專(zhuān)利名稱(chēng)：日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶SjTGR功能抑制肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用噬菌體展示技術(shù)從噬菌體展示肽庫(kù)中篩選能抑制日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)酶活性的抑制肽，可破壞血吸蟲(chóng)生化代謝過(guò)程中的氧化還原平衡，導(dǎo)致血吸蟲(chóng)死亡，適用于新的血吸蟲(chóng)病治療藥物的研究。屬于生物技術(shù)的分子生物學(xué)與生物化學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的人畜共患病，全球有76個(gè)國(guó)家有血吸蟲(chóng)病流行，有約6億人口受到血吸蟲(chóng)感染的威脅，血吸蟲(chóng)病人有2000多萬(wàn)。經(jīng)過(guò)60年不懈努力，我國(guó)仍有約2. 4億人口受血吸蟲(chóng)感染威脅，有血吸蟲(chóng)病人36萬(wàn)余人，血吸蟲(chóng)病流行的自然條件依然存在。由于仍沒(méi)有可用的血吸蟲(chóng)病疫苗，血吸蟲(chóng)病的防治目前主要依靠藥物治療。吡喹酮是當(dāng)前唯一的血吸蟲(chóng)病治療藥物，由于長(zhǎng)期大規(guī)模的反復(fù)使用，曼氏血吸蟲(chóng)已出現(xiàn)了抗吡喹酮的耐藥株，而在我國(guó)流行的日本血吸蟲(chóng)亦出現(xiàn)了對(duì)吡喹酮敏感性下降的現(xiàn)象，給未來(lái)血吸蟲(chóng)病的防治工作帶來(lái)了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。因此，開(kāi)發(fā)新血吸蟲(chóng)病治療藥物，應(yīng)對(duì)吡喹酮抗藥性的出現(xiàn)是當(dāng)前血吸蟲(chóng)病防治科研的緊迫任務(wù)。生命過(guò)程是由一系列的生化代謝過(guò)程所組成，在這個(gè)過(guò)程中，生物體產(chǎn)生維持生命過(guò)程所必須的物質(zhì)，并排除生物體內(nèi)的毒性物質(zhì)，從而保持體內(nèi)平衡，一旦這種平衡被破壞就會(huì)導(dǎo)致生物死亡。因此，干擾血吸蟲(chóng)生命過(guò)程中一些重要蛋白分子的功能，使其失去活性，則可能破壞血吸蟲(chóng)的某一重要生化代謝過(guò)程，導(dǎo)致血吸蟲(chóng)死亡，達(dá)到治療血吸蟲(chóng)病的目的，是新藥開(kāi)發(fā)的有效策略。生命過(guò)程中的這些重要蛋白分子(亦稱(chēng)為生命過(guò)程必須的蛋白分子，essential molecule)是新藥開(kāi)發(fā)重要的潛在靶標(biāo)分子。已有的研究成果顯示血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)是血吸蟲(chóng)氧化還原平衡代謝過(guò)程中的一個(gè)必須蛋白分子，抑制血吸蟲(chóng)SjTGR的表達(dá)或功能，蟲(chóng)體因不能抵抗氧化損傷而死亡，是一個(gè)非常有潛力的抗血吸蟲(chóng)感染新藥開(kāi)發(fā)靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)抗血吸蟲(chóng)SjTGR 分子酶活性的抑制劑已成為血吸蟲(chóng)治療新藥研究的熱點(diǎn)。蛋白酶抑制劑包括了化學(xué)抑制劑，多肽抑制劑和抗體抑制劑。Sayed等篩選到能有效抑制曼氏血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SmTGR)蛋白活性的化學(xué)抑制劑，如噁二唑、 磷酰胺、金諾芬。宋麗君等篩選到能抑制日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)的化學(xué)抑制劑金諾芬、化合物4N等。這些化學(xué)抑制劑都具有一定的治療血吸蟲(chóng)病療效，但其副作用大，目前還沒(méi)有進(jìn)入臨床研究階段。除了化學(xué)抑制劑外，肽類(lèi)和抗體是蛋白酶的另一類(lèi)重要的功能抑制劑，已成為許多重要疾病的有效治療藥物，肽類(lèi)與抗體類(lèi)藥物是近十年全球成長(zhǎng)最快的醫(yī)藥產(chǎn)品?？贵w由于其分子量大，不能進(jìn)入細(xì)胞與目標(biāo)靶分子直接作用，且易引起免疫中和與排異反應(yīng)，限制了其應(yīng)用價(jià)值。肽類(lèi)藥物因其分子量小，能直接進(jìn)入靶細(xì)胞中直接抑制目標(biāo)靶分子的功能，使用劑量小，療效明確，具有廣泛的應(yīng)用前景。噬菌體展示肽庫(kù)是將一組人工設(shè)計(jì)合成的編碼由7-12個(gè)氨基酸組成的短肽的基因序列與噬菌體M13的外殼蛋白ρ III基因的N未端融合，使人工設(shè)計(jì)的短肽表達(dá)、展示在噬菌體外殼蛋白表面，并保持其空間構(gòu)象。這種肽展示庫(kù)包涵了 IO9種以上的短肽，可以模擬自然界可能存在各種蛋白結(jié)構(gòu)，包括各種蛋白酶的底物結(jié)構(gòu)。利用酶與底物親和結(jié)合的特性，可以從噬菌體展示肽庫(kù)中篩選到與蛋白酶特異性結(jié)合的短肽，為新藥的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。 噬菌體展示技術(shù)將基因型與表型，分子結(jié)合活性與噬菌體的可擴(kuò)增性結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了基因型到表型的轉(zhuǎn)換，是肽類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)革命性新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是利用噬菌體展示技術(shù)篩選能與日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)特異性結(jié)合，抑制其酶活性，破壞血吸蟲(chóng)氧化還原代謝平衡的抑制肽，可用于血吸蟲(chóng)病治療新藥的研究。本發(fā)明的技術(shù)方案抑制日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)活性的抑制肽，所述的抑制肽其名稱(chēng)與氨基酸序列分別為
JIPDysl =WPHNWffPHFKVK ；BP SEQ NO. 1: Trp Pro His Asn Trp Trp Pro His Phe Lys Val Lys ；
JIPDys2 :LHAETRSAMHRT ；即 SEQ NO. 2: Leu His Ala Glu Thr Arg Ser Ala Met His Arg Thr ；
JIPDys3 :YTMPSLTLYAMG ；BP SEQ NO. 3: Tyr Thr Met Pro Ser Leu Thr Leu Tyr Ala Met Gly ；
所述SjTGR活性抑制肽的氨基酸序列演變而產(chǎn)生的其它具有抑制SjTGR活性的肽段。所述的SjTGR活性抑制肽在制備治療血吸蟲(chóng)病新藥或治療用藥物靶向載體制備方面的應(yīng)用。本發(fā)明用于篩選上述三種抑制肽的結(jié)合蛋白為重組日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)硒蛋白。所述的SjTGR蛋白分子的氨基酸序列SEQ ID NO :4，保持有至少90%的同源性。所述的SjTGR蛋白分子，其基因核苷酸序列編碼為SEQ ID NO :5。所述的重組SjTGR硒蛋白分子(SjTGRsec)的表達(dá)，在于首先將編碼SjTGR蛋白分子核苷酸片段SEQ ID NO :5的3’未端與與大腸桿菌中的硒代半胱氨酸插入序列SEQ ID NO 6的5，未端通過(guò)PCR的方法連接在一起形成一個(gè)嵌合基因序列SEQ ID NO :7。然后通過(guò)插入到一種表達(dá)載體pET-41a中形成重組表達(dá)質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a，然后將重組表達(dá)載體SjTGRsec/pET-41a轉(zhuǎn)化入一種宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21 (DE3)中表達(dá)重組SjTGR硒蛋白。所述的重組SjTGR硒蛋白的制備方法，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白分離和純化，以及鑒
定步驟。本發(fā)明為了獲得純化的重組SjTGR硒蛋白，根據(jù)SjTGR硒蛋白中含有ADP結(jié)合域的結(jié)構(gòu)特征，采用ADP-s印harose 4B膠親和層析的方法進(jìn)行純化制備。所述重組SjTGR硒蛋白應(yīng)用包括但不限于1)通過(guò)蛋白酶活性抑制的方法篩選、 鑒定該蛋白酶抑制劑，用于血吸蟲(chóng)病的治療。包括但不局限于化學(xué)抑制劑，多肽抑制劑和抗體抑制劑。2)制備血吸蟲(chóng)感染疫苗。
本發(fā)明優(yōu)選的表達(dá)質(zhì)粒是pET_41a (美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品)，適合在大腸桿菌工程菌中表達(dá)。但是，本發(fā)明中的SjTGR硒蛋白也可選擇利用其它質(zhì)粒來(lái)表達(dá)，這些表達(dá)質(zhì)粒包括但是不局限于原核、真核表達(dá)系統(tǒng)常用的質(zhì)粒。具體地，該表達(dá)質(zhì)粒含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，用以控制融合蛋白的表達(dá)。這些啟動(dòng)子包括但是不局限于以下所述的tac啟動(dòng)子，優(yōu)選的啟動(dòng)子為T(mén)7。本發(fā)明在表達(dá)SjTGR硒蛋白時(shí)使用質(zhì)粒pSU ABC為硒蛋白表達(dá)的輔助質(zhì)粒，為 SjTGR硒蛋白中硒代半胱氨酸的摻入提供k、Sel B和C等輔助因子。本發(fā)明提供構(gòu)建SjTGR硒蛋白的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法及工程菌構(gòu)建方法。首先克隆獲得編碼SjTGR的核苷酸序列。編碼SjTGR蛋白氨基酸序列的核苷酸序列與序列SEQ ID NO 2保持有至少90%的同源性。具體地，通過(guò)RT-PCR技術(shù)，從血吸蟲(chóng)mRNA中反轉(zhuǎn)錄合成編碼SjTGR蛋白核苷酸片段。將SjTGR基因片段克隆到TA克隆載體pGEM-T中構(gòu)建重組質(zhì)粒SjTGR/pGEM_T進(jìn)行DNA 序列分析，確定其基因序列的正確性。然后SjTGR基因片段為模板，使用SjTGR基因的5’端引物與另一個(gè)帶有大腸桿菌硒代半胱氨酸插入序列(SEQ ID NO :6)的3’引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得表達(dá)SjTGR硒蛋白的嵌合基因(SEQ ID NO :7)，并使該基因的5'端帶有Mfe I的酶切位點(diǎn)，3'端帶有5 / I 的酶切位點(diǎn)。通過(guò)Mfe I , Sal I酶切位點(diǎn)插入到表達(dá)質(zhì)粒pET-41a中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 SjTGRSeC/pET-41a。將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，再轉(zhuǎn)種到含有氨芐青霉素 (AMP)的LB平板(1%的蛋白胨，0. 5%的酵母抽提物，1%氯化鈉，瓊脂粉1. 2%，氨芐青霉素100 mg/mL)上進(jìn)行繁殖和保種。本發(fā)明表達(dá)SjTGR硒蛋白的重組質(zhì)粒SjTGRSeC/pET-41a可在多種大腸桿菌中表達(dá)，其優(yōu)選的菌株是大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明提供一種工程菌大規(guī)模表達(dá)SjTGR硒蛋白的方法。具體地，將含有重組表達(dá)質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a的單個(gè)菌落再轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSU ABC,形成含有SjTGRsec/pET_41a和 pSU ABC兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌。再接種到選擇性培養(yǎng)基LB (1%的蛋白胨，0.5%的酵母抽提物，1%氯化鈉，卡那霉素50 mg/mL和氯霉素34 mg/mL)中，37° C振搖過(guò)夜。第二天按 1 10稀釋接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37° C振搖培養(yǎng)4 h (OD600 0. 4)，加入亞硒酸鹽與半胱氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)至靜止生長(zhǎng)期，加入0. 1 mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá) SjTGR硒蛋白。重組SjTGR硒蛋白的表達(dá)，可以通過(guò)一般的蛋白生化手段檢測(cè)，包括但不局限于 酶學(xué)分析，SDS-PAGE, Western Blotting 等。本發(fā)明也提供一種SjTGR硒蛋白的分離純化方法。具體地，通過(guò)阿糖胞苷_2’， 5’ - 二磷酸瓊脂糖凝膠親和層析從表達(dá)產(chǎn)物中制備出純化的重組SjTGR蛋白。本發(fā)明提供一種篩選與SjTGR蛋白特異性結(jié)合噬菌體展示肽的方法。具體地，以純化的重組SjTGR蛋白包被酶標(biāo)板，再用噬菌體展示肽庫(kù)(P. h. D-12)噬菌體進(jìn)行反應(yīng)，洗出未結(jié)合噬菌體后再用NADPH洗脫與重組SjTGR特異性結(jié)合的噬菌體。將洗脫噬菌體感染大腸桿菌ER2538中進(jìn)行擴(kuò)增，再以上述方法重新進(jìn)行篩選，如此重復(fù)篩選三次，最后獲得能表達(dá)與重組SjTGR蛋白特異性結(jié)合肽的噬菌體。本發(fā)明還提供一種鑒定能與重組SjTGR蛋白特異性結(jié)合的噬菌體表達(dá)外源模擬肽的基因序列與氨基酸序列的鑒定方法。具體地，制備能與重組SjTGR蛋白特異性結(jié)合噬菌體DNA，以DNA序列分析，確定噬菌體中外源性插入肽段的基因序列，再演繹成肽氨基酸序列。通過(guò)與Genbank中已經(jīng)存在的蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，確定該噬菌體模擬展示肽的性質(zhì)。本研究提供一種鑒定噬菌體展示肽與重組SjTGR蛋白結(jié)合特異性的方法。具體地，通過(guò)SDS-PAGE及電轉(zhuǎn)移方法將SjTGR蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上，再將含有SjTGR蛋白條帶的NC膜與篩選到的噬菌體反應(yīng)，去除未結(jié)合的噬菌體后再與酶標(biāo)記抗M13噬菌體二抗反應(yīng)，用底物3' ,3' -二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色，觀(guān)察選到的噬菌體與重組SjTGR的反應(yīng)情況，以判斷此噬菌體與SjTGR蛋白結(jié)合的特異性。本研究提供一種測(cè)定重組SjTGR蛋白的硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽還原酶及谷氧還蛋白活性的測(cè)定方法及篩選到的噬菌體對(duì)SjTGR活性抑制效果的分析方法。具體地，硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性的測(cè)定方法是將5_聯(lián)硫代-雙_2_硝基苯甲酸(DTNB)與還原型輔酶I (NADPH)混合，在有SjTGR存在的情況下，DTNB可被還原為 5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中TNB在波長(zhǎng)為412nm處吸收值的增加值來(lái)確定SjTGR的TrxR的活性。在上述體系中加入一定數(shù)量的噬菌體，觀(guān)察對(duì)其酶活性的抑制作用。谷胱甘肽還原酶(GR)的活性測(cè)定的方法是將氧化型的谷胱甘肽(GSSG)與NADPH 混合，在有TGR存在的情況下，氧化型谷胱甘肽被還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，隨著NADPH 被消耗，反應(yīng)體系在340nm處的吸收峰值逐漸下降，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系在340nm處吸光度的變化來(lái)確定SjTGR的GR活性。在上述體系中加入一定數(shù)量的噬菌體，觀(guān)察其對(duì)酶活性的抑制作用。谷氧還蛋白(Grx)的活性測(cè)定方法是在NADPH提供還原物的情況下，Grx依賴(lài)于 GSH還原β -羥乙基二硫化物(HED)，生成HED還原形式的同時(shí)，形成了 Grx-GSSG反應(yīng)中間體。這個(gè)中間體被第2個(gè)分子的GSH還原，產(chǎn)物為Grx-GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。 GSSG在酵母谷光甘肽還原酶(Yeast GR)的作用下生成GSH，繼續(xù)參與Grx的巰基-二硫化物轉(zhuǎn)換的反應(yīng)。Grx酶活性同樣是測(cè)定NADPH消耗量來(lái)計(jì)算。在上述體系中加入一定數(shù)量的噬菌體，觀(guān)察其對(duì)酶活性的抑制作用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明篩選到的三條噬菌體展示肽對(duì)日本血吸蟲(chóng)生存必須蛋白分子-硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)的硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽還原酶及谷氧還蛋白活性均具有抑制作用。為開(kāi)發(fā)新的血吸蟲(chóng)病治療藥物奠定了良好的基礎(chǔ)，對(duì)控制血吸蟲(chóng)病流行有重要的意義。


圖1日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)的基因擴(kuò)增 M 核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量大??；1、PCR擴(kuò)增得到的SjTGR基因片段。圖2 SjTGR-SECIS嵌合基因的制備；M :DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 =SjTGRsec嵌合基因片段。圖3重組質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a酶切分析；1、DNA分子量標(biāo)志物；2、日本血吸蟲(chóng) TGR基因純化產(chǎn)物；3、重組的SjTGRsec/pET-41a質(zhì)粒經(jīng)Mfe I/Sal I雙酶切產(chǎn)物；4、質(zhì)粒pET-41a 經(jīng)Mfe I/Sal I 雙酶切產(chǎn)物；5、質(zhì)粒 pET_41a ;6、重組質(zhì)粒 SjTGRsec/pET_41a。
圖4重組日本血吸蟲(chóng)TGR蛋白的表達(dá)產(chǎn)物電泳圖；M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、含質(zhì)粒 SjTGRsec/pE-T41a的大腸桿菌BL21表達(dá)產(chǎn)物的沉淀；2、含質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a的大腸桿菌BL21表達(dá)產(chǎn)物的上清；3、含質(zhì)粒pET-41a的大腸桿菌BL21表達(dá)產(chǎn)物；4、大腸桿菌BL21 的表達(dá)產(chǎn)物。圖5 SjTGR硒蛋白表達(dá)量分析；A、SjTGR蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE圖；B、SjTGR 蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE凝膠的放射性自顯影；M、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、含質(zhì)粒SjTGRsec/ pET-41a的大腸桿菌BL21表達(dá)產(chǎn)物；2含質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a和pSU ABC的大腸桿菌 BL21表達(dá)產(chǎn)物；*電泳后在SDS-PAGE凝膠上點(diǎn)上的表達(dá)產(chǎn)物的樣品。圖6純化的重組SjTGR蛋白；1、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物；2、純化的重組SjTGR蛋白。圖7不同的噬菌體克隆與SjTGR結(jié)合強(qiáng)度的比較。a、lX1012，b、2. 5X1011，C、 6X101Q，d、1.5X101Q，e、3. 75X IO9 ;a，為 a 的對(duì)照，b，為 b 的對(duì)照，c，為 c 的對(duì)照，d，為 d 的對(duì)照，e’為e的對(duì)照。圖8 Western Blotting鑒定噬菌體；Μ、蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、JIPDysl ;2、 JIPDys2 ；3、JIPDys3 ；4、JIPDys4。圖9不同的噬菌體對(duì)SjTGR酶活性的抑制作用。a、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)，b、 谷胱甘肽還原酶(GR)，C、谷氧還蛋白(Grx)。圖10噬菌體對(duì)重組SjTGR酶活性的抑制作用。
具體實(shí)施例方式下面提供的實(shí)施例可以詳細(xì)地解釋本發(fā)明的主要內(nèi)容，但不局限于以下這些內(nèi)容。實(shí)施例1 日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)基因克隆
日本血吸蟲(chóng)SjTGR基因通過(guò)RT-PCR技術(shù)，從血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)組織的mRNA中反轉(zhuǎn)錄合成而來(lái)，具體制備方法如下
1、血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)mRNA的制備
取新鮮分離的血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)0.5 g，在液氮中冷凍后，在陶瓷研缽中粉碎，再用GE Healthcare 公司的 mRNA 純化試劑盒(Illustra QuickPrep mRNA purification kit)制備純化mRNA，操作方法嚴(yán)格按試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)。用紫外分光光度計(jì)測(cè)mRNA的純度與含量。2、SjTGR 基因擴(kuò)增 2.1引物設(shè)計(jì)
SjTGRl 5’ -AACATATGCCTCCGATTGATGGAACA-3’
單劃線(xiàn)為Mfe I位點(diǎn)； SjTGR2: 5' -TCAGCAACCGGTTACCGCTGCAGAGCCCCCA-3'
2.2第一鏈cDNA合成
采用Phusion RT-PCR Kit (購(gòu)自NEB北京分公司)在一0. 2 mL的PCR管中，加入mRNA 2 μ L(約 IOng)，10 mM dNTP 混合物 1 yL，01igo(dT) primer 1 μ L，加無(wú)離子水至 10 UL0混勻，離心收集于管底。65° C，水浴預(yù)變性5 min，置冰上冷卻。加入IOX反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μ L，反轉(zhuǎn)錄酶混合物2 PL，無(wú)核糖核酸酶水(無(wú)foiase水)6 μ L，混勻，離心收集于管底。25° C保溫10 min，再在40° C保溫30 min以合成cDNA。80° C保溫5min以中
止反應(yīng)。2.3目的基因擴(kuò)增
在一個(gè) 0.2 mL 的 PCR 管中，加入 2 XPhusiona Master Mix 25 μ ，第一鏈 cDNA 3 μ , 引物SjTGIil 0.5 μ (25 PM)、SjTGR2 0.5 μ (25 μΜ)，加無(wú)核糖核酸酶水到終體積50 μ 0 PCR 條件98 ° C 30 Sec;然后 98° C 變性 10 Sec ；56° C,30 Sec,72° C,90 kc，一共 30個(gè)循環(huán)；最后，72° C、保溫5 min。采用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳方法回收純的SjTGR基因片段。具體是用1%的低融點(diǎn)agarose膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，切下分子量約ISOObp左右的目的DNA條帶，再用Promega公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化SjTGR基因DNA片段。如圖1所示。TA克隆與序列分析
SjTGR的3'端加腺嘌呤(A)尾巴將純化的SjTGR片段置于PCR反應(yīng)管中，加入 IOXTaq DNA 聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液 10 μ , MgCl2 10 μ (25 mmol/L), dATPl μ (10 mmol/ L)，Taq DNA聚合酶1 μ (5 U/μ ，加滅菌無(wú)離子水至100 μ ,在PCR儀上72° C保溫30 min，使SjTGR基因片段的3'端加上“A”尾巴。用!Iomega公司的酶切產(chǎn)物純化試劑盒純化加A尾后的SjTGR基因DNA片段。再用!Iomega公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化SjTGR 基因DNA片段。將SjTGR DNA片段與TA clone載體pGEM_T (美國(guó)PR0MEGA公司產(chǎn)品)按照3 1的比例混合，在T4 DNA連接酶的作用下連接，反應(yīng)體系如下2X ligase buffer 5 mL, pGEM-T vector 1 μ (50 ng)，SjTGR DNA 片段 3 μ , Τ4 DNA ligase 1 μ ，總體積 10 μ 。混勻后，短暫離心，16° C水浴連接過(guò)夜，形成重組質(zhì)粒SjTGR/pGEM-T。電轉(zhuǎn)化1)取5 PL連接產(chǎn)物加入到50 PL感受態(tài)細(xì)胞Ε. coli Dffia中，小心混勻， 勿使有氣泡產(chǎn)生，放置冰浴上30 min。2)將連接產(chǎn)物與Ε. coli Dffia的混合物轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的狹縫為0. Icm的電擊杯中，勿使有氣泡產(chǎn)生，小心拭去電擊杯外的冷凝水。3)設(shè)置電脈沖儀(BIO-RAD)脈沖參數(shù)電壓2. 5 kV，電容25 PF，電阻200 Ω。將電擊杯插入電脈沖儀電擊槽內(nèi)，同時(shí)按住兩個(gè)脈沖電極保持至放電為止。4)取出電擊杯，加入0.5 mL 37° C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，混勻后將電擊后的菌液轉(zhuǎn)移到一無(wú)菌玻璃試管中，37° C、200 rpm振蕩培養(yǎng)40 min。5)取200 PL菌液均勻涂布于表面預(yù)先涂有40 μ X_gal (40 mg/mL)的LB 平板上(含Amp 100 Pg/mL)。室溫下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37° C 培養(yǎng)箱過(guò)夜。在LB平板上出現(xiàn)白色菌落可初步判定為陽(yáng)性克隆，藍(lán)色菌落為陰性克隆。將白色菌落細(xì)菌送到上海英俊公司進(jìn)行DNA序列分析。實(shí)施例2 表達(dá)SjTGR硒蛋白嵌合基因的構(gòu)建
1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)大腸桿菌硒代半胱氨酸插入序列，設(shè)計(jì)一個(gè)下游引物TGR3，使這包括SjTGR的3’端序列與大腸桿菌硒代半胱氨酸插入序列。SjTGR3: 5’ -GTCGACGGGCGCATAGGTTAACGATTGGTGCAGACCTGCAACCGA TTATTAACCTCAGCAACCGGTTACCGC-3，，單劃線(xiàn)為 Sal I 位點(diǎn)。引物的合成由上海英俊公司完成。2、日本血吸蟲(chóng)SjTGR硒蛋白表達(dá)基因的制備
在一個(gè) 0.2 mL 的 PCR 管中，加入 5XPhusion HF buffer 10 μ , IOmM dNTP 1 μ ，引物SjTGRl 1 μ (25 μΜ),SjTGR3 1 μ (25 μΜ)，SjTGR/pGEM-T 1 μ (50 ng)， Phusion Hot Start DNA Polymerase 0.5 μ ，加無(wú)核糖核酸酶水到終體積50 μ 。PCR條件98 ° C、 30 Sec;然后 98° C 變性 10 Sec ；70. 6° C,30 Sec,72° C,90 kc，一共；35 個(gè)循環(huán)。采用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳方法回收純的SjTGR基因片段。具體是用1%的低融點(diǎn)agarose膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，切下分子量約1800bp左右的目的DNA條帶，再用Promega公司的PCR 產(chǎn)物回收試劑盒純化SjTGRsec基因DNA片段。如圖2所示。TA克隆與序列分析
SjTGRsec的3'端加腺嘌呤(A)尾巴將純化的SjTGRsec片段置于PCR反應(yīng)管中， 加入 IOXTaq DNA 聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液 10 μ , MgCl2 10 μ (25 mmol/L), dATPl μ (10 mmol/L), Taq DNA聚合酶1 μ (5 U/^L)，加滅菌無(wú)離子水至100 μ ，在PCR儀上72° C 保溫30 min，使SjTGR基因片段的3'端加上“A”尾巴。用!Iomega公司的酶切產(chǎn)物純化試劑盒純化加A尾后的SjTGRsec基因DNA片段。再用Promega公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化SjTGRsec基因DNA片段。將SjTGRsec DNA片段與TA clone載體pGEM-T(美國(guó) PR0MEGA公司產(chǎn)品)按照3 1的比例混合，在T4 DNA連接酶的作用下連接，反應(yīng)體系如下2X ligase buffer 5 mL, pGEM-T vector 1 μ (50 ng)，SjTGR DNA 片段 3 μ , Τ4 DNA ligase 1 μ ，總體積10 μ ?；靹蚝螅虝弘x心，16° C水浴連接過(guò)夜，形成重組質(zhì)粒 SjTGRsec/pGEM-T。電轉(zhuǎn)化1)取5 μ 連接產(chǎn)物加入到50 μ 感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5a中，小心混勻，勿使有氣泡產(chǎn)生，放置冰浴上30 min. 2)將連接產(chǎn)物與E. coli Dffia的混合物轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的狹縫為0. Icm的電擊杯中，勿使有氣泡產(chǎn)生，小心拭去電擊杯外的冷凝水。3) 設(shè)置電脈沖儀(BIO-RAD)脈沖參數(shù)電壓2. 5 kV，電容25 PF，電阻200Ω。將電擊杯插入電脈沖儀電擊槽內(nèi)，同時(shí)按住兩個(gè)脈沖電極保持至放電為止。4)取出電擊杯，加入0.5 mL 37° C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，混勻后將電擊后的菌液轉(zhuǎn)移到一無(wú)菌玻璃試管中，37° C、200 rpm振蕩培養(yǎng)40 min。5)取200 PL菌液均勻涂布于表面預(yù)先涂有40 μ X_gal (40 mg/ mL)的LB平板上(含Amp 100 Pg/mL)。室溫下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37° C培養(yǎng)箱過(guò)夜。在LB平板上出現(xiàn)白色菌落可初步判定為陽(yáng)性克隆，藍(lán)色菌落為陰性克隆。將白色菌落細(xì)菌送到上海英俊公司進(jìn)行DNA序列分析，以確定構(gòu)建的SjTGR硒蛋白表達(dá)基因序列的正確性。實(shí)施例3 =SjTGR硒蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
本發(fā)明采用pET-41a為表達(dá)載體質(zhì)粒，其制備方法為常用分子生物學(xué)方法。即通過(guò)培養(yǎng)含有表達(dá)載體的菌種，提取獲得該質(zhì)粒。制備質(zhì)粒后-20° C保存待用。
具體如下，對(duì)表達(dá)載體質(zhì)粒pET_41a及重組質(zhì)粒S jTGRsec/pGEM-T分別進(jìn)行 Nde I、Sal I雙酶切。具體條件如下。質(zhì)粒DNA 30 VL,Nde I 2VL,Sal I 2μ ,10Χ酶切緩沖液5 PLJaddH2O至總體積為50 μ 。37° C溫浴3小時(shí)，通過(guò)低瓊脂糖凝膠電泳回收線(xiàn)性化的pET-41a質(zhì)粒DNA和SjTGRsec DNA片段。將回收的SjTGRsec DNA片段與表達(dá)質(zhì)粒pET-41a DNA片段連接，構(gòu)建SjTGR硒蛋白表達(dá)質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a。連接體系為 10 mL，雙酶切的pET-41a質(zhì)粒與雙酶切SjTGRsec DNA的摩爾比為1 2_10，10XT4 DNA ligase緩沖液1 μ ，Τ4 DNA ligase 1 μ ，加無(wú)菌水至總體積為10 μ 。連接反應(yīng)16° C 恒溫水浴內(nèi)溫浴16小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性克隆的鑒定是通過(guò)含卡那霉素的LB平板挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，并通過(guò)Mfe I和5 / I雙酶切分析確定目的基因是否被插入到表達(dá)載體中(圖3所示)。實(shí)施例4 =SjTGR硒蛋白表達(dá)工程菌的構(gòu)建具體方法如下。首先挑選含有SjTGRSeC/pET-41a組質(zhì)粒的細(xì)菌克隆，提取質(zhì)粒DNA。然后，用電轉(zhuǎn)化的方法把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中。質(zhì)粒DNA提取方法按Promega公司質(zhì)粒DNA純化試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌具體如下。先進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備。挑取新鮮的BL21 (DE3)單菌落，接種至含有3 mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，37° C、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。然后取1 mL的培養(yǎng)物接種至含有500 mL新鮮LB培養(yǎng)基的2 L三角搖瓶中，37° C、250_300 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，至OD6tltl小于0. 4， 將細(xì)菌培養(yǎng)物置于冰上冷卻，2500 g離心20 min，去上清，用500 mL的冰預(yù)冷的ddH20將菌體沉淀重懸。離心后，再用250 mL的冰預(yù)冷的10%的甘油溶液將菌體沉淀重懸。再離心， 用10 mL的冰預(yù)冷的10%的甘油溶液將菌體沉淀重懸。再離心，用冰預(yù)冷的10%的甘油溶液將菌體沉淀重懸，調(diào)節(jié)菌液OD6tltlnm=IO. 0。以每管100 mL的體積分裝感受態(tài)細(xì)胞，-70° C 保存?zhèn)溆谩ｋ姄艮D(zhuǎn)化，具體如下。將SjTGRsec/pET_41a重組質(zhì)粒DNA溶解在5 10 μ TE溶液中，與80 PL的上述感受態(tài)菌體混勻，轉(zhuǎn)至0. Icm狹縫的預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴10 min。然用1. 8 kv電壓、25 PF電容；200 Ω電阻的條件進(jìn)行電擊。電擊完畢后，加入1 mL 37° C預(yù)溫的LB液體培養(yǎng)基懸浮，并轉(zhuǎn)至無(wú)菌的玻璃試管中，37° C.250-300 r/min培養(yǎng)40 min。將菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，置于37° C培養(yǎng)過(guò)夜。挑取過(guò)夜生長(zhǎng)平板上的單個(gè)菌落，接種3 mL LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50 Pg/mL)，37° C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日以1 100比例將過(guò)夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接入3 mL LB培養(yǎng)液中，37° C、200 rpm振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。取1 mL的LB培養(yǎng)液到1. 5 mL的離心管中，離心沉淀細(xì)菌，將上清倒掉。將1 μ LWpSU ABC質(zhì)粒加在細(xì)菌沉淀表面。加入100 mL預(yù)冷的TSS緩沖液(TSS 緩沖液在 50 mL 的 TSS 緩沖液中含有 5 g 的 PEG 6000/8000，2. 5 mL 的 DMS0，2. 5 mL 1 M 的MgCl2和32. 5 mL的LB培養(yǎng)基，小心混勻)。4° C冰箱靜置30 min。加入1 mL的LB培養(yǎng)基，37° C溫育1小時(shí)。離心5 min，去掉上清，用100 mL的 LB培養(yǎng)基重懸沉淀，懸浮液均勻涂布于LB平板上(含卡那霉素50 mg/mL和氯霉素34 mg/ mL)，37° C培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)卡那霉素和氯霉素篩選含重組表達(dá)質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a和 pSU ABC的菌株。實(shí)施例5 =SjTGR硒蛋白的表達(dá)
挑取單個(gè)菌落接種3 mL LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50 Pg/mL和氯霉素；34 mg/mL), 37° C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日以1 100比例將過(guò)夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接入1 L LB培養(yǎng)液中(含卡那霉素50 Pg/mL和氯霉素34 mg/mL)，37° C，200 rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD6tltlnm達(dá)到1. 8左右時(shí)，加入L-半胱氨酸(100 mg/mL)和硒酸鹽(5 mM)。當(dāng)菌液OD600nm達(dá)到2. 4時(shí) (即靜止生長(zhǎng)期)，將培養(yǎng)物冷卻到室溫，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，在C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集細(xì)菌(菌液的OD6tltlnm大概在4-5)，去上清，用25 mL的PBS重懸浮細(xì)菌沉淀。加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，在冰上放置1小時(shí)。反復(fù)凍融2_3次，直到菌液變?yōu)檎吵?。在?xì)菌裂解物中加MgCl2溶液至終濃度8 mM,DNase I至終濃度10 U/mL,低溫下孵育消化細(xì)菌DNA至菌液變?yōu)橐后w。以16 000 rpm離心30 min，收集上清，用PBS重懸沉淀。取上述表達(dá)產(chǎn)物200 mL加等體積2X蛋白電泳上樣緩沖液，混勻，室溫作用30 min, 煮沸10 min，取20 mL表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12 % SDS-PAG電泳。120 V電壓使樣品進(jìn)入分離膠后，180 V電壓繼續(xù)電泳70 min。電泳結(jié)束后，取出凝膠，室溫下考馬斯亮藍(lán)染色30 min，再用脫色液脫色至背景清晰為止，表達(dá)產(chǎn)物中有一條分子量約65kDa的蛋白條帶(圖4所示)。實(shí)施例6 =SjTGR硒蛋白表達(dá)量分析
分別將含有重組質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a和質(zhì)粒pSU ABC的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌、含有重組質(zhì)粒 SjTGRsec/pET-41a的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的BL21單個(gè)菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，培養(yǎng)過(guò)夜的菌液按1 100分別接種于1 mL的LB培養(yǎng)基中，各加入1 mL的7Se半胱氨酸。37° C，200 rpm振搖3小時(shí)，加入5 mM的硒酸鹽，100 mg/mL的L-半胱氨酸，繼續(xù)振搖培養(yǎng)。約1小時(shí)后，加入IPTG至終濃度為0.1 mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)4小時(shí)。 取20 μ L的菌液加入等體積的2X上樣緩沖液，混勻，室溫作用30 min，煮沸10 min，取 20 PL表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12 % SDS-PAG電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠，室溫下考馬斯亮藍(lán)染色 30 min，再用脫色液脫色至背景清晰為止。將凝膠放入感光屏上，用圖像掃描儀器掃描觀(guān)察是否有7Se放射性的顯影條帶。從顯影照片上可以發(fā)現(xiàn)含有重組質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a 和質(zhì)粒pSU ABC的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌表達(dá)的SjTGR蛋白中7Se標(biāo)記的硒代半胱氨酸的含量明顯高于只含有質(zhì)粒SjTGRsec/pET-41a質(zhì)粒細(xì)菌表達(dá)的SjTGR蛋白中7Se標(biāo)記的硒代半胱氨酸的含量。圖5所示。實(shí)施例7 =SjTGR硒蛋白的純化
按實(shí)施例5的方法大量制備表達(dá)SjTGR硒蛋白的細(xì)菌，細(xì)菌裂解后將裂解物上清液過(guò) 0.45 μ m的過(guò)濾器過(guò)濾，用平衡緩沖液(50 mM磷酸鉀，3 mM EDTA，pH 7. 5)稀釋10倍。將 ADP-agrose凝膠裝入到層析柱中，用5個(gè)柱體積平衡緩沖液平衡柱。再將稀釋后的表達(dá)產(chǎn)物以0.5 mL/min的速度上樣。用洗滌緩沖液(0.4 M磷酸鉀，3mM EDTA，pH 7. 5)洗柱，直到A28tlnm的紫外吸收值不再降低為止。用50 mM磷酸鉀緩沖液(含0. 5 M KCl，pH 7. 5)將重組蛋白從柱上洗脫下來(lái)。用超濾管濃縮洗脫下來(lái)的重組蛋白溶液，再用平衡緩沖液稀釋一定的倍數(shù)后重新上一新的ADP-Agarose凝膠柱。用洗滌緩沖液(0.4 M磷酸鉀緩沖液含3 mM EDTA，pH 7. 5)洗滌柱子直到A28tlnm紫外吸收值不再降低為止。再用洗脫緩沖液(50 mM磷酸鉀，0 0.5 mM NADPH, 3 mM EDTA，pH 7. 5)進(jìn)行特異性的洗脫，分管收集洗脫蛋白。每管洗脫液取20 PL進(jìn)行12 % SDS-PAG電泳，電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)染色30 min，再用脫色液脫色至背景清晰為止，觀(guān)察獲得重組SjTGR硒蛋白純度。電泳結(jié)果顯示獲得的SjTGR硒蛋白為單一的蛋白條帶，純度高于95%。如圖6所示。實(shí)施例8 重組SjTGR的硫氧還蛋白還原酶活性分析方法
硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的活性硫氧還蛋白還原酶的活性是通過(guò)DTNB的還原反應(yīng)和胰島素的還原反應(yīng)來(lái)測(cè)定的。DTNB 的還原
1)反應(yīng)原理5-聯(lián)硫代-雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)在還原物NADPH存在情況下，可被TrxR還原為5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)，TNB在波長(zhǎng)為412nm處有最大的吸收峰，發(fā)生酶 促還原反應(yīng)后，反應(yīng)體系在412nm的吸收值會(huì)增加。
權(quán)利要求
1.抑制日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶SjTGR活性的抑制肽，其特征在于所述的抑制肽氨基酸序列分別為SEQ NO. 1 ；即 JIPDysl =WPHNWffPHFKVK ； SEQ NO. 2 ；即 JIPDys2 :LHAETRSAMHRT ； SEQ NO. 3 ；即 JIPDys3 :YTMPSLTLYAMG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述SjTGR活性抑制肽，其特征在于該抑制肽的氨基酸序列演變而產(chǎn)生的其它具有抑制SjTGR活性的肽段。
3.按權(quán)利要求1、或2所述的SjTGR活性抑制肽的應(yīng)用，其特征在于在制備治療血吸蟲(chóng)病新藥或治療用藥物靶向載體制備方面的應(yīng)用。
全文摘要
日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶SjTGR功能抑制肽及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)的分子生物學(xué)與生物化學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了抑制日本血吸蟲(chóng)硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)活性的抑制肽，所述的抑制肽氨基酸序列分別為JIPDys1WPHNWWPHFKVK；JIPDys2LHAETRSAMHRT；JIPDys3YTMPSLTLYAMG；及所述的SjTGR活性抑制肽在制備治療血吸蟲(chóng)病新藥或治療用藥物靶向載體制備方面的應(yīng)用。本發(fā)明篩選到的三條噬菌體展示肽對(duì)日本血吸蟲(chóng)生存必須蛋白分子-硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(SjTGR)的硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽還原酶及谷氧還蛋白活性均具有抑制作用；為開(kāi)發(fā)新的血吸蟲(chóng)病治療藥物奠定了良好的基礎(chǔ)，對(duì)控制血吸蟲(chóng)病流行有重要的意義。
文檔編號(hào)A61K47/42GK102336816SQ20111030148
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者余傳信, 宋麗君, 梁幼生, 殷旭仁, 王玠, 錢(qián)春艷 申請(qǐng)人:江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所