包含具有減小的免疫原性的經(jīng)修飾的噬菌體g3p氨基酸序列的多肽的制作方法
【專利說(shuō)明】包含具有減小的免疫原性的經(jīng)修飾的噬菌體G3P氨基酸序列 的多肽
[0001] 本發(fā)明涉及多肽，所述多肽包含足以結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的絲狀噬菌體基 因3蛋白（g3p)的一部分，例如，g3p的N1-N2部分及其突變體和片段，其中g(shù)3p氨基酸序列已 通過(guò)氨基酸取代被修飾來(lái)當(dāng)在體內(nèi)使用時(shí)具有比對(duì)應(yīng)的野生型g3p氨基酸序列顯著更小的 免疫原性。本發(fā)明的多肽保留它們結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的能力。本發(fā)明還涉及這些經(jīng) 修飾的g3p多肽用于治療和/或預(yù)防與淀粉樣蛋白的錯(cuò)誤折疊或聚集相關(guān)的疾病的用途。
[0002] 已證明絲狀噬菌體g3p蛋白以及特別地包含g3p的N1-N2區(qū)的其多肽部分結(jié)合并解 聚各種淀粉樣蛋白，諸如淀粉樣蛋白、τ蛋白和朊病毒蛋白。參見共同未決的PCT申請(qǐng)PCT/ US2012/066793以及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)US 61 /801，349和US 61 /801，849，所述每一個(gè)申請(qǐng)的公 開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。也參見，R.Krishnan等，J.Mol.Biol. (2014)。盡管存在該功效， 但預(yù)期包含g3p或其Ν1-Ν2區(qū)的多肽的全身性施用可引起有害的免疫答應(yīng)。然而，這些教導(dǎo) 都未鑒定導(dǎo)致g3p的免疫原性性質(zhì)的特定T細(xì)胞表位或建議此處提供的減少或消除這些免 疫原性性質(zhì)的特定修飾。
[0003] 許多重組或另外地非天然治療性蛋白質(zhì)或多肽的功效可受患者與所述治療性蛋 白質(zhì)或多肽的不希望的免疫反應(yīng)限制。蛋白質(zhì)對(duì)免疫響應(yīng)的誘導(dǎo)的主要因素是蛋白質(zhì)內(nèi)的 T細(xì)胞表位，即可通過(guò)在組織相容性復(fù)合物(MHC)II類分子上的呈遞刺激T細(xì)胞的活性的氨 基酸序列的存在。T細(xì)胞表位通常被定義為具有結(jié)合MHC II類分子的能力的任何氨基酸殘 基序列。當(dāng)結(jié)合于MHC分子時(shí)，T細(xì)胞表位可被T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別，并可通過(guò)銜接T細(xì)胞受 體以促進(jìn)T細(xì)胞響應(yīng)來(lái)引起T細(xì)胞的活化。然而，通常應(yīng)理解，結(jié)合MHC II類分子的某些T細(xì) 胞表位不刺激T細(xì)胞響應(yīng)，因?yàn)檫@些肽在向其施用所述蛋白質(zhì)的生物體內(nèi)被識(shí)別為"自身 的"。
[0004] -些T細(xì)胞表位可在治療性蛋白質(zhì)或多肽在細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)程中被作為肽釋放，隨 后被MHC的分子呈遞以觸發(fā)T細(xì)胞的活化。對(duì)于由MHC II類分子呈遞的肽，T細(xì)胞的此類活化 則可通過(guò)直接刺激B細(xì)胞產(chǎn)生此類抗體來(lái)產(chǎn)生例如所述抗體響應(yīng)。
[0005] MHC II類分子是一組在輔助T細(xì)胞選擇和活化中起著中心作用的高度多態(tài)的蛋白 質(zhì)。人白細(xì)胞抗原組DR(HLA-DR)是該組蛋白質(zhì)的占優(yōu)勢(shì)的同種型。然而，同種型HLA-DQ和 HLA-DP進(jìn)行相似的功能。在人中，已知DR同種型的約70種不同的同種異型，對(duì)于DQ，存在30 種不同的同種異型以及對(duì)于DP，已知47種不同的同種異型。每一個(gè)個(gè)體具有2至4個(gè)DR等位 基因，2個(gè)DQ和2個(gè)DP等位基因。
[0006] 個(gè)體中針對(duì)蛋白質(zhì)或多肽的免疫響應(yīng)嚴(yán)重受到T細(xì)胞表位識(shí)別影響，所述T細(xì)胞表 位識(shí)別是該個(gè)體的HLA-DR同種異型的肽結(jié)合特異性的函數(shù)。為了在全球人口的背景中鑒定 蛋白質(zhì)或多肽內(nèi)的T細(xì)胞表位，期望考慮盡可能多樣的一組HLA-DR同種異型的結(jié)合性質(zhì)，從 而覆蓋盡可能高的百分比的世界人口。
[0007] T細(xì)胞表位鑒定是表位消除的第一步驟。使得能夠檢測(cè)T細(xì)胞表位的方法在本領(lǐng)域 中是已知的并且公開于WO 98/52976、W0 00/34317、US2007/0269435;US 7,208，147、Kern 等，Nature Medicine4:975_978(1998);和Kwok等，Trends in Immunology 22:583-588 (2001)中。在這些方法中，通過(guò)在治療性蛋白質(zhì)或多肽的一級(jí)序列內(nèi)使用明智的氨基酸取 代來(lái)除去預(yù)測(cè)的或鑒定的T細(xì)胞表位。雖然這些參考資料使得能夠進(jìn)行T細(xì)胞表位的假定鑒 定，但避免對(duì)生物活性的負(fù)面影響的氨基酸取代的選擇不能被合理地預(yù)測(cè)。這僅可通過(guò)測(cè) 試經(jīng)修飾的多肽的每一個(gè)的此類活性來(lái)測(cè)定。
[0008] 因此，可能期望檢查和減小g3p的N1-N2部分的免疫原性而不破壞其淀粉樣蛋白-結(jié)合/解聚性質(zhì)，以便可為了治療和/或診斷目的長(zhǎng)期全身性施用包含N1-N2部分的多肽。本 發(fā)明通過(guò)鑒定N1-N2序列內(nèi)的潛在T細(xì)胞表位來(lái)滿足該需要。本發(fā)明還鑒定了在這些潛在T 細(xì)胞表位內(nèi)的特定氨基酸取代以產(chǎn)生變體N1-N2序列，所述變體N1-N2序列將減少或消除T 細(xì)胞表位的免疫原性而不破壞變體N1-N2結(jié)合淀粉樣蛋白、阻止淀粉樣蛋白聚集和/或?qū)崿F(xiàn) 淀粉樣蛋白斑的解聚的能力。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了多肽，所述多肽包含N1-N2氨基酸序列的變體 或其突變體或片段，由于一個(gè)或多個(gè)鑒定的T細(xì)胞表位內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代而具有 減小的免疫原性。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含與人免疫球蛋白Fc區(qū)融合的變體NI -N2序 列的融合蛋白。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的藥物組合物，以及通過(guò) 向患有與錯(cuò)誤折疊和/或聚集的淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)相關(guān)的疾病或?qū)λ黾膊∫赘械氖茉囌?施用此類藥物組合物來(lái)治療或預(yù)防此類疾病的方法。
[0011]在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子，以及包含那些 核酸分子的載體和具有此類載體的細(xì)胞。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。具體地，此類 方法使用所述核酸分子和/或具有包含此類核酸分子的載體的細(xì)胞。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述
[0014]圖1顯示具有5個(gè)通過(guò)粗體和下劃線標(biāo)識(shí)的T細(xì)胞表位的Nl-N2-hIgGl-Fc融合蛋白 的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)。氨基酸1-217構(gòu)成野生型g3p序列的N1-N2部分。氨基酸218-256代表由存在于M13噬菌體中的野生型g3p的富含甘氨酸的N2-C末端接頭組成的接頭區(qū)。 該區(qū)域通過(guò)陰影來(lái)標(biāo)識(shí)。氨基酸257-261代表由用于構(gòu)建編碼融合蛋白的核酸分子的多克 隆位點(diǎn)編碼的氨基酸。蛋白質(zhì)的IgG-Fc部分始于氨基酸262。
[0015] 圖2代表具有4個(gè)通過(guò)下劃線標(biāo)識(shí)的T細(xì)胞表位的g3p-hIgGl-FC融合蛋白（SEQ ID NO:2)的替代實(shí)施方案的氨基酸序列。已通過(guò)刪除對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1的氨基酸258至259的 氨基酸來(lái)消除第五T細(xì)胞表位。
[0016] 圖3顯示具有3個(gè)通過(guò)粗體和下劃線標(biāo)識(shí)的T細(xì)胞表位的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白 (SEQ ID勵(lì):3)的另一個(gè)替代實(shí)施方案的氨基酸序列。已通過(guò)￥2154和622(^的取代(相較于 SEQ ID NO: 1)消除了第四T細(xì)胞表位，以及已通過(guò)刪除對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1的氨基酸258和 259的氨基酸消除了第五T細(xì)胞表位。
[0017] 圖4A顯示編碼具有N末端哺乳動(dòng)物信號(hào)序列的SEQ ID N0:1的g3p-hIgGl-FC融合 蛋白的DNA序列（SEQ ID NO:4)。圖4B顯示編碼具有N末端哺乳動(dòng)物信號(hào)序列的SEQ ID NO:2 的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白的DNA序列（SEQ ID N0:5)。
[0018] 圖5顯示編碼具有N末端哺乳動(dòng)物信號(hào)序列的SEQ ID N0:3的g3p-hIgGl-Fc融合蛋 白的DNA序列（SEQ ID NO:6)。
[0019] 圖6提供在實(shí)施例1中描述的研究中表達(dá)的供體同種異型的頻率的比較。
[0020] 圖7顯示具有3個(gè)通過(guò)粗體和下劃線標(biāo)識(shí)的T細(xì)胞表位的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白 (SEQ ID N0:7)的另一個(gè)替代實(shí)施方案的氨基酸序列。已通過(guò)V215G取代（如相較于SEQ ID NO: 1)消除第四T細(xì)胞表位。
[0021 ]圖8顯示編碼具有N末端哺乳動(dòng)物信號(hào)序列的SEQ ID N0:7的g3p-hIgGl-Fc融合蛋 白的DNA序列（SEQ ID NO:8)。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023]在本申請(qǐng)中，關(guān)于參照（未修飾的）氨基酸或核酸序列的術(shù)語(yǔ)"經(jīng)修飾的"（及其同 源詞)是指含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代或?qū)?yīng)的密碼子取代的序列。修飾不一定需要參照 序列的物理操作。只要序列含有如相較于參照序列的此類取代，其就可被認(rèn)為是"經(jīng)修飾 的"，無(wú)論其是如何合成的。術(shù)語(yǔ)"變體"是指已被修飾來(lái)相較于參照序列減小免疫原性的氨 基酸或核酸序列。如本文中所用，"變體g3p"或"變體N1-N2"是指這樣的氨基酸序列(或編碼 其的核酸序列），所述序列包含絲狀噬菌體g3p蛋白的N1-N2部分(例如，SEQ ID N0:1的氨基 酸1-217)，或(b)結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的該氨基酸序列的突變體或片段(例如，SEQ ID N0:3的氨基酸1-217)，其中所述氨基酸序列(或編碼其的核酸序列）已被修飾來(lái)相較于參照 (未修飾的)氨基酸序列減小免疫原性；以及其中所述修飾由選自表1、表2、表6或表7的任一 個(gè)中所示的氨基酸取代或?qū)?yīng)取代的組的1至9個(gè)選自氨基酸取代組成。如本文中所用，術(shù) 語(yǔ)"對(duì)應(yīng)取代"意指當(dāng)將此類突變體或片段與SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于表 1、表2、表6或表7中的等同氨基酸取代的SEQ ID NO: 1的突變體或氨基酸1-217的片段中的 取代。
[0024]結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的片段的實(shí)例包括，但 不限于，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸1-67的任何片段。結(jié)合和/或解聚淀粉樣蛋白的SEQ ID N0:1的氨基酸1 -217的片段的突變體的實(shí)例包括，但不限于：（I)SEQ ID N0: 3的氨基酸1 -217; (2)在氨基酸43-45處具有AAA對(duì)VVV的取代的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217、SEQ ID NO: 3的氨基酸1-217或SEQ ID N0:7的氨基酸1-217; (3)具有取代C53W的SEQ ID NO: 1的氨基酸 1- 217、SEQ ID NO:3的氨基酸 1-217或SEQ ID NO:7的氨基酸 1-217; (4)具有氨基酸96-103 的缺失的SEQ ID N0:1的氨基酸1-217、SEQ ID N0:3的氨基酸1-217或SEQ ID N0:7的氨基 酸1-217; (5)在氨基酸212-214處具有AGA對(duì)QPP的取代的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217、SEQ IDN0:3的氨基酸1-217或SEQIDN0:7的氨基酸1-217;(6)具有取代W181A、F190A和F194A 的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217、SEQ ID NO: 3的氨基酸1-217或SEQ ID NO: 7的氨基酸1-217;(7)PCT/US2012/066793中公開的其它活性突變體和片段；（8)SEQIDN0:7的氨基酸1-217; (9)SEQ ID NO: 1 的氨基酸2-217、SEQ ID NO:3的氨基酸2-217或SEQ ID NO:7的氨基酸 2- 217;(10)SEQ ID N0:1 的氨基酸3-217、SEQ ID N0:3的氨基酸3-217或SEQ ID N0:7的氨 基酸3-217。
[0025]先前已顯示絲狀噬菌體g3p蛋白的N1-N2部分具有淀粉樣蛋白結(jié)合和解聚性質(zhì)（參 見PCT/US2012/066793)。天然M13噬菌體的N1-N2部分由SEQ ID N0:1的氨基酸1-217代表。 相同的N1-N2氨基酸序列也存在于fd和Π 絲狀噬菌體中。應(yīng)當(dāng)理解，SEQ ID NO: 1的氨基酸 218-256也是天然g3p序列的部分并且通常被稱為將g3p的N2區(qū)連接至g3p(CT)的C末端的富 含甘氨酸的接頭，也稱為N3結(jié)構(gòu)域。SEQ ID NO: 1的氨基酸257-261代表由用于構(gòu)建編碼SEQ ID NO: 1的融合蛋白的核酸分子的多克隆位點(diǎn)編碼的氨基酸。
[0026] MX
[0027]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含變體g3p或變體N1-N2的多肽。本發(fā)明的 更具體的實(shí)施方案提供了包含選自SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217、SEQ ID NO: 3的氨基酸1-217和SEQ ID N0:7的氨基酸1-217的起始氨基酸序列的變體的多肽，其中：（a)所述多肽結(jié) 合和/或解聚淀粉樣蛋白；（b)所述多肽相較于包含起始氨基酸序列的對(duì)應(yīng)多肽具有減小的 免疫原性;和(c)所述變體相較于所述起始氨基酸序列具有1至9個(gè)氨基酸取代，其中每一個(gè) 氨基酸取代選自表1和表2中所示的氨基酸取代的組。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"包含起始氨基酸 序列的對(duì)應(yīng)多肽"意指除取代外具有與包含所述起始氨基酸序列的多肽相同的氨基酸序列 的多肽。
[0028]表1.針對(duì)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:7的氨基酸 1-217 的去免疫化氨基酸取代。
[0030]表2.針對(duì)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:7的氨基酸 1-217 的替代性或另外的去免疫化氨基酸取代。
[0032] *在表1和2中，每一個(gè)指定的氨基酸在SEQ ID NOS: 1、3和7中是相同的。
[0033]通過(guò)鑒定完全存在于N1-N2氨基酸序列內(nèi)的T細(xì)胞表位來(lái)導(dǎo)出表1和2中所示的氨 基酸取代。這通過(guò)將N1-N2序列的不同重疊肽部分針對(duì)來(lái)自一個(gè)組群的最佳地代表HLA-DR 同種異型的世界人口的社區(qū)供血者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行孵育以鑒定潛在T細(xì)胞表 位來(lái)進(jìn)行。隨后將該信息經(jīng)歷針對(duì)已知T細(xì)胞表位的數(shù)據(jù)庫(kù)的軟件分析以鑒定那些潛在表 位內(nèi)的最佳氨基酸取代。這些方法詳細(xì)地描述于實(shí)施例中。
[0034] 在這些實(shí)施方案的一個(gè)方面，1-9個(gè)氨基酸取代選自表1中所示的那些氨基酸取 代。在上文所示的實(shí)施方案的更具體方面，所述多肽包含僅具有特定的單氨基酸取代的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的變體或SEQ ID NO:3的氨基酸1-217的變體或SEQ ID NO:7的氨基 酸1 -217的變體，其中所述取代選自表3中所示的取代之一：
[0035] 表3.SEQ ID N0:1 的氨基酸 1-217、SEQ ID N0:3的氨基酸 1-217或SEQ ID N0:7的 氨基酸1-217中的特定去免疫化單氨基酸取代
[0037] 在一些實(shí)施方案中，多肽包含具有2-9個(gè)氨基酸取代的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的變體或SEQ ID N0:3的氨基酸1-217的變體、或SEQ ID N0:7的氨基酸1-217的變體，其 中所述取代存在于表位1、2和3的至少兩個(gè)中，并且其中所述取代選自表1和2中所示的那些 表位。在更具體方面，SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的變體或SEQ ID N0:3的氨基酸1-217的 變體或SEQ ID N0:7的氨基酸1-217的變體中的至少2個(gè)取代選自表1中所示的那些取代。在 甚至更具體方面，所述多肽包含僅具有2個(gè)氨基酸取代的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO: 7的變體，其中所述取代選自表4中所示的任何特定的二氨基酸取代：
[0038] 表4.SEQ ID N0:1 的氨基酸 1-217、SEQ ID N0:3的氨基酸 1-217或SEQ ID N0:7的 氨基酸1-217中的特定的去免疫化的二氨基酸取代：
[0041 ]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含具有3-9個(gè)氨基酸取代的SEQ ID NO: 1的氨基 酸1-217的變體或SEQ ID N0:3的氨基酸1-217的變體、或SEQ ID N0:7的氨基酸1-217的變 體，其中至少一個(gè)氨基酸取代存在于表位1、2和3的每一個(gè)中，并且其中所述取代選自表1和 表2中所示的取代。在更具體方面，SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的變體或SEQ ID N0:3的氨 基酸1-217的變體或SEQ ID NO:7的氨基酸1-217的變體中的至少3個(gè)氨基酸取代選自表2中 所示的取代。在甚至更具體方面，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的變體或SEQ ID NO:3的