一種貝伐單抗試劑盒及其抗藥抗體試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫診斷領(lǐng)域，特別是涉及一種貝伐單抗試劑盒及其 抗藥抗體試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)于治療性抗體的研究越來越深入，廣泛應(yīng)用于炎癥疾病、免疫疾 病、傳染病以及癌癥的治療，并且進(jìn)展迅速，涉及到發(fā)病機(jī)理，臨床診斷，臨床治療，預(yù)后，遺 傳，并逐漸發(fā)展到對(duì)相關(guān)藥物給藥過程中產(chǎn)生的抗體即抗藥抗體(ADA)的研究。
[0003] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。VEGF通過血管 內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR2受體激活下游信號(hào)，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、迀移和管狀形成，促進(jìn) 新生血管形成、提高血管通透性，滿足腫瘤細(xì)胞對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)的需求。貝伐單抗 (Bevacizumab，商品名Avastin)是FDA批準(zhǔn)上市的一種重組的人源化單克隆IgGl抗體，分 子量為149kDa，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，能夠結(jié)合VEGF-A全部亞型的作用，阻斷VEGF與 VEGFR2受體相互作用介導(dǎo)的信號(hào)通路，阻斷腫瘤血管生成。經(jīng)臨床驗(yàn)證，Bevacizumab能夠 有效延長(zhǎng)癌癥患者的生存期，在臨床腫瘤的治療中具有重大意義。目前主要用于治療各種 轉(zhuǎn)移性癌癥，如用于聯(lián)合以5-FU為基礎(chǔ)的化療方案一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌以及晚期非小 細(xì)胞肺癌的治療。
[0004] 然而，在使用貝伐單抗治療期間，會(huì)產(chǎn)生針對(duì)其自身的ADA，降低貝伐單抗在血漿 中的濃度水平，隨后疾病癥狀再次出現(xiàn)，甚至加重。因此評(píng)估體內(nèi)VEGF治療性抗體及其相對(duì) 應(yīng)的ADA水平，對(duì)患者進(jìn)行直接監(jiān)測(cè)，輔助醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行病情精確診斷，十分有必要。目前， 對(duì)于ADA的檢測(cè)方法已有報(bào)道，主要為酶聯(lián)免疫吸附法，但該方法存在著不足之處。
[0005] ELISA檢測(cè)ADA，簡(jiǎn)便易行，特異性高，可為臨床對(duì)腫瘤單抗藥物的使用提供更為客 觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但與其他生物檢測(cè)或免疫檢測(cè)比較，這種ELISA檢測(cè)方法、技術(shù)、工具或產(chǎn) 品仍有較多的不足而使其應(yīng)用受限，這些不足主要包括以下幾個(gè)方面： (1) 檢測(cè)試劑在檢測(cè)過程中為開放方式，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢 測(cè)結(jié)果； (2)ELISA方法多采用辣根過氧化物酶進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)范圍和靈敏度都較低。
[0006] (3)ELISA方法的檢測(cè)時(shí)間通常反應(yīng)是一件較長(zhǎng)，完成一個(gè)測(cè)試所需的總時(shí)間一般 在2個(gè)小時(shí)以上，不能完全滿足臨床上的快速診斷的需求。
[0007] (4)ELISA方法不能隨機(jī)進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果存在滯后性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種貝伐單抗試劑盒及其抗藥抗體試劑盒，采 用一種新型化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行測(cè)定。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種貝伐單抗 Bevacizumab試劑盒，包括生物素化抗Bevacizumab抗體、Bevacizumab校準(zhǔn)品、Bevacizumab 質(zhì)控品、AP-抗人IgG1抗體、磁微粒試劑、化學(xué)發(fā)光底物和清洗液，所述生物素化抗Bevacizumab抗體為偶聯(lián)有生物素的抗Bevacizumab抗體，所述AP-抗人IgGl抗體為AP標(biāo)記 的抗人IgG1抗體，所述磁微粒試劑為表面有親和素的納米磁微粒懸浮液。
[00?0]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述生物素化抗Bevacizumab抗體為生物素與抗Bevacizumab抗體分子表面的-NH2基團(tuán)反應(yīng)得到。
[0011] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述磁微粒試劑中磁微粒的直徑為0.1-0.5μηι，所述 磁微粒試劑具有超順磁性。
[0012] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述Bevacizumab校準(zhǔn)品是由含有Bevacizumab的人 血清配制而成，用于得到校準(zhǔn)曲線，所述Bevacizumab質(zhì)控品是由含有Bevacizumab的人血 清配制而成。
[0013] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述化學(xué)發(fā)光底物中包括有3-(2-螺旋金剛烷)-4_ 甲氧基-4- (3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽AMPH)。
[0014] 提供一種Anti-Bevacizumab抗藥抗體試劑盒，包括生物素化Bevacizumab、抗 Bevacizumab抗體校準(zhǔn)品、抗Bevacizumab抗體質(zhì)控品、AP-抗ADA抗體、磁微粒試劑和清洗 液，所述生物素化Bevacizumab為偶聯(lián)有生物素的Bevacizumab，所述AP-抗ADA抗體為AP標(biāo) 記的抗ADA抗體，所述磁微粒試劑為表面有親和素的納米磁微粒懸浮液。
[0015] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述生物素化Bevacizumab為生物素與Bevacizumab 表面的-NH2基團(tuán)反應(yīng)得到。
[0016] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述磁微粒試劑中磁微粒的直徑為0.1-0.5μηι，所述 磁微粒試劑具有超順磁性。
[0017] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述抗Bevacizumab抗體校準(zhǔn)品是由抗Bevacizumab 抗體配制而成，用于得到校準(zhǔn)曲線，所述抗Bevacizumab抗體質(zhì)控品是由抗Bevacizumab抗 體配制而成。
[0018] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述化學(xué)發(fā)光底物中包括有3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽AMPH)。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的貝伐單抗試劑盒及其抗藥抗體試劑盒，采用全自 動(dòng)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，選取堿性磷酸酶AP-金剛燒AMPH)體系，具有穩(wěn)定性好，靈敏度 高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，完成一個(gè)測(cè)試所需的總時(shí)間在50分鐘以 內(nèi)，而且操作簡(jiǎn)易方便，真正實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)全自動(dòng)化。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發(fā)明Bevacizumab試劑盒的檢測(cè)原理圖； 圖2是本發(fā)明Anti-Bevacizumab試劑盒的檢測(cè)原理圖； 圖3是本發(fā)明Bevacizumab試劑盒與國(guó)外知名公司同類產(chǎn)品樣本比對(duì)圖； 圖4是本發(fā)明Bevacizumab試劑盒的實(shí)際檢測(cè)濃度與理論濃度的線性回歸圖； 圖5是本發(fā)明Anti-Bevacizumab試劑盒的實(shí)際檢測(cè)濃度與理論濃度的回歸線性圖。【具體實(shí)施方式】
[0021]下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0022] 實(shí)施例一： 提供一種貝伐單抗1^￥3(^2111]^13試劑盒，包括生物素化抗136￥3(^2111]^13抗體、Bevacizumab校準(zhǔn)品、Bevacizumab質(zhì)控品、AP-抗人IgGl抗體、磁微粒試劑、化學(xué)發(fā)光底物和 清洗液。所述生物素化抗Bevacizumab抗體為偶聯(lián)有生物素的抗Bevacizumab抗體。所述AP-抗人IgGl抗體為AP標(biāo)記的抗人IgGl抗體，是將堿性磷酸酶AP與抗人IgG抗體偶聯(lián)。所述磁微 粒試劑為表面有親和素SA基團(tuán)的納米磁微粒懸浮液。所述清洗液可以是清洗濃縮液，在使 用時(shí)進(jìn)行配制。
[0023] 所述生物素化抗Bevacizumab抗體為生物素與抗Bevacizumab抗體分子表面的-NH2基團(tuán)反應(yīng)得到。所述磁微粒試劑中磁微粒的直徑為0 .l-o. 5μηι，所述磁微粒試劑具有超 順磁性。所述Bevacizumab校準(zhǔn)品是由含有Bevacizumab的人血清配制而成，用于得到校準(zhǔn) 曲線，所述Bevacizumab質(zhì)控品是由含有Bevacizumab的人血清配制而成。所述化學(xué)發(fā)光底 物中包括有3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽 AMPPD，主要成分為金剛烷(AMPH))，在堿性磷酸酶的催化下釋放光子。
[0024]所述檢測(cè)試劑盒是基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)原理來實(shí)現(xiàn)抗藥抗體的免疫含量檢 測(cè)的，其檢測(cè)原理如圖1所示：將單抗藥物樣本Bevacizumab與磁微粒試劑M、生物素化抗 Bevacizumab抗體R1混合，得到樣本-M-R1復(fù)合物，進(jìn)行洗滌，再加入AP-抗人IgGl抗體R2，得 到樣本-M-R1-R2復(fù)合物，進(jìn)行洗滌，再加入化學(xué)發(fā)光底物，測(cè)定發(fā)光結(jié)果。
[0025] 實(shí)施例二： 提供一種Anti-Bevacizumab抗藥抗體檢測(cè)試劑盒，包括生物素化Bevacizumab、抗Bevacizumab抗體校準(zhǔn)品、抗Bevacizumab抗體質(zhì)控品、AP-抗ADA抗體、磁微粒試劑和清洗 液。所述生物素化Bevacizumab為偶聯(lián)有生物素的Bevacizumab。所述AP-抗ADA抗體為AP標(biāo) 記的抗ADA抗體，是將堿性磷酸酶AP與抗ADA(Anti-Bevacizumab)抗體偶聯(lián)。所述磁微粒試 劑為表面有親和素SA基團(tuán)的納米磁微粒懸浮液。所述清洗液可以是清洗濃縮液，在使用時(shí) 進(jìn)行配制。其中ADA指抗藥物抗體Anti-DrugAntibody，這里特指Anti-Bevacizumab。
[0026] 所述生物素化Bevacizumab為生物素與Bevacizumab表面的-NH2基團(tuán)反應(yīng)得到。所 述磁微粒試劑中磁微粒的直徑為〇 . 1-0.5μηι，