專利名稱：：不依賴信號(hào)序列的pIX噬菌體展示的制作方法不依賴信號(hào)序列的plX噬菌體展示
背景技術(shù)：
：用于蛋白鑒定、表征和修飾的組合方法的使用已經(jīng)在學(xué)術(shù)和商業(yè)研發(fā)中取得了巨大成功。在這方面，絲狀噬菌體或噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)鋪平了第一個(gè)文庫平臺(tái)的道路，并依然占據(jù)主導(dǎo)技術(shù)的寶座。因此，噬菌體展示廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)蛋白和應(yīng)用蛋白的發(fā)現(xiàn)以及基于新蛋白的診斷劑和治療劑的開發(fā)中，基于新蛋白的診斷劑和治療劑是世界范圍內(nèi)增加最迅速的化合物類別。組合噬菌體展示技術(shù)的原理是基于每個(gè)病毒粒子將在其表面僅展示由其蛋白外殼包裹的基因組編碼的完全相同蛋白的性質(zhì)所提供的基因型-表型關(guān)聯(lián)。噬菌體粒子本身對(duì)許多理化條件高度耐受；因此，噬菌體展示與競爭組合技術(shù)相比提供在許多篩選方案中的優(yōu)越通用性。已經(jīng)使用絲狀噬菌體外殼的全部五種結(jié)構(gòu)蛋白實(shí)現(xiàn)了異源多肽的噬菌體展示，但只有PlII展示和一定程度上PVIII展示獲得了廣泛使用(圖1)。當(dāng)異源融合體僅是短肽時(shí)，使用基于噬菌體基因組的載體的多價(jià)展示系統(tǒng)是優(yōu)選的，而對(duì)于需要折疊結(jié)構(gòu)域的較大融合體而言，大多數(shù)應(yīng)用將受益于噬菌粒系統(tǒng)。在后一情況下，截至目前，抗體-PiII噬菌體展示主導(dǎo)該領(lǐng)域，但替代支架即將出現(xiàn)，依然需要發(fā)展未來的蛋白工程工具。非常希望的應(yīng)用是簡單地通過噬菌體病毒粒子感染細(xì)菌從噬菌體展示文庫有效獲得高親和力特異性肽或蛋白結(jié)合物而同時(shí)依然結(jié)合其靶。Endemann和Model，1995(PMID:7616570)報(bào)道了次要外殼plX對(duì)融合至其N末端的另一蛋白無功能性。因此，該報(bào)道得出PlX不能用于噬菌體展示的結(jié)論。Gao等人(PMID10339535、12239343和W00071694)和Khalil等人(PMID17360403)二者后來顯示，當(dāng)從噬菌粒表達(dá)并與信號(hào)序列依賴性周質(zhì)靶向組合使用時(shí)，允許N末端plX融合體展示。在這些系統(tǒng)中，由于在噬菌粒拯救時(shí)從輔助噬菌體基因組提供wtPlX而發(fā)生補(bǔ)充。W00071694圖2A(未插入融合蛋白)和TO0071694圖2B(插入融合蛋白)中公開的噬菌粒清楚地包含PelB信號(hào)序列(圖文字在第7頁，第2-14行)。如上所述，之前已經(jīng)表明，PlX對(duì)融合至N末端的另一蛋白無功能性，并且Gao等人提出其成功的單獨(dú)的兩個(gè)可能原因或兩者組合。一個(gè)可能的原因是原核前導(dǎo)序列(信號(hào)序列)N末端連接至融合蛋白，由此保證重組蛋白靶向周質(zhì)空間，并從而防止在胞質(zhì)中的累積。另一個(gè)可能的原因是，如根據(jù)Endemarm和Model，重組蛋白從噬菌粒而非噬菌體基因組表達(dá)，因此，來自噬菌粒拯救所必需的輔助噬菌體的野生型PlX補(bǔ)充重組PlX融合蛋白，由此保留了野生型功能性，否則野生型功能性可能由于重組修飾而喪失。S卩，噬菌體將包含野生型蛋白和融合蛋白的混合物。Khalil等人(PMID:17360403)描述了利用雙特異性絲狀噬菌體病毒粒子特征的應(yīng)用，其中外源性肽展示在完全相同的病毒粒子的每個(gè)遠(yuǎn)端。他們通過使用普通PlII噬菌體基因組載體補(bǔ)充原核信號(hào)序列依賴性PlX展示噬菌粒的組合來實(shí)現(xiàn)該目的。在這種情況下，噬菌體基因組載體用作拯救噬菌粒的輔助噬菌體。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于在絲狀噬菌體上展示的肽的替代支架。本發(fā)明第一個(gè)方面是源自絲狀噬菌體的PlX融合蛋白，所述融合蛋白不包含原核N末端信號(hào)序列并因此直接融合至外源性肽。本發(fā)明另一方面涉及編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸。本發(fā)明一個(gè)方面涉及包含本發(fā)明融合蛋白的絲狀噬菌體。本發(fā)明另一方面涉及絲狀噬菌體文庫。本發(fā)明另一方面涉及包含噬菌粒和輔助噬菌體的噬菌體展示系統(tǒng)，其中所述噬菌粒包含編碼本發(fā)明PlX融合蛋白的核酸。一個(gè)方面涉及包含噬菌體展示系統(tǒng)的試劑盒，所述噬菌體展示系統(tǒng)包含噬菌粒和輔助噬菌體，其中所述噬菌粒包含編碼本發(fā)明pIX融合蛋白的核酸。附圖簡述圖1絲狀噬菌體結(jié)構(gòu)的示意圖。病毒粒子由包裹單鏈DNA分子的五種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成。在野生型(wt)噬菌體中，存在大約2700拷貝的pVIII和大約3-5拷貝的四種蛋白pill、pVI、pVII和pIX的每一種，它們存在于病毒粒子的每個(gè)末端。病毒粒子大小取決于基因組大小，每個(gè)PVIII外殼蛋白大約2.3個(gè)核苷酸，因此粒子長度適應(yīng)插入的pVIII拷貝的增加或減少。值得注意的是，PlII和pVIII結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過χ射線纖維衍射、結(jié)晶學(xué)和NMR表征。次要外殼蛋白PlII含有被甘氨酸富集區(qū)分隔的三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域Al(結(jié)合TolA)、N2(結(jié)合F菌毛)和CT(整合入病毒粒子并且對(duì)于正常的病毒粒子裝配是重要的)。圖2新型pGALD9(A)和pGALD97ΔL(Β)ρΙΧ展示噬菌粒的示意圖。兩種噬菌粒的載體主鏈都基于PlII展示噬菌粒pSEX81(SEQIDNO2)，其序列可以根據(jù)GenBank登錄號(hào)Y14584獲得，并且構(gòu)建細(xì)節(jié)描述于材料與方法。兩種噬菌?？梢苑謩e通過Ncol/Hindlll和MluI/NotI部分的簡單盒交換而容納框內(nèi)(inframe)外源序列的區(qū)段(稱為El和E2)。所述盒由合成連接體序列連接，合成連接體在本文描述的不同構(gòu)建體中不同。縮寫laCP0，lac啟動(dòng)子；sd，Shine-Dalgarno序列；pelB，細(xì)菌果膠酸裂合酶的信號(hào)序列；TP，胰蛋白酶位點(diǎn)；t，T7轉(zhuǎn)錄終止子。圖3從pGALD9AL、pGALD9、pSEX81展示的(A)scFv抗phOx(SEQIDNO:11)和(C)scFv抗NIP的噬菌粒滴度。所有噬菌粒含有氨芐西林抗性標(biāo)記；因此，滴度顯示為每毫升溶液的氨芐西林抗性菌落形成單位(cfuamp7ml)。從pGALD9ΔL、pGALD9、pSEX81展示的(B)scFv抗phOx(SEQIDNO11)和(D)scFv抗NIP的噬菌粒與輔助噬菌體的比顯示為噬菌粒滴度(cfuampE/ml)除以輔助噬菌體滴度(CfukanVml)的比。病毒粒子的包裝通過超級(jí)感染后在不含IPTG(基礎(chǔ)表達(dá))或含有終濃度0.ImM的IPTG(IPTG誘導(dǎo))下的標(biāo)準(zhǔn)噬菌粒拯救來進(jìn)行，如材料與方法中所描述。圖4比較pIX和pill之間帶有和不帶有信號(hào)序列(AL)的功能性(A)scFv抗phOx(SEQIDNO11)和(B)scFv抗NIP(SEQIDNO3)展示的抗原特異性ELISA。ELISA如材料與方法中所述進(jìn)行，使用100μ1/孔含有病毒粒子的清澈上清液?？功?3胃是病毒粒子檢測Mab對(duì)抗原非特異性吸附和阻斷的陰性對(duì)照。(C和D)重復(fù)A和B中的ELISA，但是在信號(hào)飽和之前停止發(fā)展，并使用抗原反應(yīng)性確定相對(duì)展示水平，該相對(duì)展示水平為滴度的函數(shù)。圖5親和篩選中表觀靶-特異性富集取決于衣殼展示支架、感興趣蛋白(POI)的表達(dá)和洗脫條件。第1輪和第2輪篩選之后，通過ELISA評(píng)估來自8個(gè)phOx-峰文庫/NIP-峰文庫的每一個(gè)的等體積的含有未滴定的病毒粒子的上清液的抗原反應(yīng)性。第0輪對(duì)應(yīng)于lX1010cfuampE的峰輸入。為了估計(jì)可能的最大響應(yīng)，包括入在第0輪中得到的峰濃縮物的克隆上清液，描述的結(jié)果通過減去背景的信號(hào)作為由圓錐形表示的可能最大應(yīng)答的分?jǐn)?shù)給出ο發(fā)明詳述應(yīng)該注意，本發(fā)明一個(gè)方面上下文中描述的實(shí)施方案和特征也適用于本發(fā)明的其他方面。本申請(qǐng)中引用的所有專利和非專利參考文獻(xiàn)在此通過引用整體并入。我們?cè)诖颂岢隽诵碌母拍?，其中絲狀噬菌體病毒粒子的結(jié)構(gòu)外殼蛋白pIX被遺傳地改變，使得修飾形式編碼N末端肽或蛋白結(jié)構(gòu)域。pIX融合蛋白一方面，本發(fā)明提供了源自絲狀噬菌體的pIX融合蛋白，所述融合蛋白包含外源性肽與Pix的N末端的融合。這種融合蛋白用于例如噬菌體展示環(huán)境中。當(dāng)提及外源性肽時(shí)，是指最初不是pIX蛋白部分的肽，帶有或不帶有在融合蛋白的PlX氨基酸部分N末端的任何連接體氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼融合蛋白的核酸不包含原核N末端信號(hào)序列。本文使用的術(shù)語肽涵蓋短肽、多肽、蛋白及其片段。術(shù)語pIX蛋白指公開于(SEQIDNO1(MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，pIX蛋白包含與SEQIDNO1具有至少70%序列同一性、例如75%同一性、例如80%同一性、例如81%同一性、例如82%同一性、例如83%同一性、例如84%同一性、例如85%同一性、例如86%同一性、例如87%同一性、例如88%同一性、例如89%同一性、例如90%同一性、例如91%同一性、例如92%同一性、例如93%同一性、例如94%同一性、例如95%同一性、例如96%同一性、例如97%同一性、例如98%同一性、例如99%同一性的氨基酸。序列同一性通常定義的"同一性"在此被定義為基因或蛋白之間分別在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。因此，在本上下文中，“序列同一性"是蛋白質(zhì)之間氨基酸水平上同一性的量度和核酸之間核苷酸水平上同一性的量度。蛋白序列同一性可以通過序列比對(duì)時(shí)比較每個(gè)序列中給定位置的氨基酸序列來確定。類似地，核酸序列同一性可以通過序列比對(duì)時(shí)比較每5個(gè)序列中給定位置的核苷酸序列來確定。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同一性百分比，為了最佳比較目的而比對(duì)序列(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以與第二氨基酸或核酸序列進(jìn)行最佳比對(duì))。然后比較相應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是相同的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是序列共有的相同位置數(shù)目的函數(shù)(即，％同一性=相同位置數(shù)目/位置(例如，重疊位置)總數(shù)目X100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列長度相同?？梢匀斯け葘?duì)序列并計(jì)數(shù)相同氨基酸數(shù)目?？蛇x地，為確定同一性百分比的兩個(gè)序列的比對(duì)可以使用數(shù)學(xué)算法來完成。這種算法并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人1990)。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序進(jìn)行，評(píng)分=100，字長=12，以獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，評(píng)分=50，字長=3，以獲得與本發(fā)明蛋白分子同源的氨基酸序列。為了比較目的獲得空位比對(duì)，可以使用空位BLAST?？蛇x地，可以使用PSI-Blast進(jìn)行迭代檢索，檢測分子之間遠(yuǎn)緣關(guān)系。當(dāng)使用NBLAST、XBLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序的缺省參數(shù)。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov?？蛇x地，序列同一性可以在例如通過EMBL數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)比對(duì)之后來計(jì)算。一般，關(guān)于例如"評(píng)分矩陣〃和"空位罰分〃的缺省設(shè)置可以用于比對(duì)。在本發(fā)明上下文中，BLASTN和PSIBLAST缺省設(shè)置可能是有利的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比可以使用類似于上文描述的那些技術(shù)來確定，并允許或不允許空位。在計(jì)算同一性百分比時(shí)，僅計(jì)數(shù)精確匹配。折疊蛋白在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語肽專門指折疊蛋白，例如抗體衍生的結(jié)構(gòu)域。技術(shù)人員將理解，折疊蛋白可以是抗體或其片段包括FV、SCFV、Fab，單結(jié)構(gòu)域，蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域或其片段(親和體(AfTibody))，錨蛋白或其片段，DARPin或其片段，T細(xì)胞受體或其片段，I類MHC或II類MHC或其片段，纖連蛋白或其片段，Anticalin或其片段，PDZ結(jié)構(gòu)域或其片段，IgNAR或其片段，CTLA4或其片段，ImmE7或其片段，打結(jié)素(Knottin)或其片段，avimer或其片段，GFP或其片段，和其他基因編碼的生物熒光團(tuán)。原則上，只要物質(zhì)被展示，可以制備任何物質(zhì)的文庫，因此以其最簡單的形式，可以僅分離與折疊的有序結(jié)構(gòu)相比具有非結(jié)構(gòu)構(gòu)型的物質(zhì)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語肽專門指2至50個(gè)氨基酸的短肽。在一定長度上，短的無規(guī)卷曲肽長度足以采用確定的二級(jí)或三級(jí)折疊，并因此進(jìn)入折疊結(jié)構(gòu)域定義。顯然，這將取決于化學(xué)組成，因此，一個(gè)20氨基酸的肽將依然是無規(guī)卷曲，而另一個(gè)20氨基酸的肽可以被折疊并落入折疊結(jié)構(gòu)域定義。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的pIX融合蛋白包括選自由SEQIDNO=I的位置1-32、2-32、3-32、4-32、5-32、6-32、7-32、8-32、9-32、10-32、11-32和12-32組成的組的序列。原則上，在噬菌粒上下文中，考慮到保留跨膜部分并允許正常的病毒粒子并入和裝配，可以設(shè)想PlX的任何N末端修飾。SEQIDNO:1(MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSQ是絲狀噬菌體的結(jié)構(gòu)外殼蛋白pix(野生型pix)的氨基酸序列。最優(yōu)選地，PlX融合蛋白包括SEQIDN0:1的位置1-32。SEQIDNO=I不應(yīng)與下文描述的信號(hào)序列/前導(dǎo)序列相混淆。信號(hào)序列優(yōu)選地，外源性肽用或不用任何連接體氨基酸而直接融合至融合蛋白的pIX序列的N末端。而在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，pIX融合蛋白不包括原核N末端前導(dǎo)序列。術(shù)語"前導(dǎo)序列"與術(shù)語"信號(hào)肽"和"信號(hào)序列"可互換使用，并且指使蛋白(前導(dǎo)序列是其部分)靶向革蘭氏陰性細(xì)菌周質(zhì)膜空間的氨基酸序列。常使用的前導(dǎo)序列的實(shí)例是pelBss、OmpAss>TorAss>malEss、phoAss、IamBss>Blass、禾口DspAss、mglBss、sfmCss,tolBss和TorTss。已知此類信號(hào)序列使完整蛋白靶向大腸桿菌的分泌裝置，已知所述分泌裝置至少包括從胞質(zhì)到周質(zhì)空間的SRP依賴性、SEC依賴性、TatABC依賴性或YidC依賴性易位(Baneyx等人PMID155^165)。因此，術(shù)語N末端信號(hào)序列指在蛋白的N末端部分的信號(hào)序列。具有使蛋白(信號(hào)序列是其部分)靶向大腸桿菌分泌裝置并從而使之從胞質(zhì)區(qū)室易位至周質(zhì)區(qū)室的性質(zhì)的信號(hào)序列，可以部分地通過其氨基酸組成的化學(xué)性質(zhì)定義的特征序列或基序來鑒定。然而，目前而言，存在的功能性信號(hào)序列的多樣性超出了鑒定它們的現(xiàn)有知識(shí)，因此，目前將肽定義為相關(guān)信號(hào)序列的技術(shù)水平通常使用基于數(shù)據(jù)的知識(shí)作為模板，通過例如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或啟發(fā)式方法通過數(shù)據(jù)挖掘來進(jìn)行。迄今存在幾種通過開放訪問渠道公眾可獲得的此類工具，例如SignalP、PR0SITE的PPSEARCH(EMBLjBI)、SecretomeP^TatP0對(duì)于分泌蛋白類別來說挑戰(zhàn)甚至更大，因?yàn)樗鼈儚陌|(zhì)區(qū)室輸出，這背離了規(guī)則，使得沒有信號(hào)序列基序可以被鑒定，但是通過數(shù)據(jù)挖掘，也可以在此確定信號(hào)序列特征或獲得關(guān)注的真核蛋白的分泌能力的可能性。目前，對(duì)于原核類群來說還不存在這樣的工具。因此，目前可用的不可改變地將肽鑒定為信號(hào)序列的唯一方法是通過實(shí)驗(yàn)手段來驗(yàn)證肽的性質(zhì)以確定它是否是真正的信號(hào)序列。還清楚，工程化可以在此類肽中進(jìn)行，使得信號(hào)序列中給定氨基酸位置可以被改變，而通過天然功能性或者通過改變的功能性例如增加的轉(zhuǎn)運(yùn)能力保留其作為信號(hào)肽的功能。也可以采用氨基酸的缺失或添加。實(shí)際上已經(jīng)對(duì)FfpVIII信號(hào)序列、靶向Sec途徑的g8pss和靶向Tat途徑的"TorAss進(jìn)行了此類分析和工程化。特別地，Sien等人的結(jié)果可以用作用于工程化PlII信號(hào)序列和細(xì)菌果膠酸裂合酶信號(hào)序列的功能性但改變的突變體的有充分根據(jù)的指導(dǎo)原則。信號(hào)序列的功能性可以進(jìn)一步分解為以下兩種性質(zhì)1.使蛋白(信號(hào)序列是其部分)靶向大腸桿菌的分泌裝置并從而使之從胞質(zhì)區(qū)室易位至周質(zhì)區(qū)室，并在此過程期間，通過特定蛋白酶例如脂蛋白信號(hào)肽酶或前導(dǎo)肽酶與其余蛋白(remainingprotein)蛋白水解地分離。2.使蛋白(信號(hào)序列是其部分)靶向大腸桿菌的分泌裝置并從而使之從胞質(zhì)區(qū)室易位至周質(zhì)區(qū)室，并在易位之后依然保留作為蛋白的一部分。雖然絕大多數(shù)的信號(hào)序列符合上述情況1)，但顯然，這些蛋白可以容易地被工程化為情況2)。因此，任何目前已知的信號(hào)序列，例如突變體pelBss和最初屬于情況1)但被改變成情況幻的其他信號(hào)序列依然被視為相關(guān)的信號(hào)序列。而且，可以設(shè)想將情況1)的信號(hào)序列改變?yōu)榍闆r幻，或者直接選擇符合情況2)的信號(hào)序列，然后在易位之后除去信號(hào)序列。這可以通過宿主的內(nèi)源性蛋白酶來進(jìn)行，和/或在例如噬菌體展示的情況下蛋白被融合至衣殼蛋白來進(jìn)行。隨后可以將人工蛋白酶位點(diǎn)工程化入信號(hào)序列或信號(hào)序列是其部分的蛋白的適當(dāng)區(qū)域，使得可以進(jìn)行確定的切割。在此可以設(shè)想兩種不同類型的蛋白酶位點(diǎn)被選擇A.蛋白酶位點(diǎn)不切割感興趣的蛋白，僅切割預(yù)測的位點(diǎn)，例如與抗體或其他感興趣的支架例如主要組織相容性復(fù)合物分子或T細(xì)胞受體組合的羧肽酶A或3C鼻病毒蛋白酶位點(diǎn)。通過使用該方法，可以設(shè)想例如通過使用符合上述情況幻的信號(hào)序列將感興趣蛋白進(jìn)行噬菌體展示，并且在用于篩選等之前，人工除去信號(hào)肽以獲得功能性和與衣殼融合體的均一性。B.除了工程化位點(diǎn)外，蛋白酶位點(diǎn)切割感興趣的蛋白，例如胰蛋白酶。這兩種情況依然被視為信號(hào)序列依賴性噬菌體展示。外源性肽在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，PlX融合蛋白的外源性肽選自由以下組成的組抗體或其片段包括FV、SCFV、Fab，單結(jié)構(gòu)域，蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域或其片段(親和體)，錨蛋白或其片段，DARPin或其片段，T細(xì)胞受體或其片段，I類MHC或II類MHC或其片段，纖連蛋白或其片段，Anticalin或其片段，PDZ結(jié)構(gòu)域或其片段，IgNAR或其片段，CTLA4或其片段，ImmE7或其片段，打結(jié)素或其片段，avimer或其片段，GFP或其片段，和其他基因編碼的生物熒光團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，PlX融合蛋白的外源性肽是文庫成員。本上下文中使用的文庫指不同肽的集合。所述肽可以是折疊結(jié)構(gòu)域或例如2-50個(gè)氨基酸的短肽。此類文庫是有意義的，因?yàn)樗鼈兛梢杂糜阼b定與給定靶結(jié)合的新配體。使用pIX展示文庫與使用pill或pVIII展示文庫相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。pIX展示在定向性和效價(jià)方面具有與PlII展示相同的優(yōu)點(diǎn)，但不影響感染性，感染性是已知發(fā)生于PiII展示的現(xiàn)象，該現(xiàn)象例如在親和篩選之后拯救時(shí)將不受控制和不想要的異質(zhì)性引入系統(tǒng)。而且，pIX展示可以無需原核N末端信號(hào)序列而實(shí)現(xiàn)，原核N末端信號(hào)序列是pill展示和pVIII展示的先決條件。最后，pill展示中任何靶固定化的物類通常需要該靶-噬菌體鍵的破壞(通常通過競爭性洗脫、或高或低PH洗脫)。例如，已知這嚴(yán)重妨礙pill展示中高親和力或穩(wěn)定結(jié)合物的回收。由于感染所需的PlII不改變并且容易獲得用于PlX展示中替代的相互作用，即使是在噬菌體-靶相互作用之后，這完全消除了對(duì)鍵破壞例如酸洗脫的需要，因?yàn)楣潭ɑ氖删w保留了完整的感染性并因此可以簡單地通過感染而被回收同時(shí)結(jié)合至靶。核酸本發(fā)明第二方面是編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸。本發(fā)明的核酸可以是質(zhì)粒、載體、噬菌體基因組、噬菌粒或噬粒的部分。術(shù)語核酸指由單體核苷酸的鏈構(gòu)成的大分子。在生物化學(xué)中，這些分子攜帶遺傳信息或者在細(xì)胞內(nèi)形成結(jié)構(gòu)。最常見的核酸是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。此外，術(shù)語核酸包括人工核酸，例如肽核酸(PNA)、嗎啉代和鎖核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)和蘇糖核酸(TNA)。這些中的每一種與天然存在的DNA或RNA的區(qū)別在于分子主鏈的改變。噬菌粒或噬粒是一類克隆載體，開發(fā)為絲狀噬菌體Ff和質(zhì)粒的雜合體，產(chǎn)生可作為質(zhì)粒繁殖并且還可以被包裝為病毒粒子中的單鏈DNA的載體。類似于質(zhì)粒，噬菌粒可用于克隆DNA片段并且可通過一系列技術(shù)(轉(zhuǎn)化、電穿孔)被引入細(xì)菌宿主。然而，含有噬菌粒的細(xì)菌宿主被‘輔助’噬菌體例如VCSM13或M1I07感染提供了實(shí)現(xiàn)單鏈DNA復(fù)制和噬菌粒DNA包裝入噬菌體顆粒的必要病毒成分。因此，本發(fā)明一個(gè)方面涉及包含編碼源自絲狀噬菌體的pIX融合蛋白的核酸的噬菌體基因組或噬菌粒，其中所述融合蛋白不包含原核N末端信號(hào)序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，噬菌體基因組或噬菌粒包含編碼源自絲狀噬菌體的PlX融合蛋白的核酸，其中所述融合蛋白不包含原核N末端信號(hào)序列并且其中所述pIX融合蛋白包含選自由SEQIDNO1(MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS)的位置1_32、2_32、3-32,4-32和5-32組成的組的序列。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，外源性肽與PlX序列的N末端直接融合。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的噬菌體基因組或噬菌粒，其中與pIX融合的外源性肽選自由以下組成的組抗體或其片段包括Fv、scFv、Fab,單結(jié)構(gòu)域，蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域或其片段(親和體)，錨蛋白或其片段，DARPin或其片段，T細(xì)胞受體或其片段，I類MHC或II類MHC或其片段，纖連蛋白或其片段，Anticalin或其片段，PDZ結(jié)構(gòu)域或其片段，IgNAR或其片段，CTLA4或其片段，ImmE7或其片段，打結(jié)素或其片段，avimer或其片段，GFP或其片段，和其他基因編碼的生物熒光團(tuán)。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，與pIX融合的外源性肽是文庫成員。絲狀噬菌體本發(fā)明第三方面是包含本發(fā)明融合蛋白的絲狀噬菌體。絲狀噬菌體病毒粒子可以包含噬菌粒。噬菌體常被稱為細(xì)菌噬菌體，在本文意思是感染、復(fù)制并且從細(xì)菌分泌的病毒。絲狀細(xì)菌噬菌體或絲狀噬菌體是具有單鏈DNA分子(ssDNA)的噬菌體，單鏈DNA分子被噬菌體外殼蛋白包裹。分泌的絲狀噬菌體顆粒表型上具有絲狀結(jié)構(gòu)。本文使用的術(shù)語絲狀噬菌體涵蓋噬菌體基因組衍生的病毒粒子和噬菌粒衍生的病毒粒子。術(shù)語輔助噬菌體指這樣的病毒，該病毒通過感染相同宿主細(xì)胞而幫助單獨(dú)和不相關(guān)的缺陷型病毒繁殖，所述相同宿主細(xì)胞已經(jīng)被該缺陷型病毒占據(jù)并提供該缺陷型病毒丟失并需要以形成含有噬菌粒的病毒粒子的蛋白，所述單獨(dú)和不相關(guān)的缺陷型病毒被定義為例如本身不是噬菌體基因組也不是功能性病毒而只是含有一個(gè)或幾個(gè)衍生自噬菌體基因組的元件的質(zhì)粒的噬菌粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，絲狀噬菌體確實(shí)包含編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸。特別優(yōu)選的是包括含有編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸的噬菌粒的噬菌體。噬菌體文庫是展示作為絲狀噬菌體外殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)的部分的肽或蛋白的絲狀噬菌體集合。此類文庫可以包括兩種或多種展示不同肽或蛋白的噬菌體。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，絲狀噬菌體展示作為絲狀噬菌體外殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)的部分的肽或蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，絲狀噬菌體還包含pill融合蛋白、pVII融合蛋白或pVIII融合蛋白ο本發(fā)明一個(gè)方面是本發(fā)明絲狀噬菌體文庫，所述絲狀噬菌體展示作為與pill、pVII、pVIII或pIX的一個(gè)或多個(gè)的融合體的外源性肽或蛋白。文庫是展示作為絲狀噬菌體外殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)的部分的肽或蛋白的絲狀噬菌體集合。此類文庫可以包括兩種或多種展示不同肽或蛋白的噬菌體。本發(fā)明一個(gè)方面涉及包含兩種或多種展示不同蛋白的絲狀噬菌體的噬菌體文庫，其中這些蛋白的至少一種是從本發(fā)明的噬菌體基因組或噬菌粒表達(dá)的PlX融合蛋白。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案涉及包含兩種或多種展示不同肽或蛋白的絲狀噬菌體的噬菌體文庫。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，這些肽或蛋白的至少一種是本發(fā)明的PlX融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽同時(shí)展示在pIX與pIII、pVII或pVIII。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽同時(shí)展示在pIX與選自由pill、pVII或pVIII組成的組的兩種或三種。術(shù)語野生型(wildtype)，有時(shí)寫為野生型(wildtype)、野生-型(wild-type)或wt，是生物體、菌株、基因或特性天然存在的通常形式。野生型指天然群體中最常見的表型。野生型還指產(chǎn)生野生型表型所需的每個(gè)基因座的等位基因。野生型是基因型和表型的參考標(biāo)準(zhǔn)。在生物學(xué)中，它尤其涉及天然存在的生物體和被有意突變的生物體之間的差異。定點(diǎn)誘變是允許野生型基因的基因序列中特定核苷酸突變的研究技術(shù)。野生型蛋白書寫為wt(蛋白名稱)，例如，野生型pIX蛋白書寫為wtpIX、wt-pIX或野生型pIX.因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及不包含編碼wtpIX的基因和/或wtpIX蛋白的本發(fā)明的絲狀噬菌體。本發(fā)明另一方面涉及還包含編碼wtpIX的基因和/或wtpIX蛋白的本發(fā)明的絲狀噬菌體。本發(fā)明另一方面涉及包含本發(fā)明的噬菌體基因組或噬菌粒的絲狀噬菌體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的噬菌體基因組或噬菌粒的絲狀噬菌體還包含編碼wtpIX的基因和/或wtpIX蛋白。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的噬菌體基因組或噬菌粒的絲狀噬菌體不包含編碼WtPlX的基因和/或wtPlX蛋白。本發(fā)明另一方面涉及在無WtPlX蛋白補(bǔ)充的噬菌體展示中是功能性的PlX融合蛋白。本發(fā)明一個(gè)方面涉及包含本發(fā)明噬菌體基因組或噬菌粒的絲狀噬菌體，還包含選自PiII融合蛋白、pVII融合蛋白和pVIII融合蛋白的組的一種或多種。噬菌體展示系統(tǒng)本發(fā)明第五方面是包含噬菌粒和輔助噬菌體的噬菌體展示系統(tǒng)，其中所述輔助噬菌體包含編碼本發(fā)明PlX融合蛋白的核酸。噬菌體展示系統(tǒng)、噬菌體展示技術(shù)、噬菌體展示工藝或簡單地噬菌體展示指發(fā)現(xiàn)和研究蛋白-蛋白、蛋白-肽和蛋白-DNA相互作用的方法，其利用細(xì)菌噬菌體來關(guān)聯(lián)蛋白與編碼它們的遺傳信息。展示蛋白或展示的蛋白指為了檢測或配體固定，與可接近的噬菌體外殼蛋白融合的蛋白。本發(fā)明第六方面是包含噬菌粒和輔助噬菌體的噬菌體展示系統(tǒng)，其中所述噬菌粒包含編碼本發(fā)明PlX融合蛋白的核酸。本發(fā)明一個(gè)方面涉及包含本發(fā)明噬菌體基因組或噬菌粒的噬菌體展示系統(tǒng)。本發(fā)明另一方面涉及包含本發(fā)明噬菌體基因組或噬菌粒和輔助噬菌體的噬菌體展示系統(tǒng)。本發(fā)明一個(gè)方面涉及包含兩種或多種展示不同蛋白的絲狀噬菌體的噬菌體文庫，其中這些蛋白的至少一種是從本發(fā)明的噬菌體基因組或噬菌粒表達(dá)的PlX融合蛋白。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的噬菌體文庫包括一種或多種選自pill融合蛋白、PVII融合蛋白和PVIII融合蛋白的其他融合蛋白。試劑盒本發(fā)明第七方面是包含由噬菌粒和輔助噬菌體構(gòu)成的噬菌體展示系統(tǒng)的試劑盒，其中所述噬菌粒包含編碼本發(fā)明PlX融合蛋白的核酸。所述試劑盒應(yīng)該包括噬菌粒和輔助噬菌體(例如M13K07、VCSM13或其他)，所述噬菌粒具有pIX編碼基因，所述基因在編碼區(qū)N末端具有多克隆位點(diǎn)。所述試劑盒應(yīng)該配有感染、表達(dá)、固定、篩選和檢測噬菌體克隆的技術(shù)手冊(cè)。所述試劑盒還應(yīng)該具有進(jìn)行具體測定所必要的緩沖液和培養(yǎng)基的配方。試劑盒在此指用于產(chǎn)生具有單或雙特異性融合蛋白的噬菌體顆粒作為噬菌體展示文庫或作為單噬菌體顆粒的試劑集合。試劑盒可包括噬菌粒、輔助噬菌體、細(xì)菌菌株和試劑配方和測定描述的技術(shù)手冊(cè)。試劑盒可以用于研究試劑、診斷試劑和治療試劑的開發(fā)。本發(fā)明一個(gè)方面涉及包括噬菌體展示的試劑盒，所述噬菌體展示包含本發(fā)明的噬菌體基因組或噬菌粒和輔助噬菌體。本發(fā)明另一方面涉及包含本發(fā)明噬菌體基因組或噬菌粒的試劑盒。本發(fā)明另一方面涉及包含絲狀噬菌體的試劑盒，所述絲狀噬菌體包含本發(fā)明的噬菌體基因組或噬菌粒?，F(xiàn)在，本發(fā)明在下述非限制性實(shí)施例中更詳細(xì)描述。實(shí)施例實(shí)施例1:pIX上的噬菌粒展示試劑所有培養(yǎng)基和緩沖液基本上如Sambrook等人(2001)MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))·ColdSpringHarbor，NYCoIdSpringHarborLaboratoryPress^M13—HR自GEHealthcareBio-SciencesAB(Uppsala,Sweden)。限制酶(RE)購自NewEnglandBiolabs(Ipswich,MA,USA)，除了DpnI獲自Stratagene(LaJoIIa，CA,USA)。DNA寡聚體購自MWGBiotechAG(Ebersberg,Germany)。牛血清白蛋白(BSA)和Tween20購自Sigma-Aldrich(Oslo，Norway)PfuTurboDNA聚合酶購自Stratagene(LaJoIIa,CA,USA)。與BSA軛合的半抗原2-苯基噁唑-5-酮(PhOx)和5-硝基苯乙?；?NlP)基本上如其他地方所述制備(Nakela等人，PMID；722243和Michaelsen等人，PMID:2125362)。異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)購自Fermentas(Burlington，Canada)。三乙胺(TEA)和胰蛋白酶/EDTA分別購自Sigma-Aldrich(Oslo,Norway)禾口BioWhittaker(LonzaGroupLtd.,Visp,Switzerland)。大腸桿菌菌株XLl-Blue購自Stratagene(LaJoIIa，CA,USA)。M13K07輔助噬菌體購自GEHealthcareBio-SciencesAB(Uppsala,Sweden)。含有對(duì)phOx-BSA特異性的單鏈Fv(scFv)的pSEX81(SEQIDNO:2)噬菌粒(pill展示)由AffitechAS(Oslo,Norway)惠贈(zèng)。含有scFv抗NIP(SEQIDNO3)的原核表達(dá)載體pSGl(未公開)基于pH0G21(Kiprianov等人，PMID=9005945)并且已經(jīng)從衍生自pLN0H2和pLNOK的抗體可變基因內(nèi)部制備(Norderhaug等人，PMID:9202712)。新型PlX展示噬菌粒載體PGALD9和pGALD9ΔL的構(gòu)建選擇上述pSEX81(SEQIDNO2)噬菌粒(GenBank登錄號(hào)Y14584)作為載體主鏈的起始模板。首先，為去除該載體中的原核PelB信號(hào)序列(N-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA-C)(SEQIDNO4)編碼段，使用引物對(duì)a41g-正向引物/a41g-反向引物(5‘-AGAGGAGAAATTMCCATGGAATACCTATTGCCTACGGC-3‘/5-GCCGTAGGCMTAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT-3‘)(分別為SEQIDNO5和SEQIDNO6)通過QuikChange體外誘變?cè)谧頝末端引入NcoIRE位點(diǎn)，從而使pelBORF的第二密碼子的第一核苷酸從A變?yōu)镚。誘變后，載體用NcoI消化，再連接，并用作使用弓丨物對(duì)pH0G_EcoRI_正向引物/scTCR_反向引物(5‘-TAGCTCACTCATTAGGCACCC-3‘/5'-TTTGGATCCAGCGGCCGC-3‘)(分別為SEQIDNO:7和SEQIDNO8)回收載體相關(guān)部分的第二PCR的模板。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將該P(yáng)CR片段移入最初pSEX81(SEQIDNO2)的相容的EcoRI/HindlllRE位點(diǎn)并通過DNA測序證實(shí)。該步驟完全去除了pelB信號(hào)序列編碼部分，但是保留了對(duì)正常轉(zhuǎn)錄和翻譯重要的起始密碼子及其與IacPO和Shine-Dalgarno序列(SD)的相對(duì)位置，并且在最初pSEX81(SEQIDNO2)中存在的NcoI/NotIRE位點(diǎn)確定的外源序列之前加入僅一個(gè)Ala殘基。新構(gòu)建體稱為PSEX81ΔL0其次，ρΧΙ編碼序列使用5‘-末端加RE標(biāo)簽的引物對(duì)pIX_EcoRV/pIX_NheI(5'-ATATGATATCAGMTGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCC-3'/5'-ATATGCTAGCTTATCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGG-3‘)(SEQIDNO9和SEQIDNO10)從M13K07擴(kuò)增。然后將該P(yáng)CR片段移入pSEX81(SEQIDNO2)和pSEX81ΔL噬菌粒上相容的RE位點(diǎn)，從而交換兩者的pill編碼區(qū)并導(dǎo)致最初pSEX81(SEQIDNO2)中NcoI/NotI確定的盒的N末端框內(nèi)pIX融合。新構(gòu)建體通過DNA測序證實(shí)并分別稱為PGALD9和pGALD9ΔL。為了將上述各種噬菌粒中scFv抗phOx(SEQIDNO:11)單元轉(zhuǎn)換為來自pSGl的scFv抗NIP(SEQIDNO3)單元，這使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以NcoI/NotIRE確定的盒交換來進(jìn)行。本文描述的所有噬菌粒使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過電穿孔被引入大腸桿菌XLl-Blue。噬菌體顆粒的制備使用M1I07輔助噬菌體和病毒粒子裝配從大腸桿菌XLl-Blue的噬菌粒拯救通過所描述的斑點(diǎn)滴定來監(jiān)測(Welschof等人，PMID=9050877和Koch等人，PMID=11126120)。噬菌體捕獲酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)將phOx-BSA或NIP-BSA吸附至MaxiSorp微量滴定板孔(Nunc，Roskilde,Denmark)，5μg/ml于PBS中，pH7.4，4°C過夜?？子?%(w/v)BSA的PBS溶液室溫封閉1小時(shí)，然后添加病毒粒子制品，并允許在室溫反應(yīng)1至2小時(shí)，然后用抗M13-HR(15,000)在室溫檢測捕獲的病毒粒子1小時(shí)。每步之間，孔用PBST(PBS/0.05%Tween20)洗滌3X。孔用TMB可溶性底物顯色，30分鐘后用IMHCl終止，在A45tlnm讀取吸光度。為了定量作為每個(gè)病毒粒子展示的融合蛋白的函數(shù)的抗原反應(yīng)性，在對(duì)任何樣品觀察到信號(hào)飽和之前通過添加IMHCl來終止ELISA顯色，根據(jù)下式轉(zhuǎn)換吸光度讀數(shù)相對(duì)展示水平=(A45tlnm/噬菌粒滴度)X1012。峰phOx-BSA/NIP-BSA篩選制備新鮮病毒粒子樣品，有或沒有ImMIPTG誘導(dǎo)，PEG沉淀，并如上所述滴定。然后將靶特異性實(shí)體以1IO7的水平加入無關(guān)背景，得到IO7的已知多樣性，對(duì)應(yīng)于中等大小的組合文庫。對(duì)于NIP-BSA篩選，將scFv抗NIP加入scFv抗phOx對(duì)應(yīng)物，反之亦然。最初輸入量是IX101(lCfUampK，對(duì)于所有12個(gè)模型文庫，得到第1輪淘選中IO3的復(fù)雜度水平。簡言之，將靶固定在MaxiSorp微量滴定板孔(NunC，R0Skilde，Denmark)，相同板上一式三份，第ι輪和第2輪淘選分別使用100μ1體積的1μg/ml和0.1μg/ml。在淘選之前，孔用PBSTM在室溫封閉1-2小時(shí)，然后添加100μ1各自的預(yù)先封閉(在PBSTM中)的病毒粒子制品，并允許在室溫伴隨攪拌下反應(yīng)1.5小時(shí)?？子梦⒘康味ㄏ礈炱髟赑BST中洗滌9Χ，然后在(IH2O中洗滌5Χ，然后通過以下洗脫靶結(jié)合的病毒粒子(在三份孔中):1)添加100μ1/孔的IOOmMΤΕΑ(ρΗ12)，在室溫持續(xù)5分鐘，隨后通過轉(zhuǎn)移至含有100μ1/孔的Tris-HCl，ρΗ6.8的新孔來中和；2)添加100μ1/孔的胰蛋白酶/EDTA，在室溫持續(xù)10分鐘，隨后轉(zhuǎn)移至新孔；3)添加200μ1/孔的對(duì)數(shù)期(A6tltlnm0.5，對(duì)應(yīng)于彡5XIO7細(xì)胞)大腸桿菌XLl-Blue，在37°C持續(xù)30分鐘，伴隨攪拌，隨后轉(zhuǎn)移至以MOI10補(bǔ)充了M1I07輔助噬菌體的IOml預(yù)熱的YT-TAGQXYT，含有30μg/ml四環(huán)素、100μg/ml氨芐西林和0.IM葡萄糖)。孵育在低攪拌下37°C持續(xù)15分鐘，隨后高攪拌下37°C30分鐘。平行地，TEA和胰蛋白酶洗脫樣品被用來感染9mlYT-TAG中的對(duì)數(shù)期大腸桿菌XLl-Blue培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物在37°C低攪拌孵育15分鐘，然后添加以MOI10補(bǔ)充了M1I07輔助噬菌體的ImlYT-TAG0孵育在低攪拌下37°C持續(xù)15分鐘，隨后劇烈攪拌下37°C30分鐘。然后所有樣品以3000g/10分鐘/室溫離心，棄掉上清液，將沉淀溫和重懸于含有100μg/ml氨芐西林和50μg/ml卡那霉素的IOml預(yù)熱的2XYT。適當(dāng)?shù)臉悠繁谎a(bǔ)充ImMIPTG，并且所有樣品在30°C劇烈攪拌下孵育過夜。第二天，培養(yǎng)物以4000g/10分鐘/室溫離心，上清液通過0.2μm濾器無菌過濾入新的15ml管。然后，這些上清液進(jìn)入下一輪所描述的淘選，使用50μ1體積/樣品，對(duì)應(yīng)于至少109cfiTP7樣品的輸入。在第二輪篩選之后，含有病毒粒子的上清液進(jìn)入如上所述的抗原特異性ELISA。結(jié)果已知絲狀噬菌體(fd、M13和fl)的所有五種結(jié)構(gòu)外殼蛋白在被并入突出的病毒粒子之前是革蘭氏陰性宿主內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)的膜內(nèi)在蛋白(Endeman和Model，PMID:7616570)。該報(bào)道還得出結(jié)論即使PlX不允許任何N末端融合修飾，衣殼蛋白本身在完整病毒粒子中是溶劑可及的(solventaccessible)。Gao等人(PMID:10339535和12239343)和Khalil等人(PMID:17360403)后來都表明，當(dāng)從噬菌粒表達(dá)并與信號(hào)序列依賴性周質(zhì)靶向組合使用時(shí)允許N末端pIX融合體展示。在這些系統(tǒng)中，因?yàn)閣tPlX在噬菌粒拯救時(shí)由輔助噬菌體基因組提供而發(fā)生補(bǔ)充。為了測試此類展示是否在沒有任何信號(hào)序列依賴性靶向周質(zhì)時(shí)也被允許，我們構(gòu)建了稱為PGALD9和pGALD9ΔL的兩種新型噬菌粒，分別在有或沒有此類信號(hào)序列時(shí)允許N末端pIX展示(圖2)。選擇使用這些新噬菌粒的兩種不同的pIX融合體進(jìn)行分析并與使用標(biāo)準(zhǔn)pill展示的其對(duì)應(yīng)物比較。兩種融合體是抗體片段scFv，基于對(duì)半抗原軛合物phOx-BSA特異性的人抗體可變基因區(qū)段(scFv抗phOx)，或者基于對(duì)半抗原軛合物NIP-BSA特異性的鼠抗體可變基因區(qū)段(scFv抗NIP)。值得注意的是，已經(jīng)從人抗體scFv文庫選擇了scFv抗phOx(SEQIDNO11)，并且已知在大腸桿菌中表達(dá)非常好(Marks等人，PMID:1748994)。相比之下，公知許多鼠雜交瘤可變基因在大腸桿菌中以及在噬菌體展示時(shí)表達(dá)不是很好(Krebber等人，PMID:9032408)。scFv的pIX展示不應(yīng)該干擾正常的病毒粒子裝配。因此，我們使用材料與方法中所述的標(biāo)準(zhǔn)噬菌粒拯救和滴定，比較了有和沒有信號(hào)序列的這些scFv展示噬菌粒的性能并與標(biāo)準(zhǔn)pill展示(其絕對(duì)需要信號(hào)序列依賴性周質(zhì)靶向)比較(圖3)。滴定結(jié)果實(shí)際顯示了含有噬菌粒的病毒粒子在所有情況下生成(圖3A和C)。當(dāng)scFv融合體從lacPO表達(dá)而無需啟動(dòng)子誘導(dǎo)(基礎(chǔ)表達(dá))時(shí)，pIX展示形式和pill對(duì)照對(duì)于scFv抗phOx產(chǎn)生相當(dāng)?shù)牡味?圖2A)。相比之下，不依賴信號(hào)序列的scFv抗NIPpIX展示分別與PlII和信號(hào)序列依賴性PlX展示相比滴度高5至10倍(圖3C)。當(dāng)IPTG誘導(dǎo)IacPO強(qiáng)迫scFv融合體表達(dá)增加時(shí)，信號(hào)序列依賴性pIX展示和pill展示的滴度約10倍減少。相比之下，對(duì)兩種不依賴信號(hào)序列的PlX展示變體只有較小影響(圖3A和C)。由于在該系統(tǒng)中存在來自輔助噬菌體的wtpIX的補(bǔ)充，該發(fā)現(xiàn)是驚人且重要的，因?yàn)檫@顯示信號(hào)序列依賴性PlX和PlII展示干擾病毒粒子組裝過程，而這一作用在不依賴信號(hào)序列的PlX展示的情況下只是輕微的，即使在IPTG誘導(dǎo)時(shí)。所述作用在比較有或沒有信號(hào)序列的PlX上展示的scFv抗OTP結(jié)果時(shí)最突出，其中前者表現(xiàn)出滴度的100倍減少。還值得注意的是，對(duì)于兩種scFv，當(dāng)以不依賴信號(hào)序列的pIX形式進(jìn)行時(shí)，病毒粒子裝配與pill—樣好或者更好。任何組合篩選平臺(tái)的核心是能夠?qū)崿F(xiàn)通過表型篩選來檢索基因型的物理表型-基因型偶聯(lián)。如果這一物理關(guān)聯(lián)被損害或喪失，則系統(tǒng)失去功能。對(duì)于噬菌粒展示，這意味著對(duì)于任何篩選關(guān)鍵的是在輔助噬菌體拯救時(shí)被包裹入病毒粒子的是噬菌粒而非輔助噬菌體基因組。因?yàn)槭删：洼o助噬菌體具有不同的抗生素選擇標(biāo)記，這一觀點(diǎn)可以容易地在感染滴定中評(píng)估，該評(píng)估通過基于其各自的從適當(dāng)選擇生長(氨芐西林(ampR)或卡那霉素(kanR)得到的菌落形成單位(cfu)計(jì)算噬菌粒與輔助噬菌體之比。對(duì)于任何可行的有效下游篩選而言，所述比應(yīng)該高于1。當(dāng)評(píng)估上述病毒粒子制品的噬菌粒與輔助噬菌體之比時(shí)(圖:3B和D)，揭示了三種展示途徑之間的顯著差異。使用標(biāo)準(zhǔn)病毒粒子包裝而無啟動(dòng)子誘導(dǎo)(基礎(chǔ)表達(dá))，所有三種途徑對(duì)于scFv抗phOx(圖2B)是可行的，而對(duì)于scFv抗NIP(圖3D)，這僅對(duì)不依賴序列的PlX變體可行。在啟動(dòng)子誘導(dǎo)(IPTG誘導(dǎo))時(shí)，pill和信號(hào)依賴性pIX變體表現(xiàn)出表型-基因型關(guān)聯(lián)的嚴(yán)重喪失，并且該作用對(duì)于scFv抗NIP融合體最突出。相比之下，該作用對(duì)于不依賴信號(hào)序列的PlX變體而言不存在(scFv抗phOx)或微弱(scFv抗NIP)。因此，結(jié)果清楚表明，不依賴信號(hào)序列的PlX展示與兩種標(biāo)準(zhǔn)的PlII和信號(hào)序列依賴性PlX展示相比具有較好的表型-基因型關(guān)聯(lián)表型?；谏鲜鰳悠?，我們?cè)诳乖禺愋訣LISA中評(píng)估了這些病毒粒子上的功能性scFv展示(圖4)。結(jié)果清楚顯示了來自所有三種展示途徑的功能性scFv展示(圖4A和B)。由于樣品未根據(jù)噬菌粒滴度標(biāo)準(zhǔn)化，信號(hào)強(qiáng)度不可直接比較。而且，在幾個(gè)樣品中觀察到了信號(hào)飽和。為了充分評(píng)估三種展示途徑之間的功能性差異，如材料與方法中所描述的，在新抗原特異性ELISA中確定了相對(duì)展示水平(每個(gè)病毒粒子的功能性展示單位)(圖4C和D)。展示水平在PlII和信號(hào)序列依賴性PlX變體之間相當(dāng)，而不依賴信號(hào)序列的PlX展示顯著較低。這對(duì)于兩種scFv在基礎(chǔ)表達(dá)和IPTG誘導(dǎo)時(shí)都是如此。如預(yù)期的，所有三種展示途徑和兩種scFv在IPTG誘導(dǎo)時(shí)表現(xiàn)出較高的展示。然而，最重要的是根據(jù)圖:3B和D中給出的比觀察圖4C和D的結(jié)果。例如，顯然，scFv抗NIP單元的pill和信號(hào)序列依賴性ρIX展示與不依賴信號(hào)序列的PlX對(duì)應(yīng)物相比表現(xiàn)出10至20倍(基礎(chǔ)表達(dá))和25倍(IPTG誘導(dǎo))更高的展示。然而，前兩種途徑具有非常弱的或喪失的表型-基因關(guān)聯(lián)，這在組合篩選方案中將使它們沒有功能性，因?yàn)樗鼈兊幕蛐蛯?duì)表型篩選不起作用。這種情況對(duì)于scFv抗phOx單元也是如此，但僅對(duì)IPTG誘導(dǎo)。而且，IPTG誘導(dǎo)的不依賴信號(hào)序列的ρΙΧ變體中scFv抗phOx單元的展示水平與基礎(chǔ)表達(dá)的pill和信號(hào)序列依賴性PlX變體相當(dāng)。鑒于這些數(shù)據(jù)，有趣地發(fā)現(xiàn)利用PlX(信號(hào)序列依賴性)進(jìn)行scFv展示的唯一報(bào)道(fe0，PMID12239343)總是在病毒粒子包裝時(shí)利用IPTG誘導(dǎo)，但未報(bào)道噬菌粒與輔助噬菌體之比。盡管scFv形式因?yàn)樵诖竽c桿菌中有利的表達(dá)特征而被經(jīng)常使用(Bradbury和Marks,PMID15^1570)，幾個(gè)報(bào)道指出較低水平展示形式例如抗體Fab片段在親和篩選時(shí)回收高親和力結(jié)合物的優(yōu)點(diǎn)(deHaard,等人，PMID:10373423和Hoogenboom，PMID16151404)和Rothe等人(PMID:18191144)。因此，即使不依賴信號(hào)序列的scFv-pIX展示表現(xiàn)為產(chǎn)生低水平展示，但這可能實(shí)際上在應(yīng)用于高親和篩選時(shí)變得非常有利。因此，為了評(píng)估親和篩選中不依賴信號(hào)序列的ρΙΧ展示如何進(jìn)行，我們與常規(guī)PiII展示進(jìn)行比較。病毒粒子在IPTG誘導(dǎo)存在或不存在下產(chǎn)生，并且感興趣的蛋白是scFv抗phOx或scFv抗NIP。因此，分別針對(duì)兩個(gè)靶phOx-BSA和NIP-BSA評(píng)價(jià)了總共4個(gè)噬菌體群體。在每種情況下，靶特異性scFv以1IO7的比與特異性無關(guān)scFv混合。重要的是，兩種scFv不交叉反應(yīng)。然后進(jìn)行兩輪親和篩選。采用了三種不同的洗脫策略；高pH、蛋白水解或直接感染。在第二輪篩選之后通過抗原特異性多克隆噬菌體ELISA證實(shí)了富集(圖5)。當(dāng)感興趣的蛋白展示在ρΙΧ上時(shí)，篩選與POI在pill上展示時(shí)相比大約等同有效，并且在大多數(shù)情況下更有效。特別地，采用高PH(TEA)或蛋白水解(胰蛋白酶)洗脫的標(biāo)準(zhǔn)pill展示途徑與ρΙΧ相比表現(xiàn)出差的富集。獨(dú)立于展示途徑和洗脫條件，篩選在無IPTG誘導(dǎo)時(shí)比有IPTG誘導(dǎo)時(shí)更有效，并且pin展示途徑的副作用表現(xiàn)得最嚴(yán)重。因此，不依賴信號(hào)序列的PlX的低展示傾向不轉(zhuǎn)化為差的篩選。通過使pill不改變并且完全暴露于溶劑，文庫篩選步驟之后的病毒粒子拯救可以有效進(jìn)行，而不破壞病毒粒子-靶結(jié)合，使得洗脫步驟多余并加速高通量方案。后者還可以促進(jìn)高親和力結(jié)合物的分離，高親和力結(jié)合物的洗脫可耐受多種策略(Balass等人，PMID:8954559)。參考文獻(xiàn)1.Endemann,H.&Model,P.LocationofFilamentousPhageMinorCoatProteinsinPhageandinInfectedCells(絲狀噬菌體次要外殼蛋白在噬菌體中和感染細(xì)胞中的定位).JournalofMolecularBiology250，496-506(1995)(PMID:7616570)·2.Gao,C.等人·Makingartificialantibodies:Aformatforphagedisplayofcombinatorialheterodimericarrays(制備人工抗體用于組合異二聚體陣列的噬菌體展示形式)·PNAS96，6025-6030(1999)(PMID10339535)·3.Gao,C.等人·AmethodforthegenerationofcombinatorialantibodylibrariesusingpIXphagedisplay(使用pIX噬菌體展示產(chǎn)生組合抗體文庫的方法).PNAS2002年10月1日；99Q0):12612-6.2002年9月18日電子出版(PMID12239343).4.W0/2000/071694.Janda,Kim,D.5.KhalilAS,FerrerJM,BrauRR,KottmannST,NorenCJ,LangMJ,BelcherAM.SingleM13bacteriophagetetheringandstretching(單M13細(xì)菌噬菌體系留和延伸).ProcNatlAcadSciUSA.2007年3月20日；104(12):4892-7.2007年3月13日電子出版(PMID:17360403).6.AltschulSF,GishW,MillerW,MyersEW，LipmanDJ.Basiclocalalignmentsearchtool(基本的局部比對(duì)檢索工具)·JMolBiol.1990年10月5日；2I5(3)403-10(PMID:2231712).7.BaneyxF,MujacicΜ.RecombinantproteinfoldingandmisfoldinginEscherichiacoli(大腸桿菌中的重組蛋白折疊和錯(cuò)誤折疊).NatBiotechnol.2004年11月；22(11):1399-408(PMID:15529165).8.Sambrook入.，Molecularcloning-.alaboratorymanual(^^!實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))·ColdSpringHarborLaboratoryPress.9.MichaelsenTE,AaseA,WestbyC,SandlieI.EnhancementofcomplementactivationandcytolysisofhumanIgG3bydeletionofhingeexons(通過缺失1鏈外顯子而增強(qiáng)人IgG3的補(bǔ)體激活和細(xì)胞溶解).kandJImmunol.1990年11月；32(5)517-28(PMID:2125362).10.Nakela0，KaartinenΜ,PelkonenJL,KarjalainenK.InheritanceofantibodyspecificityV.Anti-2-phenyloxazoloneinthemouse(抗體特異性遺傳性V.小鼠中抗2-苯基噁唑酮).JExpMed.1978年12月1日；148(6)1644-60(PMID722243).11.KipriyanovSM,MoldenhauerG,LittleΜ.Highlevelproductionofsolublesinglechainantibodiesinsmall-scaleEscherichiacolicultures(小規(guī)CN模大腸桿菌培養(yǎng)物中可溶性單鏈抗體的高水平生產(chǎn)).JImmunolMethods.1997年1月15日；200(1-2):69-77(PMID:9005945).12.NorderhaugL,O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