特異性與人RANKL結(jié)合的抗體，該抗體具有潛在的用于治療與老年化、激素治療和絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥以及骨轉(zhuǎn)移和炎癥引起的股侵蝕。本發(fā)明還公開了其DNA序列和推測的氨基酸序列。文檔編號A61P19/10GK102741286SQ201080001403公開日2012年10月17日申請日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者劉慶法申請人:劉慶法