一種烏司他丁治療三陰性乳腺癌的模型構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種烏司他丁治療三陰性乳腺癌的模型構(gòu)建方法，該模型構(gòu)建方法包括：構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型；用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型；采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型，本發(fā)明同時公開一種檢測烏司他丁治療三陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法，檢測烏司他丁對TNBC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制；檢測CCL22對腫瘤細(xì)胞周圍treg細(xì)胞的招募，檢測treg細(xì)胞表面GITR的表達(dá)。本發(fā)明針對烏司他丁在乳腺癌中的治療價值的研究在國內(nèi)外均屬首例，針對該藥物影響腫瘤微環(huán)境機(jī)制的研究將為該藥物應(yīng)用于乳腺癌治療特別是三陰性乳腺癌治療的臨床使用提供應(yīng)用基礎(chǔ)研究。
【專利說明】
-種烏司他τ治療Ξ陰性乳腺癌的模型構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于乳腺癌治療領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的模型構(gòu) 建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)明人通過前期研究工作發(fā)現(xiàn)：
[0003] 1)烏司他下抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促使細(xì)胞調(diào)亡，其機(jī)制可能與烏司他下降低免 疫/炎癥因子TNF-a、比-6和IL-10的表達(dá)和調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境有關(guān)。
[0004] 2)烏司他下和泰索帝均可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲、轉(zhuǎn)移，烏司他下 可增強(qiáng)泰索帝的抑制作用，機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β的表達(dá)，抑制血管形成，上皮間皮轉(zhuǎn)化有 關(guān)，同時，也與烏司他下下調(diào)乳腺癌細(xì)胞CXCR4的表達(dá)水平相關(guān)。
[0005] 3)烏司他下聯(lián)合泰索帝抑制乳腺癌增殖及轉(zhuǎn)移，可能與調(diào)節(jié)乳腺癌微環(huán)境中CD4+ CD25+Foxp3巧/CD4 巧相關(guān)。
[0006] 研究表明，烏司他下具有抑制乳腺癌包括Ξ陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC)增殖轉(zhuǎn)移的作用，其中對腫瘤免疫微環(huán)境中化eg的影響可能起著關(guān) 鍵作用。
[0007] Treg促進(jìn)腫瘤發(fā)生免疫逃逸是通過腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的大量趨化因子CCL22招募高表 達(dá)趨化因子受體CCR4的Treg到腫瘤周圍，一方面使腫瘤組織處于免疫抑制環(huán)境中，從而促 進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；另一方面，Treg大量聚集在腫瘤組織周圍，形成富含Treg的細(xì)胞層，可 有效阻礙自然殺傷性細(xì)胞(natural killer cell，NK)和Tc等淋己細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的攻擊。 而腫瘤分泌趨化因子(XL22過程中存在著TGF-e-microRNA-34a-(XL22軸，活化的TGF-β可抑 審lJmicroRNA-34a基因的表達(dá)，從而使趨化因子CCL22產(chǎn)生增加，說明轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β與 趨化因子C化22呈正相關(guān)，因此可W假設(shè)烏司他下通過TGF-曲iicroRNA-34a-C化22軸影響腫 瘤細(xì)胞產(chǎn)生的CCL22數(shù)量。而前期的研究W及文獻(xiàn)均提示烏司他下可降低腫瘤細(xì)胞及淋己 細(xì)胞分泌的TGF-β。因此前期工作中發(fā)現(xiàn)烏司他下降低腫瘤組織周圍及瘤內(nèi)的Treg,可能是 通過作用于TGF-f3microRNA-34a-(XL22軸，降低腫瘤細(xì)胞分泌(XL22的數(shù)量，從而減少腫瘤 組織周圍化eg的聚集，減少腫瘤發(fā)生免疫逃逸，抑制腫瘤增殖、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。另有研究 顯示，Treg表面抑制性免疫受體糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(旨111(3〇(3〇的;[(301(1- induced1:umor necrosis factorreceptor，GITR)，可與DC表面的GITR配體結(jié)合，促進(jìn)Treg 的增殖，并抑制DC表面GITR配體的數(shù)量，使其與其他效應(yīng)性T細(xì)胞的結(jié)合力下降，抑制效應(yīng) 性T細(xì)胞的功能。由此可見，腫瘤細(xì)胞分泌的(XL22和Treg表面的GITR，是調(diào)節(jié)乳腺癌免疫微 環(huán)境的潛在祀點(diǎn)。
[000引目前，關(guān)于烏司他下可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌(XL22,并降低化eg表面GITR的 表達(dá)，抑制Ξ陰性乳腺癌微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量與功能，控制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的資料 尚未報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的模型構(gòu)建方法，旨在研究關(guān) 于烏司他下可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌CCL22,并降低Treg表面GITR的表達(dá)，抑制Ξ陰性 乳腺癌微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量與功能，控制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，為Ξ陰性乳腺癌的有效 治療提供新方向的問題。
[0010]本發(fā)明是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的，
[0011] 一種烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的模型構(gòu)建方法，所述的烏司他下治療Ξ陰性乳 腺癌的模型構(gòu)建方法包括：
[001。構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型；
[0013] 用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型；
[0014] 采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型。
[0015] 本發(fā)明另一目的在于提供一種檢測烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的 方法，所述檢測烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法包括W下步驟：
[0016] 步驟一、通過構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型，采用定量PCR與Western b 101檢測烏司他下對TNBC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制；
[0017] 步驟二、通過用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型，采用流式細(xì)胞 術(shù)與Western blot方法檢測CCL22對腫瘤細(xì)胞周圍treg細(xì)胞的招募，驗(yàn)證CCL22對腫瘤免疫 微環(huán)境的影響；
[0018] 步驟Ξ、通過采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型，應(yīng)用Western blot方法檢測treg 細(xì)胞表面GITR的表達(dá)，驗(yàn)證烏司他下通過Treg細(xì)胞功能的改變對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影 響。
[0019] 進(jìn)一步，所述檢測烏司他下對TNBC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制，采用的方 法為：
[0020] 通過TNBC細(xì)胞模型檢測驗(yàn)證烏司他下對TNBC細(xì)胞中分泌的趨化因子CCL22的量的 改變；
[0021 ] 應(yīng)用烏司他下處理TNBC細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，確認(rèn)RNA質(zhì)量；
[0022] 通過實(shí)時巧光定量PCR檢測CCL22在mRNA水平的表達(dá)改變；
[0023] 應(yīng)用烏司他下處理TNBC細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，確認(rèn)蛋白質(zhì)量；
[0024] 通過Western blot檢測相應(yīng)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，通過比較明確烏司他下對 (XL22在蛋白水平的表達(dá)影響；
[0025] 應(yīng)用烏司他下處理TNBC細(xì)胞，收集培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)，確認(rèn)蛋白質(zhì)質(zhì)量；
[00%] 通過化ISA檢測培養(yǎng)基中CCL22的水平，驗(yàn)證烏司他下對TNBC細(xì)胞中分泌的CCL22 的量的改變。
[0027]進(jìn)一步，所述檢測CCL22對腫瘤細(xì)胞周圍化eg細(xì)胞的招募，驗(yàn)證CCL22對腫瘤免疫 微環(huán)境的影響的方法為：
[002引構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型，
[0029] 用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型，
[0030] 取腫瘤組織，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋己結(jié)中化eg的量，驗(yàn)證檢測 (XL22對化eg的招募作用；檢測腫瘤體積大小，腫瘤組織中化eg表達(dá)的免疫因子比-10、TGF- 0的表達(dá)差異，W及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，通過分析檢測Treg的數(shù)量對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影 響。
[0031] 進(jìn)一步，所述檢測化eg細(xì)胞表面GITR的表達(dá)，驗(yàn)證烏司他下通過化eg細(xì)胞功能的 改變對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響的方法為：
[0032] 通過采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型，用烏司他下處理，比較腫瘤生長轉(zhuǎn)移情 況，研究烏司他下對移植瘤的影響；
[0033] 取腫瘤組織，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋己結(jié)中Treg的量，同時用 western blot法檢測Treg細(xì)胞中GITR的表達(dá)；
[0034] 通過分析檢測烏司他下對GITR的表達(dá)調(diào)節(jié)作用W及對化eg細(xì)胞招募的影響和腫 瘤生物學(xué)行為的影響。
[0035] 進(jìn)一步，所述的分析采用SPSS. 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表示，采用 單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用LSD-t或Tamhane法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05。
[0036] 本發(fā)明針對烏司他下在乳腺癌中的治療價值的研究在國內(nèi)外均屬首例，針對該藥 物影響腫瘤微環(huán)境機(jī)制的研究(如，最新有價值的發(fā)現(xiàn):烏司他下聯(lián)合化療藥物可降低乳腺 癌腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+FOXP3+/CD4巧細(xì)胞的比值)將為該藥物應(yīng)用于乳腺癌治療特別 是Ξ陰性乳腺癌治療的臨床使用提供應(yīng)用基礎(chǔ)研究。
【附圖說明】
[0037] 圖1是本發(fā)明提供的檢測烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法流程 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點(diǎn)及功效，茲例舉W下實(shí)施例，并配合附圖 詳細(xì)說明如下。
[0039] 通過本發(fā)明：
[0040] 1)、烏司他下與環(huán)憐酷胺或泰索帝配伍，抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7/DA-MB-231增殖， 其機(jī)制可能與烏司他下降低免疫、炎癥因子了^-曰、化-6和化-10的表達(dá)和調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境 有關(guān)。
[0041] 2)、烏司他下和泰索帝均可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲、轉(zhuǎn)移，烏司他下 可增強(qiáng)泰索帝的抑制作用，機(jī)制可能與下調(diào)￥66。-(：、66。1?、41〇\了6。-0的表達(dá)，抑制血管形 成，上皮間皮轉(zhuǎn)化有關(guān)，也與烏司他下下調(diào)乳腺癌細(xì)胞CXCR4的表達(dá)水平相關(guān)。
[0042] 3)、烏司他下和泰索帝均可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲，機(jī)制可能與Ε服 受抑，uPA、uPAR、MMP-9表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
[0043] 4)、烏司他下抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促使細(xì)胞調(diào)亡，可能與通過抑制JNk-2和NF-KB 通路減少IGF-1R、PDGFA生成有關(guān)。
[0044] 5)、烏司他下聯(lián)合多西他賽抑制對乳腺癌生長及轉(zhuǎn)移，與降低腫瘤微環(huán)境中CD4+ CD25+FOXP3+/CD4巧細(xì)胞的比值有關(guān)。
[0045] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明詳細(xì)描述。
[0046] 一種烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的模型構(gòu)建方法，所述的烏司他下治療Ξ陰性乳 腺癌的模型構(gòu)建方法包括：
[0047] 構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型；
[004引用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型；
[0049] 采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型。
[0050] 如圖1所示:一種檢測烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法，所述檢測 烏司他下治療Ξ陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法包括W下步驟：
[0化1] S101:通過構(gòu)建(XL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型，采用定量PCR與Western b 1 ot檢測烏司他下對TNBC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制；
[0052] S102:通過用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型，采用流式細(xì)胞術(shù) 與Western blot方法檢測(XL22對腫瘤細(xì)胞周圍treg細(xì)胞的招募，驗(yàn)證(XL22對腫瘤免疫微 環(huán)境的影響；
[0化3] S103:通過采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型，應(yīng)用Western blot方法檢測treg細(xì) 胞表面GITR的表達(dá)，驗(yàn)證烏司他下通過化eg細(xì)胞功能的改變對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影 響。
[0054] 所述檢測烏司他下對TNBC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制，采用的方法為:通 過構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型，
[0055] 應(yīng)用烏司他下處理TNBC細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，確認(rèn)RNA質(zhì)量；
[0056] 通過實(shí)時巧光定量PCR檢測CCL22在mRNA水平的表達(dá)改變；
[0057] 應(yīng)用烏司他下處理TNBC細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，確認(rèn)蛋白質(zhì)量；
[005引通過Western blot檢測相應(yīng)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，通過比較明確烏司他下對 (XL22在蛋白水平的表達(dá)影響；
[0059] 應(yīng)用烏司他下處理TNBC細(xì)胞，收集培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)，確認(rèn)蛋白質(zhì)質(zhì)量；
[0060] 通過化ISA檢測培養(yǎng)基中CCL22的水平，驗(yàn)證烏司他下對TNBC細(xì)胞中分泌的CCL22 的量的改變。
[0061] 所述檢測CCL22對腫瘤細(xì)胞周圍treg細(xì)胞的招募，驗(yàn)證CCL22對腫瘤免疫微環(huán)境的 影響的方法為：
[0062] 構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型，
[0063] 通過用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型，取腫瘤組織，流式細(xì)胞 術(shù)檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋己結(jié)中化eg的量，驗(yàn)證檢測CCL22對化eg的招募作用;檢測腫 瘤體積大小，腫瘤組織中Treg表達(dá)的免疫因子IL-10、TGF-i3的表達(dá)差異，W及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 情況，通過分析檢測Treg的數(shù)量對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響。
[0064] 所述檢測化eg細(xì)胞表面GITR的表達(dá)，驗(yàn)證烏司他下通過化eg細(xì)胞功能的改變對腫 瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響的方法為：
[0065] 通過采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型，用烏司他下處理，比較腫瘤生長轉(zhuǎn)移情 況，研究烏司他下對移植瘤的影響；
[0066] 取腫瘤組織，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋己結(jié)中Treg的量，同時用 western blot法檢測Treg細(xì)胞中GITR的表達(dá)；
[0067] 通過分析檢測烏司他下對GITR的表達(dá)調(diào)節(jié)作用W及對化eg細(xì)胞招募的影響和腫 瘤生物學(xué)行為的影響。
[0068] 所述的分析采用SPSS. 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)WY±S表示，采用單因素 方差分析進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用LSD-t或Tamhane法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05。
[0069] 本發(fā)明針對烏司他下在乳腺癌中的治療價值的研究在國內(nèi)外均屬首例，針對該藥 物影響腫瘤微環(huán)境機(jī)制的研究將為該藥物應(yīng)用于乳腺癌治療特別是Ξ陰性乳腺癌治療的 臨床使用提供應(yīng)用基礎(chǔ)研究。
[0070] 結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0071 ]驗(yàn)證烏司他下在TNBC細(xì)胞中對CCL22表達(dá)的影響與機(jī)制的具體方法包括：
[0072] 步驟一、應(yīng)用空白對照及烏司他下(分低濃度400UI/ml、中濃度800UI/ml、高濃度 1600UI/ml)處理TNBC細(xì)胞(4Tl及MDA-MB-231)，于第12、24、36、48小時提取細(xì)胞RNA，檢測 RNA濃度并確認(rèn)RNA質(zhì)量良好；
[0073] 步驟二、取上述RNA通過逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA文庫，通過實(shí)時巧光定量PCR檢測CCL22在 mRNA水平的表達(dá)，比較烏司他下處理與空白對照組表達(dá)差異及不同濃度烏司他下分組間 (XL22表達(dá)的差異，明確烏司他下對CCL22mRNA表達(dá)的影響；
[0074] 步驟Ξ、應(yīng)用空白對照及不同濃度的烏司他下處理TNBC細(xì)胞(4T1及MDA-MB-231)， 不同時間提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并確認(rèn)蛋白質(zhì)量良好；
[0075] 步驟四、取上述蛋白進(jìn)行Western blot分析，通過CCL22抗體識別，檢測CCL22在蛋 白水平的表達(dá)，比較烏司他下處理與空白對照組表達(dá)差異及不同濃度烏司他下分組間 (XL22表達(dá)的差異，明確烏司他下對CCL22蛋白表達(dá)的影響。
[0076] 步驟五、應(yīng)用空白對照及烏司他下(分低濃度400UI/ml、中濃度800UI/ml、高濃度 1600UI/ml)處理TNBC細(xì)胞(4T1及MDA-MB-231)，于第24、48、72小時收集細(xì)胞培養(yǎng)基，富集培 養(yǎng)基中蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并確認(rèn)蛋白質(zhì)量良好；
[0077] 步驟六、取上述蛋白進(jìn)行化ISA分析，通過CCL22抗體識別，檢測(XL22的量，比較烏 司他下處理與空白對照組表達(dá)差異及不同濃度烏司他下分組間CCL22量的差異，明確烏司 他下對TNBC細(xì)胞外分泌CCL22蛋白量的影響。
[0078] 探討CCL22通過免疫誘導(dǎo)對腫瘤生物學(xué)行為的影響，具體方法為：
[0079] 步驟一、構(gòu)建CCL22過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA干擾質(zhì)粒，通過病毒載體包裝，感染TNBC細(xì) 胞(4T1細(xì)胞），通過篩選得到(XL22過表達(dá)及敲低的細(xì)胞株(4T1-(XL22和4T1-C化22-down細(xì) 胞），通過實(shí)時巧光定量PCR及Western blot在mRNA及蛋白水平驗(yàn)證過表達(dá)及干擾效果；
[0080] 步驟二、培養(yǎng)4T1細(xì)胞、4T1-(XL22和4Tl-CCL22-down細(xì)胞，收集細(xì)胞，行皮下注射 構(gòu)建小鼠荷瘤模型，每組動物為8-10只；
[0081] 步驟Ξ、每3天觀察，測量瘤體體積，繪制移植瘤生長曲線。至移植瘤直徑約1cm時 處死小鼠，取腫瘤組織，一半石蠟包埋用于皿染色及免疫組化檢測，半定量分析腫瘤組織周 圍化eg細(xì)胞的量;一半制作細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析組織中化eg的量，通過上述 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CCL22對Treg的招募作用。同時取小鼠內(nèi)臟組織，分析腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況；
[0082] 步驟四、用上述石蠟包埋組織切片，采用免疫組化法檢測腫瘤組織中化eg表達(dá)的 免疫因子IL-10、TGF-i3等的表達(dá)差異，通過與腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況相關(guān)分析確認(rèn)化eg 的數(shù)量對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響。
[0083] 進(jìn)一步，探討烏司他下對化eg細(xì)胞中GITR表達(dá)的影響的具體方法為：
[0084] 步驟一、培養(yǎng)上述4T1細(xì)胞，收集細(xì)胞，行皮下注射構(gòu)建小鼠荷瘤模型，計劃使用動 物24只；
[0085] 步驟二、分空白對照及不同濃度的烏司他下處理實(shí)驗(yàn)動物，每組8-10只小鼠，共用 2周。每3天觀察，測量瘤體體積，繪制移植瘤生長曲線，比較腫瘤生長轉(zhuǎn)移情況，通過比較分 析明確烏司他下對移植瘤的影響；
[00化]步驟Ξ、至移植瘤直徑約1cm時處死小鼠，取腫瘤組織，一半石蠟包埋用于皿染色 及免疫組化檢測，半定量分析腫瘤組織周圍化eg細(xì)胞的量;一半制作細(xì)胞懸液通過流式細(xì) 胞術(shù)定量分析組織中化eg的量，通過上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CCL22對化eg的招募作用。同時取小鼠內(nèi) 臟組織，分析腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況；
[0087] 步驟四、用上述石蠟包埋組織切片，采用免疫組化法半定量分析腫瘤組織中化eg 細(xì)胞中GITR的表達(dá)，通過相關(guān)分析明確烏司他下對GITR表達(dá)的調(diào)節(jié)，同時與腫瘤生長情況 及轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行相關(guān)分析，探討烏司他下通過調(diào)節(jié)GITR對移植瘤生物學(xué)行為的影響。
[0088] 體內(nèi)驗(yàn)證烏司他下的免疫調(diào)節(jié)作用的具體方法為：
[0089] 步驟一、在臨床中選擇TNBC乳腺癌患者80例，隨機(jī)分組，用安慰劑(n = 40)對照及 烏司他下（1600U/人/天）（n = 40)處理2周；
[0090] 步驟二、用藥3-4周后采患者靜脈血10ml，通過離屯、機(jī)濃聚血細(xì)胞，流式細(xì)胞儀患 者檢測血中化eg細(xì)胞的量；
[0091] 步驟四、比較不同處理對患者Treg細(xì)胞的影響，在體內(nèi)明確烏司他下對化eg細(xì)胞 的調(diào)節(jié)作用。
[0092] 本發(fā)明針對烏司他下在乳腺癌中的治療價值的研究在國內(nèi)外均屬首例，針對該藥 物影響腫瘤微環(huán)境機(jī)制的研究將為該藥物應(yīng)用于乳腺癌治療特別是Ξ陰性乳腺癌治療的 臨床使用提供應(yīng)用基礎(chǔ)研究。
[0093] W上所述僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制， 凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對W上實(shí)施例所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均屬于 本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種烏司他丁治療三陰性乳腺癌的模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述的烏司他丁治 療三陰性乳腺癌的模型構(gòu)建方法包括： 構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型； 用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型； 采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型。2. -種利用權(quán)利要求1所述方法檢測烏司他丁治療三陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方 法，其特征在于，所述檢測烏司他丁治療三陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法包括以下步驟： 步驟一、通過構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型，采用定量PCR與Western blot 檢測烏司他丁對TNBC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制； 步驟二、通過用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型，采用流式細(xì)胞術(shù)與 Western blot方法檢測CCL22對腫瘤細(xì)胞周圍treg細(xì)胞的招募，驗(yàn)證CCL22對腫瘤免疫微環(huán) 境的影響； 步驟三、通過采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型，應(yīng)用Western blot方法檢測treg細(xì)胞 表面GITR的表達(dá)，驗(yàn)證烏司他丁通過Treg細(xì)胞功能的改變對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。3. 如權(quán)利要求2所述的檢測烏司他丁治療三陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法，其特征 在于，所述檢測烏司他丁對TNBC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL22量的抑制，采用的方法為:通過 構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型， 應(yīng)用烏司他丁處理TNBC細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，確認(rèn)RNA質(zhì)量； 通過實(shí)時熒光定量PCR檢測CCL22在mRNA水平的表達(dá)改變； 應(yīng)用烏司他丁處理TNBC細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，確認(rèn)蛋白質(zhì)量； 通過Western blot檢測相應(yīng)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，通過比較明確烏司他丁對CCL22 在蛋白水平的表達(dá)影響； 應(yīng)用烏司他丁處理TNBC細(xì)胞，收集培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)，確認(rèn)蛋白質(zhì)質(zhì)量； 通過EL ISA檢測培養(yǎng)基中CCL22的水平，驗(yàn)證烏司他丁對TNBC細(xì)胞中分泌的CCL22的量 的改變。4. 如權(quán)利要求2所述的檢測烏司他丁在三陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法，其特征在 于，所述檢測CCL22對腫瘤細(xì)胞周圍treg細(xì)胞的招募，驗(yàn)證CCL22對腫瘤免疫微環(huán)境的影響 的方法為： 構(gòu)建CCL22過表達(dá)和敲低的TNBC細(xì)胞模型， 用CCL22過表達(dá)及敲低的4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型， 取腫瘤組織，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋巴結(jié)中Treg的量，驗(yàn)證檢測CCL22 對Treg的招募作用;檢測腫瘤體積大小，腫瘤組織中Treg表達(dá)的免疫因子IL-HKTGF-β的表 達(dá)差異，以及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，通過分析檢測Treg的數(shù)量對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響。5. 如權(quán)利要求2所述的檢測烏司他丁在三陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方法，其特征在 于，所述檢測treg細(xì)胞表面GITR的表達(dá)，驗(yàn)證烏司他丁通過Treg細(xì)胞功能的改變對腫瘤細(xì) 胞生物學(xué)行為的影響的方法為： 通過采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠移植瘤模型，用烏司他丁處理，比較腫瘤生長轉(zhuǎn)移情況，研 究烏司他丁對移植瘤的影響； 取腫瘤組織，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織及腫瘤周圍淋巴結(jié)中Treg的量，同時用western blot法檢測Treg細(xì)胞中GITR的表達(dá)； 通過分析檢測烏司他丁對GITR的表達(dá)調(diào)節(jié)作用以及對Treg細(xì)胞招募的影響和腫瘤生 物學(xué)行為的影響。6.如權(quán)利要求4-5任意一項所述的檢測烏司他丁在三陰性乳腺癌的影響與機(jī)制的方 法，其特征在于，所述的分析采用SPSS. 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以Z土S表示，采用 單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用LSD-t或Tamhane法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05〇
【文檔編號】C12Q1/02GK105920041SQ201610255982
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】孫治君, 陳建生, 高峰, 趙曉亮, 羅杰, 鐘彪, 王宏, 王寧, 孫昕
【申請人】孫治君