一種分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種由雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法。
【背景技術】
[0002]硫酸銨分級沉淀和柱層析法是傳統(tǒng)的分離谷胱甘肽過氧化物酶的方法，硫酸銨沉淀法的原理是高濃度的硫酸銨離子在蛋白溶液中與蛋白競爭水分子，從而破壞蛋白表面的水化膜，降低其溶解度并使之從溶液中沉淀出來，因此可利用不同濃度的硫酸銨溶液沉淀溶解度不同的蛋白；柱層析法的原理是蛋白樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次分配后可將不同蛋白分離。這2項技術原理簡單但實驗過程繁瑣復雜，不僅需要專門的實驗設備和儀器，且分離蛋白時間超長，不能實現(xiàn)蛋白純化和蛋白批量化，因此有待探索新的實驗技術和方法。
[0003]Farrell于1975年首次建立了等電聚焦一聚丙稀酰胺雙向凝膠分離和分析蛋白質組的技術，并使用該技術成功分離了約1000個蛋白質。這就是后來的二維雙向凝膠電泳技術(Two-dimens1nal gelelectrophoresis)，并于20世紀70年代初廣泛應用，隨著該技術的不斷成熟和完善，其分離蛋白質的精度和特異性越來越高。操作二維雙向凝膠電泳時首先進行等電聚焦，使待分離的各個蛋白按各自的PH梯度分離，至各自的等電點處，再沿垂直方向按蛋白質分子量的不同進行分離。雙向凝膠電泳技術因其原理簡明，操作簡單，分離精準，能批量分離并純化蛋白等特點已能夠應用于分離蛋白質組中所有蛋白，如結合質譜鑒定技術，還能實現(xiàn)蛋白質鑒定等諸多功能。
[0004]酶蛋白是蛋白家族中種類最為豐富的一類蛋白，利用二維雙向電泳技術也可以實現(xiàn)酶蛋白精確的分離和純化，谷胱甘肽過氧化物酶是一類參與逆境調解的酶蛋白，是植物體內清除活性氧的重要酶類，能保護生物膜、蛋白質免受活性氧損傷，并具有提高植物抗性的生理功能。因此如能從眾多酶蛋白中單獨分離提純出谷胱甘肽過氧化物酶，就可進一步用于該酶的活性研究、氧化還原與清除氧自由基機理研究、抗逆機制研究、抗逆基因克隆、差異蛋白質組學的相關研究等。因此本發(fā)明利用二維雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶。
[0005]利用二維雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶，和傳統(tǒng)的分離技術相比，雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶過程中，經(jīng)過二次電泳后可將該酶蛋白充分分離，提高了蛋白分離的效率和精準度；雙向電泳技術還可實現(xiàn)平行泳道多次加樣和平行樣品重復實驗，因此能一次性得到一定數(shù)量的純化酶蛋白，可為其他科學實驗提供充足的酶蛋白樣品；該方法在實驗過程中共經(jīng)過了 3次純化蛋白的操作，保證了所分離的酶蛋白的高純度，可用于對酶蛋白的質量和純度要求很高的底物與蛋白互作等高層次的科學研究，這是傳統(tǒng)的蛋白分離技術所無法比擬和實現(xiàn)的。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供在金山繡線菊中分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，利用二維雙向凝膠電泳技術，通過凝膠掃描和圖像分析、膠內蛋白酶解等技術，建立在金山繡線菊中分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的技術體系，與傳統(tǒng)的提取該酶蛋白的方法相比，利用雙向電泳技術與方法分離純化蛋白具有更高的精確性、可操作性和先進性；該技術方法分離純化的蛋白具有更高的純度、更多的數(shù)量和更優(yōu)的科研價值。
[0007]由二維雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，按以下步驟進行:
[0008]—、金山繡線菊梯度低溫處理；二、金山繡線菊葉片蛋白質的提取:液氮充分研磨金山繡線菊葉片，加入蛋白提取試劑I，-20°C靜置過夜。低溫過夜后提取液4°C離心2小時留取沉淀，用含0.07% β -巰基乙醇約3倍沉淀體積的冷丙酮重懸沉淀后，在鼓風干燥裝置中抽干沉淀。按30 μ 1/mg比例加入蛋白提取試劑II，冰浴后4°C離心I小時留取上清液。三、蛋白質定量與純化:采用標準曲線法進行蛋白定量，按照2D-Quant試劑盒說明進行蛋白純化，純化后的蛋白樣品保存于-80°C冰箱中待用。四、第一相固相PH梯度等電聚焦電泳:取蛋白樣品溶液均勻滴加并充滿膠條槽底部，將膠條輕覆于液層上，在IPGphor電泳儀上進行等電聚焦，聚焦電泳后將膠條分別放入平衡液A、平衡液B中平衡15min，再用雙蒸水充分潤洗瀝干后進行第二相電泳。五、第二相SDS-PAGE凝膠電泳:按常規(guī)制膠方法灌制凝膠，之后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。六、凝膠平衡與染色:待電泳結束，蛋白充分分離后取出凝膠，放入固定液中固定，再將凝膠轉移至熱考染液中染色10分鐘，蛋白斑點清晰染色后，凝膠放入乙酸液中脫色，脫色至凝膠背景呈無色狀態(tài)。七、凝膠掃描和圖像分析:用UMAX掃描儀掃描染色的聚丙烯酰胺凝膠并獲取電子圖像，利用專業(yè)分析軟件2-DImagemaster ElitTM分析凝膠圖像，給出各個染色蛋白點的實際分子量和等電點。八、目標蛋白膠內酶解與脫水:在凝膠上準確切取分子量為19.095KDa、PI值為8.98的蛋白點(目標蛋白)，在切取的膠團中加入4-5 μ I含5ng/ μ I胰蛋白酶的25mM適量碳酸氫銨溶液，使膠團完全吸漲并酶解12-14小時。將蛋白酶解體系放入60 μ I的50%乙晴液中脫水45分鐘，再向乙腈液中加入16-18 μ 10.5%的適量TFA，將蛋白脫水體系放在4°C搖床上振蕩三小時，最后放入真空干燥超速離心機中旋轉干燥成白色膠粒。九、目標蛋白的重結晶與純化:在AnchorChipTM板點樣孔上均勻涂上一層CCA基質，將酶解和脫水后的目標蛋白膠粒放入點樣孔內，滴入0.1% TFA到樣品上并充滿點樣孔，使膠粒迅速溶解并潤洗蛋白，I分鐘內吸出點樣孔內所有溶液以除去操作中對蛋白造成的污染，并重復3次。加入微量重結晶液使蛋白結晶析出保存。
[0009]該技術利用待分離蛋白的等電點和分子量的不同，應用二維雙向電泳技術，通過電泳分離和重結晶處理達到分離和純化谷胱甘肽過氧化物酶的目的。與傳統(tǒng)的酶蛋白提取技術相比，使用該技術與方法分離純化得到的酶蛋白具有更高的純度、更多的數(shù)量和更優(yōu)的科研價值。
[0010]該技術利用雙向電泳技術、膠內蛋白酶解和蛋白重結晶等方法，在金山繡線菊中分離純化谷胱甘肽過氧化物酶，經(jīng)驗證利用該技術分離純化的谷胱甘肽過氧化物酶具有良好的產(chǎn)量和純度，高純度的谷胱甘肽過氧化物酶可進一步用于該酶的活性研究、氧化還原與清除氧自由基機理研究、抗逆機制研究、抗逆基因克隆、差異蛋白質組學的相關研究等。
【附圖說明】
[0011]圖1是【具體實施方式】七中含目標蛋白的凝膠電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0012]【具體實施方式】一:本實施方式由雙向凝膠電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法按以下步驟進行:一、金山繡線菊梯度低溫處理；二、金山繡線菊葉片蛋白質的提取:液氮充分研磨金山繡線菊葉片，加入蛋白提取試劑I，-20°C靜置過夜。低溫過夜后提取液4°C離心2小時留取沉淀，用含0.07% β -巰基乙醇約3倍沉淀體積的冷丙酮重懸沉淀后，在鼓風干燥裝置中抽干沉淀。按30 μ 1/mg比例加入蛋白提取試劑II，冰浴后4°C離心I小時留取上清液。三、蛋白質定量與純化:采用標準曲線法進行蛋白定量，按照2D-Quant試劑盒說明進行蛋白純化，純化后的蛋白樣品保存于-80°C冰箱中待用。四、第一相固相PH梯度等電聚焦電泳:取蛋白樣品溶液均勻滴加并充滿膠條槽底部，將膠條輕覆于液層上，在IPGphor電泳儀上進行等電聚焦，聚焦電泳后將膠條分別放入平衡液A、平衡液B中平衡15min，再用雙蒸水充分潤洗瀝干后進行第二相電泳。五、第二相SDS-PAGE凝膠電泳:按常規(guī)制膠方法灌制