專利名稱：：Cho-k1細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于多肽生產(chǎn)領(lǐng)域。更準(zhǔn)確地，本發(fā)明報(bào)導(dǎo)了新型CHO-Kl細(xì)胞系CHO-Kl-Gln(-)、該細(xì)胞系的產(chǎn)生和該細(xì)胞系在異源多肽的生產(chǎn)中的用途。
背景技術(shù)：
：用于生產(chǎn)重組多肽的表達(dá)系統(tǒng)在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的并且已由例如Marino，Μ.H.，Biopharm.2(1989)18-33；Goeddel，D.V.，等，MethodsEnzymol.185(1990)3-7；ffurm,F.，和Bernard，Α.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-159描述。優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞等中生產(chǎn)用于藥物應(yīng)用的多肽。表達(dá)質(zhì)粒的必需元件是原核質(zhì)粒擴(kuò)增單位，例如對于大腸桿菌(E.coli)，包含原核復(fù)制起點(diǎn)和原核選擇標(biāo)記、真核選擇標(biāo)記、以及一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)目的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)盒(其各自含有啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止子，包括多腺苷酸化信號)。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，可包含哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)，例如SV40Ori或OriP?？蛇x擇組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子作為啟動(dòng)子。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)錄，可在5’非翻譯區(qū)中包含Kozak序列。為了進(jìn)行mRNA加工，尤其是mRNA剪接和轉(zhuǎn)錄終止，取決于結(jié)構(gòu)基因的組織(外顯子/內(nèi)含子組織)，可包含mRNA剪接信號和多腺苷酸化信號。今天CHO細(xì)胞已被廣泛用于在實(shí)驗(yàn)室中以小規(guī)?；蛟谏a(chǎn)過程中以大規(guī)模表達(dá)藥物多肽。由于它們的廣泛分布和用途，CHO的特征性質(zhì)和遺傳背景是熟知的。因此，CHO細(xì)胞被管理局批準(zhǔn)用于生產(chǎn)人用治療性蛋白質(zhì)。但是對于培養(yǎng)基仍然存在許多限制條件。使用動(dòng)物來源的成分，有污染對人有害的物質(zhì)，例如病毒或朊病毒蛋白質(zhì)，的潛在風(fēng)險(xiǎn)。除了高成本和下游加工問題外，動(dòng)物來源的成分的另一個(gè)問題是作為天然產(chǎn)物的批與批之間的差異，這使得難以以恒定的產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量獲得該成分。為了克服這些限制，需要對于其培養(yǎng)而言要求更少的動(dòng)物來源成分的生產(chǎn)性細(xì)胞系。能夠在完全確定的無蛋白質(zhì)條件下自分泌生長的超級CHO細(xì)胞系(superCHOcellline)已由Pak，等，(Pak，S.C.0.，等，Cytotechnology22(1996)139-146)報(bào)導(dǎo)。這是表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白和IGF-I的CH0-K1(ATCCCCL61)細(xì)胞系。Morris，Α.Ε.，等(US2005/0170462)報(bào)導(dǎo)了通過調(diào)節(jié)IGF-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)重組蛋白的方法。Belaus等用嵌合型ErbB2v—E/IGF_I報(bào)告基因轉(zhuǎn)染了IL-3依賴性鼠BaF/3細(xì)胞(Belaus，Α.，等，J.Steroid.Biochem.Mol.Biol.85(2003)105-115)。發(fā)明概述本發(fā)明包括CH0-K1細(xì)胞CHO-Kl-Gln(-)，其特征在于所述CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞-來源于以ATCCCCL-61保藏的CH0-K1細(xì)胞，-懸浮生長，-在不含多肽和血清的培養(yǎng)基中生長，_在培養(yǎng)基中不需要谷氨酰胺、胰島素和生長因子用于生長，其中與親本CHO-Kl細(xì)胞ATCCCCL-61相比較，所述CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞未利用分子生物學(xué)方法通過核酸的導(dǎo)入、缺失或失活進(jìn)行過遺傳修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CHO-Kl-Gln(_)細(xì)胞的生長不需要?jiǎng)游飦碓吹幕衔铩１景l(fā)明的第二方面是產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的CHO-Kl細(xì)胞的方法，其特征在于所述方法由下列步驟按下列順序組成a)提供CHO-Kl細(xì)胞ATCCCCL-61，b)使所述CHO-Kl細(xì)胞適應(yīng)(adapt)在不含多肽的、補(bǔ)充有谷氨酰胺和任選地補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸苷的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中懸浮生長，c)使在步驟b)中經(jīng)過適應(yīng)的所述CHO-Kl細(xì)胞適應(yīng)在不含多肽的、任選地補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸苷的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中懸浮生長，由此獲得所述CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞，其中該CHO-Kl-Gln(_)細(xì)胞在如下培養(yǎng)基上生長，所述培養(yǎng)基為不含谷氨酰胺、胰島素和生長因子的、無多肽的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其中所述CHO-Kl-Gln(_)細(xì)胞未利用分子生物學(xué)方法通過核酸的導(dǎo)入、缺失或失活進(jìn)行過遺傳修飾。本發(fā)明的另一個(gè)方面是利用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的CHO-Kl細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于重組生產(chǎn)異源多肽的方法，其包括下列步驟a)提供根據(jù)本發(fā)明的CHO-Kl細(xì)胞，b)提供一個(gè)或多個(gè)編碼所述異源多肽的核酸，c)用所述一個(gè)或多個(gè)核酸轉(zhuǎn)染a)的所述CHO-Kl細(xì)胞，d)在不含多肽、不含谷氨酰胺、胰島素和生長因子的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)步驟c)的所述轉(zhuǎn)染的CHO-Kl細(xì)胞，e)從所述CHO-Kl細(xì)胞或CHO-Kl細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收所述異源多肽，和任選地f)利用一個(gè)或多個(gè)層析步驟純化所述異源多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物或非免疫球蛋白多肽，優(yōu)選具有治療活性的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在培養(yǎng)期間，培養(yǎng)基中銨離子濃度低于0.12mmol/L。另外的實(shí)施方案是在相同培養(yǎng)基中進(jìn)行所述步驟c)和d)。另一個(gè)實(shí)施方案是在不含多肽的、任選地補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸苷的、化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基中進(jìn)行所述步驟c)和d)，條件是培養(yǎng)基不含有以分離的化合物形式或作為肽或多肽的一部分存在的谷氨酰胺，也不含有胰島素和生長因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)以補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方式進(jìn)行，條件是用于該培養(yǎng)的進(jìn)料不含有以分離的化合物形式或作為肽或多肽的一部分存在的谷氨酰胺，也不含有胰島素和生長因子。發(fā)明詳述可以用于實(shí)施本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和技術(shù)描述于例如Ausubel，F(xiàn).Μ.，ed.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第I至III卷(1997)，Wiley禾口Sons；Sambrook,等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)中。一般層析方法和它們的用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。參見，例如，Chromatography,第5片反，PartA!FundamentalsandTechniques，Heftmann，Ε.(ed)，ElsevierSciencePublishingCompany,NewYork，(1992)；AdvancedChromatographicandElectromigrationMethodsinBiosciences,Deyl,Z.(ed.),ElsevierScienceBV,Amsterdam，TheNetherlands，(1998)；ChromatographyToday,Poole,C.F.，禾口Poole，S.K.，ElsevierSciencePublishingCompany,NewYork，(1991)；Scopes，ProteinPurificationPrinciplesandPractice(1982)；Sambrook,J.，等(ed)，MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，N·Y·，1989；或CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausube1,F.M.，等(eds)，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork。為了純化重組產(chǎn)生的異源免疫球蛋白，通常使用不同柱層析步驟的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，在A蛋白親和層析后，進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)額外的層析分離步驟，例如離子交換層析步驟。終純化步驟可以是用于除去痕量雜質(zhì)和污染物如聚集的免疫球蛋白、殘留的HCP(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))、DNA(宿主細(xì)胞核酸)、病毒和/或內(nèi)毒素的所謂“精制步驟”(polishingstep)0為了進(jìn)行該精制步驟，通常以穿流(flow-through)模式使用陰離子交換層析材料。已良好地建立了多種不同的方法，并且將其廣泛用于蛋白質(zhì)的回收和純化，例如利用微生物蛋白質(zhì)的親和層析(例如A蛋白或G蛋白親和層析)、離子交換層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換)、親硫吸附(例如利用β-巰基乙醇和其他SH配體)、疏水相互作用或芳族吸附層析(例如利用苯基_瓊脂糖、aza-arenophilic樹脂或間-氨基苯硼酸)、金屬螯合劑親和層析(例如利用Ni(II)-和Cu(II)-親和材料)、大小排阻層析和電泳法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi,Μ.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93—102)。如本申請中所用的術(shù)語“氨基酸”是指羧基α-氨基酸，其可直接或以前體的形式由核酸編碼。單個(gè)氨基酸由三個(gè)核苷酸(所謂的密碼子或堿基三聯(lián)體)組成的核酸編碼。每一個(gè)氨基酸由至少一個(gè)密碼子編碼。相同氨基酸由不同密碼子編碼稱為“遺傳密碼的簡并性”。本申請中所用的術(shù)語“氨基酸”是指天然發(fā)生的羧基α-氨基酸，其包括丙氨酸(三字母代碼ala，一字母代碼A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(aSn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，Ε)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu,L)、賴氨酸(lys,K)、甲硫氨酸(met,Μ)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro，P)、絲氨酸(ser，S)、蘇氨酸(thr，Τ)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和纈氨酸(val，V)。在本申請中可互換使用的術(shù)語“核酸”或“核酸序列”或“核酸分子”是指，由單核苷酸(也稱為堿基)a、c、g和t(或在RNA中u)組成的多聚體分子，例如DNA、RNA或其修飾形式。該多核苷酸分子可以是天然發(fā)生的多核苷酸分子、或合成的多核苷酸分子、或一個(gè)或多個(gè)天然發(fā)生的多核苷酸分子與一個(gè)或多個(gè)合成的多核苷酸分子的組合。該定義還包括其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被改變(例如，通過誘變)、缺失或添加的天然發(fā)生的多核苷酸分子。核酸可以是分離的，或整合在另一個(gè)核酸例如表達(dá)盒、質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞的染色體中。以由單核苷酸組成的核酸序列來表征核酸。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，將例如多肽的氨基酸序列轉(zhuǎn)化成編碼該氨基酸序列的相應(yīng)核酸序列的操作和方法是熟知的。因此，核酸可以以其由單核苷酸組成的核酸序列來表征，也可以用由其編碼的多肽的氨基酸序列來表征?！岸嚯摹笔怯赏ㄟ^肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物，其可以是天然或合成產(chǎn)生的。少于大約20個(gè)氨基酸殘基的多肽可稱為“肽”，然而，由2個(gè)或多個(gè)肽組成的分子或含有具有100個(gè)以上氨基酸殘基的一個(gè)多肽的分子可稱為“蛋白質(zhì)”。多肽也可含有非氨基酸成分，例如糖基、金屬離子或羧酸酯類。非氨基酸成分可通過表達(dá)該多肽的細(xì)胞加入，并且可隨細(xì)胞的類型變化而變化。在本文中根據(jù)其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)或編碼它的核酸來定義多肽。添加例如糖基通常不是規(guī)定的，但可存在。術(shù)語“免疫球蛋白”包括各種形式的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)，包括完全免疫球蛋白和免疫球蛋白綴合物。用于本發(fā)明的免疫球蛋白優(yōu)選是人抗體，或人源化抗體或嵌合抗體或T細(xì)胞抗原耗竭的抗體(Tcellantigencbpletedantibody)(參見例如WO98/33523、WO98/52976和WO00/34317)?？贵w的基因工程描述于例如Morrison，S.L.，等，Proc.Natl.AcadSci.USA81(1984)6851-6855;US5，202，238和US5，204，244;Riechmann，L.，等，Nature332(1988)323-327；Neuberger,Μ.S.，等，Nature314(1985)268-270；Lonberg,N.，Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125中。免疫球蛋白可以以多種形式存在，包括例如，F(xiàn)v,Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)、雙特異性免疫球蛋白或雙體(diabody)(例如Huston,J.S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)5879-5883；Bird,R.Ε·，等，Science242(1988)423-426；一般而言，Hood等，Immunology,BenjaminN.Y.，第2版(1984)；以及Hunkapiller,T.和Hood,L.，Nature323(1986)15-16)。術(shù)語“完全免疫球蛋白”是指含有兩條所謂的輕鏈和兩條所謂的重鏈的免疫球蛋白。完全免疫球蛋白的每條重鏈和每條輕鏈各含有一個(gè)包含能夠與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)的可變結(jié)構(gòu)域(可變區(qū))(通常為該多肽鏈的氨基端部分)。完全免疫球蛋白的重鏈和輕鏈各含有恒定區(qū)(通常為羧基端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)抗體i)與帶有Fcγ受體(FcyR)的細(xì)胞例如吞噬細(xì)胞結(jié)合，或ii)與帶有稱為Brambell受體的新生兒Fc受體(FcRn)的細(xì)胞結(jié)合。其還介導(dǎo)對一些因子，包括經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的因子，例如成分(Clq)，的結(jié)合。免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域依次包含不同區(qū)段，即4個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)和3個(gè)高變區(qū)(CDR)。術(shù)語“免疫球蛋白綴合物”是指含有至少一個(gè)免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述結(jié)構(gòu)域通過肽鍵與另外的多肽綴合。所述另外的多肽是非免疫球蛋白肽，例如激素或生長受體或抗融合肽(antifusogenicp印tide)或補(bǔ)體因子等。WO2007/045463中報(bào)導(dǎo)了示例性免疫球蛋白綴合物。術(shù)語“異源多肽”是指不是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞或宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生的多肽。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽通過重組方法產(chǎn)生。此類方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，包括在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，然后回收和分離該異源多肽，以及通常純化至藥學(xué)上可接受的純度。為了進(jìn)行多肽的生產(chǎn)，即表達(dá)，可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法將一個(gè)或多個(gè)編碼多肽的核酸分別插入表達(dá)盒。雜交瘤細(xì)胞可以例如用作編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈的此類核酸的來源?？蓪⒈磉_(dá)盒插入表達(dá)質(zhì)粒，然后將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入原本不產(chǎn)生該異源多肽的宿主細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)恼婧怂拗骷?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，在裂解后從細(xì)胞或從培養(yǎng)上清液中回收多肽。“分離的多肽”是指該多肽基本上不含污染性細(xì)胞成分，例如糖、脂質(zhì)、或在天然狀態(tài)下與該多肽結(jié)合的其他蛋白質(zhì)性雜質(zhì)。通常，分離的多肽的制品包含高度純化形式，即至少大約80%純度，至少大約90%純度，至少大約95%純度，大于95%純度或大于99%純度，的多肽。顯示特定蛋白質(zhì)制品含有分離的多肽的一個(gè)方法是，在蛋白質(zhì)制品的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色后，顯現(xiàn)單個(gè)條帶。然而，術(shù)語“分離的”不排除存在相同多肽的可變物理形式，例如二聚體或可變糖基化或衍生化的形式?！爱愒碊NA”或“異源多肽”是指不天然存在于給定的宿主細(xì)胞中的DNA分子或多肽、或DNA分子群或多肽群。對于特定宿主細(xì)胞是異源的DNA分子可含有來源于宿主細(xì)胞物種的DNA(即內(nèi)源DNA)，只要該宿主DNA與非宿主DNA(即外源DNA)組合即可。例如，包含與含有啟動(dòng)子的宿主DNA區(qū)段有效連接的編碼多肽的非宿主DNA區(qū)段的DNA分子，被認(rèn)為是異源DNA分子。反過來，異源DNA分子也可包括與外源啟動(dòng)子有效連接的內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因。由非宿主DNA分子編碼的肽或多肽是“異源”肽或多肽。如本申請中所用的術(shù)語“生長因子”是指在培養(yǎng)基中對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長具有正效應(yīng)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生長因子由氨基酸殘基組成，即為肽、多肽或蛋白質(zhì)。非限定性示例性生長因子是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、myostatin(⑶F-8)、生長分化因子_9(⑶F-9)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF或FGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF或FGF-2)、表皮生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、激活蛋白(activin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、FLT-3配體、胰島素樣生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophicfactor)、sonichedgehog蛋白、血管內(nèi)皮生長因子。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的任何適宜的或期望的治療性蛋白質(zhì)均可使用根據(jù)本發(fā)明的CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生。此類蛋白質(zhì)的非限定性實(shí)例包括細(xì)胞因子、受體、可溶性受體、白細(xì)胞介素、生長因子、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白綴合物等。術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)”是指細(xì)胞在滾瓶、燒瓶、玻璃或不銹鋼培養(yǎng)容器等中懸浮或貼壁生長。大規(guī)模方法例如生物反應(yīng)器也包括在術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)”中。用于多肽的大規(guī)模和小規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法都包括在本發(fā)明中?？墒褂冒ǖ幌抻诹骰采锓磻?yīng)器、搖瓶培養(yǎng)或攪拌釜式反應(yīng)器系統(tǒng)等方法，并且可以備選地以分批、split-batch、補(bǔ)料分批或灌流(perfusion)模式操作。如在本發(fā)明中可互換使用的術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基”是指用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營養(yǎng)液。這樣的營養(yǎng)液通常包括生長和細(xì)胞環(huán)境的維持所必需的各種因子。例如，典型的營養(yǎng)液可包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方、各種補(bǔ)充劑(取決于培養(yǎng)類型)和偶爾地選擇劑。一般而言，任何適宜的細(xì)胞培養(yǎng)基均可用于根據(jù)本發(fā)明的方法，只要其不包含多肽、谷氨酰胺、胰島素和任何生長因子?？捎酶鶕?jù)本發(fā)明的細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)是例如激素，如黃體生成素釋放激素、甲狀腺激素釋放激素、生長抑素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、促黑素細(xì)胞激素、血管升壓素和其衍生物例如desmorpessin、催產(chǎn)素、降鈣素、甲狀旁腺激素(PTH)或其片段(例如PTH(I-43))、胃泌素、腸促胰液素、促胰酶素、膽囊收縮素、血管緊張素、人胎盤催乳素、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、雨蛙肽和促胃動(dòng)素；止痛物質(zhì)，如腦啡肽和其衍生物(參見US4，277，394和EP0031567)、內(nèi)啡肽、daynorphin和京都啡肽(kyotorphin)；酶，如蛙皮素、神經(jīng)降壓肽、緩激肽和P物質(zhì)；人生長激素、牛生長激素、生長激素釋放因子、甲狀旁腺激素、促甲狀腺激素、EPO、脂蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、促卵胞激素、降鈣素、促黃體生成激素、胰高血糖素、抗凝因子(anti-clottingfactor)例如蛋白C、心房鈉尿肽、肺表面活性物質(zhì)(lungsurfactant)、纖溶酶原活化物例如尿激酶、或人尿或組織型纖溶酶原活化物(t-PA)、凝血酶、腦啡肽酶、RANTES(受激活調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)和分^必白勺因子(regulatedonactivationnormallyT-cellexpressedandsecreted))Λ人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MlP-l-α)、血清白蛋白例如人血清白蛋白、繆勒管抑制物質(zhì)(Mullerianinhibitingsubstance)、松弛素A鏈、松馳素B鏈、松馳素原(prorelaxin)、小鼠促性腺素相關(guān)肽、微生物蛋白例如內(nèi)酰胺酶、DNA酶、抑素、激活素、腎素、激素或生長因子的受體、整合素、A或D蛋白、類風(fēng)濕因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子例如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3，-4，-5或-6(ΝΤ_3、ΝΤ_4、ΝΤ-5或ΝΤ-6)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、⑶蛋白(分化簇蛋白)例如⑶_3、⑶-4、⑶-8和⑶-19、骨誘導(dǎo)因子、免疫毒素、細(xì)胞因子受體、干擾素例如干擾素-α、β和Y、白細(xì)胞介素(IL)例如IL-I至IL-10、超氧化物歧化酶、T細(xì)胞受體、表面膜蛋白、衰變加速因子、病毒抗原例如AIDS被膜的一部分、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、歸巢受體、地址素、調(diào)節(jié)蛋白、免疫球蛋白、嵌合蛋白質(zhì)例如免疫粘合素、和任何上述蛋白的片段。術(shù)語“CH0-K1細(xì)胞”或“CH0-K1”和其語法等同物以及含有該術(shù)語的組合物是指可以或已向其中導(dǎo)入了例如編碼異源多肽的核酸的CHO-Kl細(xì)胞。如本文中所用的，表述“細(xì)胞”包括主題細(xì)胞和其后代。因此，詞語“轉(zhuǎn)染子”和“轉(zhuǎn)染的細(xì)胞”包括原代主題細(xì)胞和從其來源的培養(yǎng)物而不管細(xì)胞傳代(分傳)或繼代培養(yǎng)的次數(shù)。也要理解，由于有意或無意的突變，所有后代在DNA內(nèi)容上可以不完全一致。包括與原始轉(zhuǎn)染細(xì)胞中篩選出來的功能或生物活性具有相同的功能或生物活性的變體后代。如本文中所用的術(shù)語“表達(dá)”是指在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯過程?？苫诖嬖谟诩?xì)胞中的相應(yīng)mRNA的量確定細(xì)胞中目的核酸序列的轉(zhuǎn)錄水平。例如，可通過RT-PCR或通過Northern雜交定量從目的序列轉(zhuǎn)錄的mRNA(參見Sambrook，等，1989，同上)?？赏ㄟ^各種方法，例如通過ELISA、通過測定多肽的生物活性，或通過使用不依賴于該活性的測定法，例如Western印跡或放射免疫測定法，使用識別和結(jié)合多肽的免疫球蛋白，定量由目的核酸編碼的多肽(參見Sambrook，等，1989，同上)?！氨磉_(dá)盒”是指含有調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子和多腺苷酸化位點(diǎn)，的構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)元件是在細(xì)胞中表達(dá)至少該表達(dá)盒中所包含的核酸所必需的?！稗D(zhuǎn)染載體”是為在宿主細(xì)胞中表達(dá)該轉(zhuǎn)染載體中包含的編碼核酸/結(jié)構(gòu)基因提供所有必需元件的核酸(也稱為核酸分子)。轉(zhuǎn)染載體包含原核質(zhì)粒擴(kuò)增單位，例如對于大腸桿菌(E.coli)，這又包含原核復(fù)制起點(diǎn)和賦予對原核選擇劑的抗性的核酸，轉(zhuǎn)染載體還可以包含一個(gè)或多個(gè)賦予對真核選擇劑的抗性的核酸、和一個(gè)或多個(gè)編碼目的多肽的核酸。優(yōu)選將賦予對選擇劑的抗性的核酸和編碼目的多肽的核酸均置于表達(dá)盒內(nèi)，其中每個(gè)表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、編碼核酸和轉(zhuǎn)錄終止子，包括多腺苷酸化信號。通常將基因表達(dá)置于啟動(dòng)子的控制之下，這樣的結(jié)構(gòu)基因被認(rèn)為與啟動(dòng)子“有效連接”。類似地，如果調(diào)控元件調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子的活性，則調(diào)控元件與核心啟動(dòng)子是有效連接的?！皢?dòng)子”是指控制與其有效連接的基因/結(jié)構(gòu)基因或核酸序列轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。啟動(dòng)子包括用于RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的信號。所使用的啟動(dòng)子將在考慮表達(dá)所選序列的宿主細(xì)胞的細(xì)胞類型中是有功能的。許多啟動(dòng)子，包括來自多種不同來源的組成型、誘導(dǎo)型和阻抑型啟動(dòng)子，在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(并且在數(shù)據(jù)庫例如GenBank中作了標(biāo)識)，并且可以以克隆的多核苷酸形式或存在于克隆的多核苷酸中的形式獲得(來自例如保藏機(jī)構(gòu)，例如ATCC，以及其他商業(yè)或個(gè)人來源)?！皢?dòng)子”包括指導(dǎo)有效連接的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。通常，啟動(dòng)子位于基因的5'非編碼或非翻譯區(qū)，靠近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。啟動(dòng)子中在轉(zhuǎn)錄的起始中發(fā)揮作用的序列元件通常以共有核苷酸序列為特征。此類啟動(dòng)子元件包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、TATA序列、CAAT序列、分化特異性元件(differentiation-specificelement)(DSE；McGehee,R.Ε.，等，Mol.Endocrinol.7(1993)551-560)、環(huán)AMP效應(yīng)元件(CRE)、血清效應(yīng)元件(SRE；Treisman,R.，SeminarsinCancerBiol.1(1990)47-58)、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(GRE)、和其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)例如CRE/ATF(0'Reilly,Μ.Α.，等，J.Biol.Chem.267(1992)19938-19943)、AP2(Ye,J.，等，J.Biol.Chem.269(1994)25728-25734)、SPl、cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB；Loeken,Μ.R.，GeneExpr.3(1993)253-264)和八核苷酸因子(octamerfactor)(通常參見，Watson等，eds.,MolecularBiologyoftheGene,第4版(TheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.1987),以及Lemaigre,F.P.禾口Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14)。被鑒定為用于高水平表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子的真核生物啟動(dòng)子有SV40早期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)、中國倉鼠延伸因子1α(CHEF-1，參見例如US5，888，809)、人EF-1α、遍在蛋白和人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMVIE)?！皢?dòng)子”可以是組成型或誘導(dǎo)型的。增強(qiáng)子(即作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的順式作用元件)可能是必需的，其與啟動(dòng)子一起發(fā)揮作用以增加單獨(dú)使用啟動(dòng)子時(shí)獲得的表達(dá)水平，其可被包括為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。含有啟動(dòng)子的多核苷酸區(qū)段通常也可包括增強(qiáng)子序列(例如，CMV或SV40)?！霸鰪?qiáng)子”，如本文中所用的，是指增加與其有效連接的基因或編碼序列的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。與啟動(dòng)子不同，增強(qiáng)子相對地是取向和位置不依賴性的，并且已被發(fā)現(xiàn)存在于轉(zhuǎn)錄單位的5'或3'(Lusky，M.，等，Mol.CellBio.,3(1983)1108-1122)、內(nèi)含子中(Banerji,J.，等，Cell,33(1983)729-740)以及編碼序列本身中(Osborne，Τ.F.，等，Mol.CellBio.,4(1984)1293-1305)。因此，增強(qiáng)子可置于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游或下游、或在距離啟動(dòng)子相當(dāng)遠(yuǎn)的位置上，實(shí)踐中增強(qiáng)子可在物理和功能上與啟動(dòng)子重疊。來自多種不同來源的許多增強(qiáng)子在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(并且在數(shù)據(jù)庫例如GenBank中作了標(biāo)識)，其可以以克隆的多核苷酸序列形式或存在于克隆的多核苷酸序列中的形式獲得(來自例如保藏機(jī)構(gòu)例如ATCC以及其他商業(yè)或個(gè)人來源)。許多包含啟動(dòng)子序列(例如常用的CMV啟動(dòng)子)的多核苷酸也包含增強(qiáng)子序列。例如，上面所列的所有強(qiáng)啟動(dòng)子也可以包含強(qiáng)增強(qiáng)子(參見例如Bendig,M.，M.，GeneticEngineering7(AcademicPress,1988)91-127)。“賦予對選擇劑的抗性的核酸”是允許攜帶其的細(xì)胞在選擇劑存在的情況下被特異地選擇出來或被選擇除去的核酸。這樣的核酸也稱為選擇標(biāo)記。通常，選擇標(biāo)記可賦予對選擇劑(藥物)的抗性或補(bǔ)償宿主細(xì)胞的代謝或分解代謝缺陷。選擇標(biāo)記可以是陽性的、陰性的或雙功能的。有用的陽性選擇標(biāo)記是抗生素抗性基因。該選擇標(biāo)記允許被其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在相應(yīng)選擇劑存在的情況下被陽性選擇，即在例如相應(yīng)的抗生素存在的情況下選擇性生長。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能夠在該選擇性生長條件，即在選擇劑存在的情況下，在培養(yǎng)中生長或存活。陽性選擇標(biāo)記允許選擇帶有該標(biāo)記的細(xì)胞，而陰性選擇標(biāo)記允許帶有標(biāo)記的細(xì)胞被選擇性消除。真核選擇標(biāo)記包括例如氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的基因(賦予對選擇劑例如潮霉素(hyg)、新霉素(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II，ne0)和G418的抗性)、二氫葉酸還原酶(DHFR)(賦予對選擇劑氨甲蝶呤的抗性)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(賦予對選擇劑吲哚的抗性)、組氨醇脫氫酶(賦予對選擇劑組氨醇D的抗性)、胞嘧啶核苷脫氨酶、腺苷脫氨酶、和賦予對嘌呤霉素、博來霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的核酸。在例如WO92/08796和WO94/28143中報(bào)導(dǎo)了其他選擇標(biāo)記核酸。原核選擇標(biāo)記包括例如β-內(nèi)酰胺酶基因(賦予對選擇劑氨芐青霉素的抗性)?？梢砸运矔r(shí)或永久性表達(dá)的方式進(jìn)行基因的表達(dá)。目的多肽通常是分泌多肽，從而含有對于多肽通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞外培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)運(yùn)/分泌所必需的N末端延伸(也稱為信號序列)。一般地，信號序列可來源于任何編碼分泌多肽的基因。如果使用異源信號序列，其優(yōu)選是被宿主細(xì)胞識別和加工(即被信號肽酶切割)的序列。為了在酵母中分泌，例如可用來源于分泌基因的同源酵母信號序列，例如酵母轉(zhuǎn)化酶信號序列、α-因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和漢遜酵母屬(Hansenula)α-因子前導(dǎo)序列，第二個(gè)描述于US5，010,182)、酸性磷酸酶信號序列或白色念珠菌(C.albican)葡糖淀粉酶信號序列(EPO362179)，置換待表達(dá)的異源基因的天然信號序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，目的蛋白的天然信號序列是令人滿意的，但其他哺乳動(dòng)物信號序列也可以是合適的，例如來自相同或相關(guān)物種的分泌多肽的信號序列，例如來自人或鼠來源的免疫球蛋白的信號序列，以及病毒分泌信號序列例如，單純皰疹病毒糖蛋白D的信號序列。將編碼這樣的前片段(presegment)的DNA片段按讀框連接，即有效地連接，至編碼目的多肽的DNA片段。本發(fā)明的第一方面是稱為CHO-Kl-Gln(_)的CHO-Kl細(xì)胞，其培養(yǎng)基中不需要谷氨酰胺、胰島素和生長因子?？梢匀缦芦@得根據(jù)本發(fā)明的CHO-Kl細(xì)胞-提供以ATCCCCL-61保藏的CH0-K1細(xì)胞，-使所述CHO-Kl細(xì)胞適應(yīng)在不含多肽、補(bǔ)充有谷氨酰胺，任選地補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸苷的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中懸浮生長，-使適應(yīng)于上述步驟的所述CHO-Kl細(xì)胞適應(yīng)在不含多肽、任選地補(bǔ)允有次黃嘌呤和胸苷的、化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中懸浮生長。術(shù)語“化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基”是指只含有合成的化合物并且不含動(dòng)物來源成分的培養(yǎng)基。此外，術(shù)語“化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基”是指這樣的培養(yǎng)基，在一個(gè)實(shí)施方案中其含有低于0.ImM谷氨酰胺，在另一個(gè)實(shí)施方案中低于0.OlmM谷氨酰胺、以及在另外的實(shí)施方案中低于0.OOlmM谷氨酰胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基不含谷氨酰胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基不含動(dòng)物來源的成分并且也不含有植物來源的細(xì)胞水解產(chǎn)物。示例性的化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基(syntheticchemicallydefinedmedia)是來自Invitrogen的CDCHO培養(yǎng)基、或W002/066603中報(bào)導(dǎo)的該培養(yǎng)基的改良形式——其組成為氯化鈉，3-5g/L；氯化鉀，0.2-0.4g/L；HEPES，5_7g/L；葡萄糖(右旋糖)，3·5-5.5g/L；生物素，0.000005-0.000025g/L；抗壞血酸，0.002-0.004；泛酸，0.002-0.006g/L；膽堿，0.002-0.006g/L；葉酸，0.002-0.006g/L；肌醇，0.005-0.02g/L；煙酰胺，0.002-0.006g/L；吡哆醛，0.002-0.006g/L；核黃素，0.0002-0.0006g/L；硫胺素，0.002-0.006g/L；氰鈷胺素，0.000005-0.000025g/L；草酰乙酸，0.1-0.4g/L；丙氨酸，0.015-0.035g/L；天冬酰胺，0.01-0.035g/L；精氨酸，0.06-0.10g/L；天冬氨酸，0.02-0.04g/L；半胱氨酸，0.3-0.5g/L；胱氨酸，0.05-0.2g/L；谷氨酸，0.06-0.09g/L；甘氨酸，0.02-0.04g/L；組氨酸，0.03-0.05g/L；異亮氨酸，0.05-0.25g/L；亮氨酸，0.05-0.25g/L；賴氨酸，0.05-0.25g/L；甲硫氨酸，0.02-0.04g/L；苯丙氨酸，0.055-0.075g/L；脯氨酸，0.03-0.05g/L；絲氨酸，0.03-0.055g/L；蘇氨酸，0.07-0.15g/L；色氨酸，0.005-0.025g/L；酪氨酸，0.05-0.15g/L；纈氨酸，硒酸鈉，0.0000005-0.000060g/L；硫酸鎂，0.05-0.2g/L；氯化鉀，0.15-0.45g/L；磷酸鈉，0.075-0.2g/L；硝酸鉀，0.00005-0.00009g/L；氯化鈣，0.08-0.25g/L；丙酮酸鈉0.05-0.4g/L；油酸，Ι-lOOmg/L；乙醇胺，5-25μg/L；碳酸氫鈉，l-5g/L；檸檬酸鐵，l-10mg/L；PluronicF68，0.2_2g/L；氫氧化鈉，0.3-0.9g/L；霉酚酸，0.l-2mg/L；次黃嘌呤，2-5mg/L；黃嘌呤；10_200mg/L；碳酸氫鈉1.5-4.5g/L；或示例性的化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基可以基于可商購獲得的培養(yǎng)基，例如來自Sigma/Aldrich(產(chǎn)品編號S2772、S2897和S8284(www.sigma-Aldrich.com))或LifeTechnologies,Rockville,MD(www.lifetech.com)或JRHBiosciences,Lenexa,KS(www.jrhbio.com)的培養(yǎng)基，并按照本發(fā)明的條件進(jìn)行改良以提供可以用于本發(fā)明的培養(yǎng)基，或可以基于Iscoves改良培養(yǎng)基(Iscove等，J.Exp.Med.147(1978)923-933；Iscove,等，Exp.CellRes.126(1980)121-126),或Dulbecco‘sModifiedEagle‘s培養(yǎng)基(Dulbecco禾口Freeman,Virology8(1959)396-397；Smith等，，J.D.,Freeman,G.,Vogt,Μ.禾口Dulbecco,R.,Virology12(1960)185-196；Morton,InVitro6(1970)89；Rutzky禾口Pumper，InVitro9(1974)468)，或Ham，sF-12/Dulbecco'sModifiedEagle's培養(yǎng)基(Barnes和Sato,Analyt.Biochem.102(1980)255—270)。從ATCC獲得的CH0-K1細(xì)胞ATCCCCL-61是適應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)濕潤條件(95%濕度，37°C,5%CO2)下于如下培養(yǎng)基中生長的貼壁生長細(xì)胞，所述培養(yǎng)基為補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺和10%(ν/ν)胎牛血清(FCS)的、Dulbecco，sModifiedEagle培養(yǎng)基和Ham，sF12培養(yǎng)基的11(w/w)混合物(DMEM/F12)。在第一步驟中，使細(xì)胞適應(yīng)懸浮生長。因而通過用胰蛋白酶或Accutase進(jìn)行酶促處理，以使細(xì)胞脫離壁，然后離心收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞接種于不含多肽的、含有次黃嘌呤和胸苷以及2mML-丙氨?；?L-谷氨酰胺的、化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基中。在一個(gè)實(shí)施方案中，在體積為50ml至250ml的培養(yǎng)容器中小規(guī)模進(jìn)行該培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，接種細(xì)胞密度為3xl05個(gè)細(xì)胞/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞每3至4代，即每3至5天，分傳到新鮮培養(yǎng)基內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞分傳總共35至60代或進(jìn)行12至20次分傳。在一個(gè)實(shí)施方案中在第一步驟中經(jīng)適應(yīng)的細(xì)胞的倍增時(shí)間為25至30小時(shí)。在第二步驟中，使來源于第一步驟的細(xì)胞適應(yīng)在不含多肽的、含有次黃嘌呤和胸苷但無L-丙氨?；?L-谷氨酰胺的化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基中懸浮生長。因而將細(xì)胞進(jìn)行25至33代或23至35天傳代。第二步驟的不含多肽的化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基不含谷氨酰胺和包含谷氨酰胺的肽或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二步驟中獲得的細(xì)胞的倍增時(shí)間為22至25小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二步驟中獲得的細(xì)胞的最大活細(xì)胞密度是6-7xl06個(gè)細(xì)胞/ml。已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的CHO-Kl-Gln㈠細(xì)胞與親本細(xì)胞系A(chǔ)TCCCCL-61相比較具有改進(jìn)的性質(zhì)。此外，由于從CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞的培養(yǎng)基中排除了谷氨酰胺，在培養(yǎng)過程中銨離子和氨的形成減少。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中銨離子濃度低于0.12mmol/L，在另外的實(shí)施方案中低于0.lmmol/L。還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中乳酸的濃度保持在恒定的水平。因此，在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中的乳酸產(chǎn)生/積累減少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中乳酸濃度低于2.5g/L。此夕卜，利用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞，現(xiàn)可以在產(chǎn)生生產(chǎn)性細(xì)胞系所必需的所有步驟中，即從最初的轉(zhuǎn)染直至大規(guī)模發(fā)酵中，使用相同的培養(yǎng)基。所使用的不含多肽的化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基只需補(bǔ)充必需的選擇劑。因此，在整個(gè)過程中無需對新的/不同培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)的適應(yīng)步驟，從而節(jié)約了時(shí)間和成本。同樣地，在一個(gè)實(shí)施方案中，如果以補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)，那么所用的進(jìn)料不含谷氨酰、胰島素、生長因子和多肽?，F(xiàn)在還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，這樣的有用的細(xì)胞可通過一系列適應(yīng)步驟獲得并且不需要進(jìn)行細(xì)胞的遺傳修飾，例如不需要通過導(dǎo)入編碼酶的額外基因(以將不想要的有毒代謝副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成無害化合物)來進(jìn)行細(xì)胞的遺傳修飾。還發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明的CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞，培養(yǎng)容器的pH值可以保持在pH6.8至pH7.2的pH范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的第二方面是用于產(chǎn)生CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞系的方法，其以下列順序包括下列步驟-提供CHO-Kl細(xì)胞ATCCCCL-61，-使所述CHO-Kl細(xì)胞適應(yīng)在不含多肽的、補(bǔ)充有谷氨酰胺、任選地額外補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸苷的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中懸浮生長，-使在上述步驟中經(jīng)適應(yīng)的所述CHO-Kl細(xì)胞適應(yīng)在不含多肽、任選地補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸苷的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中懸浮生長，由此獲得該CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CHO-Kl-Gln(_)細(xì)胞所需的培養(yǎng)基不含谷氨酰胺、胰島素和生長因子，并且所述CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞未利用分子生物學(xué)方法通過導(dǎo)入、缺失或失活核酸、或通過導(dǎo)入、缺失或失活編碼如下酶的核酸進(jìn)行過遺傳修飾，其中所述酶是對于異源多肽的表達(dá)、二級修飾或分泌不是必需的酶。本發(fā)明的另一個(gè)方面是使用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的CHO-Kl細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是重組產(chǎn)生異源多肽的方法，其包括下列步驟-提供根據(jù)本發(fā)明的CHO-Kl-Gln(_)細(xì)胞，-提供一個(gè)或多個(gè)編碼所述異源多肽的核酸，-用所述一個(gè)或多個(gè)核酸轉(zhuǎn)染所述CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞，_在不含多肽、不含谷氨酰胺、胰島素和生長因子的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞，-從培養(yǎng)基或細(xì)胞回收所述異源多肽，和-任選地通過一個(gè)或多個(gè)層析純化步驟純化所述異源多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物或在治療上具有活性的多肽。根據(jù)本發(fā)明的方法適用于大規(guī)模，即工業(yè)上，生產(chǎn)分泌性異源多肽。用于大規(guī)模生產(chǎn)期望多肽的細(xì)胞的培養(yǎng)通常由一系列單個(gè)培養(yǎng)組成，其中除終培養(yǎng)，即大規(guī)模培養(yǎng)，即，該系列的最后一個(gè)培養(yǎng)外，所有培養(yǎng)都進(jìn)行到直至在培養(yǎng)容器中達(dá)到某一細(xì)胞密度。當(dāng)達(dá)到預(yù)定的細(xì)胞密度時(shí)，將整個(gè)培養(yǎng)物或其級分用于接種下一個(gè)培養(yǎng)容器，該容器具有更大的體積，高至前述培養(yǎng)體積的100倍。用作至少一個(gè)以更大體積進(jìn)行的進(jìn)一步培養(yǎng)的基礎(chǔ)的所有培養(yǎng)都可以被稱為“種子鏈發(fā)酵(seedtrainfermentation)”。只有在大規(guī)模培養(yǎng)中，即在不意欲用作以更大體積進(jìn)行的進(jìn)一步培養(yǎng)的基礎(chǔ)的培養(yǎng)(其也被稱為“主發(fā)酵”)中，才根據(jù)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的分泌性異源免疫球蛋白的濃度或培養(yǎng)時(shí)間來確定培養(yǎng)的終點(diǎn)。如本申請中所用的術(shù)語“大規(guī)?！笔侵腹I(yè)生產(chǎn)過程的最終培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，以至少1001的體積，在另一個(gè)實(shí)施方案以至少5001的體積，在另外的實(shí)施方案中以至少10001直至25，0001的體積進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，終(即大規(guī)模)培養(yǎng)基不含有真核選擇劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，在真核選擇劑存在的情況下在小于500升的體積中進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)，并在真核選擇劑不存在的情況下在500升或更大的體積中進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)，和從無所述真核選擇劑的培養(yǎng)基中回收異源多肽。在另外的實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括培養(yǎng)體積遞增直至終培養(yǎng)體積的順序培養(yǎng)，其中在真核選擇劑存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)直至達(dá)到終或主培養(yǎng)的培養(yǎng)體積的(ν/ν)的培養(yǎng)體積，然后在所有真核選擇劑不存在的情況下在超過終培養(yǎng)的培養(yǎng)體積的(ν/ν)的培養(yǎng)體積中進(jìn)行培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)包括利用遞增的培養(yǎng)體積進(jìn)行的順序種子鏈培養(yǎng)，其中在真核選擇劑存在的情況下進(jìn)行每個(gè)種子鏈培養(yǎng)，并在所有真核選擇劑不存在的情況下進(jìn)行主發(fā)酵。在一個(gè)實(shí)施方案中，在真核選擇劑存在的情況下在種子鏈發(fā)酵中進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)，然后在真核選擇劑不存在的情況下在主發(fā)酵中進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)，然后從不含真核選擇劑的主培養(yǎng)基回收異源多肽。在這些實(shí)施方案中，在種子鏈培養(yǎng)中加入真核選擇劑，在所述CHO細(xì)胞的生產(chǎn)期(主發(fā)酵培養(yǎng))中省去真核選擇劑。術(shù)語“生產(chǎn)期”是指在回收產(chǎn)生的異源多肽之前以大體積進(jìn)行的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)，即主發(fā)酵。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述CHO細(xì)胞的生產(chǎn)力為歷經(jīng)40代不低于以分傳-分批培養(yǎng)(split-batchcultivation)方式培養(yǎng)10代后的生產(chǎn)力的70%且不高于130%。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CHO細(xì)胞的生產(chǎn)力為歷經(jīng)60代不低于以分傳-分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)10代后的生產(chǎn)力的50%且不高于150%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)以補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)時(shí)，所述CHO細(xì)胞的生產(chǎn)力為在21天內(nèi)產(chǎn)生至少1.5g/l的所述異源免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的CHO細(xì)胞的比生產(chǎn)力(specificproductivity)為1μg/106個(gè)細(xì)胞/天以上，5μg/106個(gè)細(xì)胞/天以上或10μg/ΙΟ6個(gè)細(xì)胞/天以上。在一個(gè)實(shí)施方案中，分泌性異源免疫球蛋白是經(jīng)完全加工的分泌性異源免疫球蛋白。術(shù)語“經(jīng)完全加工的分泌性異源免疫球蛋白”是指該免疫球蛋白i)被分泌至培養(yǎng)基且其信號序列已被切除，ii)包含抗原結(jié)合區(qū)，iii)具有二級修飾例如連接的糖或多糖和/或正確形成的二硫鍵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，異源免疫球蛋白是抗-CD4抗體-綴合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物中的所述抗CD4抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含具有選自SEQIDNO01、02或03的氨基酸序列的CDR3。在另外的實(shí)施方案中，所述綴合物中的所述抗-CD4抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含具有選自SEQIDN0:04、05或06的氨基酸序列的⑶R3。在另外的實(shí)施方案中，所述綴合物中的所述抗CD4抗體包含具有選自SEQIDN0:07、08或09的氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另外的實(shí)施方案中，所述綴合物中的所述抗CD4抗體包含具有選自SEQIDNO=IOUl或12的氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?？梢杂糜谥委焺?即意欲用于人的多肽)的大規(guī)模生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞必須滿足獨(dú)特的標(biāo)準(zhǔn)。例如，其必須可在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。血清是多種化合物的混合物。通常將牛血清用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。由于由此帶來的疾病可以從一個(gè)物種傳播至另一個(gè)物種的問題，必須避免使用血清和其他成分不確定的哺乳動(dòng)物來源成分。如本申請中所用的術(shù)語“成分不確定的哺乳動(dòng)物來源成分”是指來源于哺乳動(dòng)物，特別優(yōu)選來自牛、豬、綿羊或羔羊的成分，其組成可被確定至不到80%(w/w)，優(yōu)選不到90%(w/w)0“成分確定的哺乳動(dòng)物來源成分”是從哺乳動(dòng)物，特別優(yōu)選從牛、豬、綿羊或羔羊獲得的成分，其組成可以被確定至高于95%(w/w)，優(yōu)選高于98%(w/w)，最優(yōu)選高于99%(w/w)0成分確定的哺乳動(dòng)物來源成分的實(shí)例是來自羊毛的膽固醇和來自牛奶的半乳糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，不含多肽的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基是可從InvitrogenCorp.商購獲得的⑶CHO培養(yǎng)基，或可從Gibco商購獲得的ProCH04培養(yǎng)基，或可從Hyclone商購獲得的不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基HyQSFM4CH0。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述不含多肽的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基來源于Eagle氏極限必需培養(yǎng)基(EMEM)、Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640,Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基(IMDM)或NCTCIO9培養(yǎng)基(全都可從LonzaInc.，USA獲得)。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，起始于最初的轉(zhuǎn)染并終止于異源多肽回收的該方法在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行。術(shù)語“在相同的培養(yǎng)基中”在本申請中是指從最初轉(zhuǎn)染開始至從主發(fā)酵培養(yǎng)基回收異源多肽結(jié)束都使用相同的培養(yǎng)基。這意味著在所有步驟中使用具有相同組成的新培養(yǎng)基。這并不意味著必須在所有步驟中向培養(yǎng)基中加入相同的添加劑，艮口，在方法的不同步驟中培養(yǎng)基可補(bǔ)充不同的添加劑。添加劑是被添加至培養(yǎng)基中的總共少于20%(w/w)，在一個(gè)實(shí)施方案中少于15%(w/w)，在另一個(gè)實(shí)施方案中少于10%(w/w)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)基在所有步驟中都是相同的培養(yǎng)基并且是適用于異源多肽的大規(guī)模生產(chǎn)的培養(yǎng)基?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的層析方法從培養(yǎng)基回收異源多肽。因而在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括用一個(gè)或多個(gè)層析步驟純化所述異源多肽的終步驟。例如，為了表達(dá)異源免疫球蛋白，用于轉(zhuǎn)染CHO-Kl-Gln㈠細(xì)胞的載體可以包含賦予對真核選擇劑的抗性的核酸，包含編碼所述異源免疫球蛋白的輕鏈的核酸和/或編碼所述異源免疫球蛋白的重鏈的核酸。如果載體只包含編碼所述免疫球蛋白的輕鏈或所述免疫球蛋白的重鏈的核酸，那么還要用另一個(gè)含有編碼所述免疫球蛋白的相應(yīng)另一鏈的核酸的載體在相應(yīng)步驟中轉(zhuǎn)染所述CHO細(xì)胞。本發(fā)明還包括在不含多肽的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO-Kl細(xì)胞。還包括從這樣的細(xì)胞系表達(dá)的異源多肽。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含根據(jù)本發(fā)明的CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源多肽選自免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白綴合物、可溶性受體、跨膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、可溶性蛋白、細(xì)胞外蛋白、融合蛋白、或其任何片段或部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞足以表達(dá)所述異源多肽的時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)間是14至21天。本發(fā)明的另一個(gè)方面是衍生自親本CHO-Kl細(xì)胞，在一個(gè)實(shí)施方案中衍生自CH0-K1ATCCCCL-61，的CHO-Kl細(xì)胞，其中所述衍生的細(xì)胞系在不含多肽、不含谷氨酰胺的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中具有不超過所述親本細(xì)胞系在含有血清和谷氨酰胺的培養(yǎng)基中的倍增時(shí)間的120%的倍增時(shí)間。下列實(shí)施例、序列表和附圖被提供來幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍由后附權(quán)利要求表明。要理解，可在所述方法中進(jìn)行改動(dòng)而不背離本發(fā)明的精神。圖1:3個(gè)培養(yǎng)物各自在a)CD_CH0_HT_Gln培養(yǎng)基和b)CD_CH0_HT培養(yǎng)基中獲得的活細(xì)胞密度。圖2三個(gè)培養(yǎng)物各自在a)CD_CH0_HT_Gln培養(yǎng)基和b)CD_CH0_HT培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸濃度。圖3三個(gè)培養(yǎng)物各自在a)CD_CH0_HT_Gln培養(yǎng)基和b)CD_CH0_HT培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的銨離子濃度。圖4質(zhì)粒6311的注釋的質(zhì)粒圖譜。實(shí)施例材料和方法關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息提供于Kabat，E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5片反，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)。豐艮EU(Edelman，G.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85；Kabat,Ε.A.SequencesofProteinsofImmunologicallnterest，第5片反，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD，(1991))對抗體鏈的氨基酸進(jìn)行編號。重組DNA序列使用如Sambrook,J.，等，Molecularcloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarboriNewYork，1989中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，操作DNA。按照廠商說明書使用分子生物學(xué)試劑?；蚝铣蓮睦没瘜W(xué)合成制備的寡核苷酸制備期望的基因區(qū)段。通過退火和連接寡核苷酸(包括PCR擴(kuò)增)裝配側(cè)翼為限制性核酸內(nèi)切酶單酶切位點(diǎn)的100-600bp長的基因區(qū)段，然后通過A-突出端克隆入pCR2.1-T0P0-TA克隆載體(InvitrogenCorp.，USA)或克隆入pPCR-ScriptAmpSK(+)克隆載體(StratageneCorp.，USA)。通過DNA測序驗(yàn)證亞克隆的基因片段的DNA序列。蛋白質(zhì)測定使用基于氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)，通過測定在280nm處的光密度(OD)來確定蛋白質(zhì)濃度?？贵w滴度的測定使用自體的純化抗體作為參照，利用抗人FcELISA或利用A蛋白層析測定抗體滴度。代謝物的分析使用Bioprofile100plus分析儀(NovaBiomedical)分析葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和銨的濃度。SDS-PAGELDS樣品緩沖液，4倍濃度(4x):4g甘油、0.682gTRIS堿、0.666gTRIS_鹽酸鹽、0.8gLDS(十二烷基硫酸鋰)、0.006gEDTA(乙二胺四乙酸)、0.75ml1%(按重量計(jì)算)(w/w)的ServaBlueG250水溶液、0.75mll%(按重量計(jì)算)(w/w)的酚紅溶液，加水至IOml的總體積。將含有分泌性抗體的液體培養(yǎng)物離心以除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將澄清的上清液的等分試樣與1/4體積(ν/ν)的4xLDS樣品緩沖液和1/10體積(ν/ν)的0.5Μ1,4-二硫蘇糖醇(DTT)混合。然后在70°C溫育樣品10分鐘，利用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。按照廠商的說明書使用NllPAGEPre-Cast凝膠系統(tǒng)(InvitrogenCorp.)。具體地，使用了10%NuPAGENovexBis-TRISPre-Cast凝膠(pH6.4)和NuPAGEmops電泳緩沖液。WesternEp轉(zhuǎn)移緩沖液39mM甘氨酸、48mMTRIS-鹽酸鹽、0.04%(按重計(jì)算)(w/w)SDS和20%(按體積計(jì)算)甲醇(ν/ν)。在SDS-PAGE后，按照Burnette的“半干印跡法(Semidry-Blotting-Method)”(Burnette，W.N.，Anal.Biochem.112(1981)195-203)，將分離的抗體鏈電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(孔徑:0·45μm)。實(shí)施例2CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞的產(chǎn)生從ATCC(No.CCL-61)獲得親本CH0-K1細(xì)胞的冷凍貯存物。Puck,T.T.，等在J.Exp.Med.108(1958)945-956中以及Kao，F(xiàn).T.，和Puck，Τ.Τ.，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA60(1968)1275-1281中報(bào)導(dǎo)了該CH0-K1細(xì)胞的產(chǎn)生。通過預(yù)適應(yīng)于在含有次黃嘌呤-胸苷-補(bǔ)充劑(11067-030，InvitrogenCorp.，USA)的、不含多肽的、不含動(dòng)物成分和不含谷氨酰胺的、化學(xué)成分確定的CDCHO培養(yǎng)基(10743-011，InvitrogenCorp.，USA)中懸浮培養(yǎng)生長，從保藏的CH0-K1細(xì)胞系產(chǎn)生CHO-Kl-Gln(-)宿主細(xì)胞。該培養(yǎng)基在下面稱為CD_CH0_HT培養(yǎng)基。在T-組織培養(yǎng)瓶中，在標(biāo)準(zhǔn)濕潤條件(95%，37°C和5%C02)下，于補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺和10%FCS(Gibco；產(chǎn)品編號26400；USA)的DMEM/F12培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.；Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基和Ham氏F12培養(yǎng)基的11混合物)中，擴(kuò)增貼壁生長的CH0-K1細(xì)胞系A(chǔ)TCCCCL-61。通過使用Accutase(從無脊椎動(dòng)物制備的細(xì)胞脫離液(蝦，PAALaboratories；產(chǎn)品編號L11-007))酶促處理，使細(xì)胞脫離，然后將其在振蕩(110-130rpm)的條件下接種在125mlErlenmeyer燒瓶中于含有2mMultra-谷氨酰胺(L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺；Cambrex；BE17-605E/U1)的CD_CHO_HT培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基在下面稱為CD_CHO_HT_Gln培養(yǎng)基。在大約60天的時(shí)期內(nèi)，每3至4天，將細(xì)胞分傳至新鮮CD_CHO_HT_Gln培養(yǎng)基(接種物濃度大約3xl05個(gè)細(xì)胞/ml)。之后，在大約30天的時(shí)期內(nèi)，使用不含谷氨酰胺的CD_CHO_HT培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行傳代。使獲得的細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)生長和適應(yīng)在無谷氨酰胺、胰島素和生長因子的情況下在不含多肽的、不含動(dòng)物來源成分的、化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基中生長。在圖1中，顯示了在使細(xì)胞適應(yīng)在CD_CH0_HT_Gln培養(yǎng)基中懸浮生長(第一步驟)后和適應(yīng)在CD_CH0_HT培養(yǎng)基中懸浮生長(第二步驟)后可獲得的活細(xì)胞密度?？煽吹?，在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基(圖lb)中可獲得更高的細(xì)胞密度。在第7天，CD_CH0_HT_Gln培養(yǎng)基的PH值是6.7，而CD_CH0_HT培養(yǎng)基在第7天的pH值為pH6.8至pH7.0。在圖2中，顯示了在使細(xì)胞適應(yīng)CD_CH0_HT_Gln培養(yǎng)基后和適應(yīng)CD_CH0_HT培養(yǎng)基后，來自培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸濃度。可看到，在無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中(圖2b)，可觀察到減少的乳酸產(chǎn)生。在圖3中，顯示了在使細(xì)胞適應(yīng)CD_CH0_HT_Gln培養(yǎng)基后和適應(yīng)CD_CH0_HT培養(yǎng)基后來自培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的銨離子濃度?？煽吹剑诓缓劝滨０返呐囵B(yǎng)基中(圖3b)，可觀察到減少的銨離子濃度。表1細(xì)胞倍增時(shí)間的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例3用于表達(dá)抗⑶4抗體綴合物的表達(dá)載體可使用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系表達(dá)的示例性(單克隆)抗體是綴合2至8個(gè)抗融合肽的抗人CD4表面受體抗體(抗CD4抗體)。在例如PCT/EP2008/005894或SEQIDNO01至12中報(bào)導(dǎo)了該抗體和相應(yīng)的核酸序列。將基因組人κ輕鏈恒定區(qū)基因區(qū)段(C-κ)加至SEQIDNO11的抗⑶4抗體的輕鏈可變區(qū)，同時(shí)將人Y1-重鏈恒定區(qū)基因區(qū)段(Cm-鉸鏈-Ch2-Ch3)加至SEQIDNO08的抗⑶4抗體的重鏈可變區(qū)。表達(dá)質(zhì)粒6311包含抗⑶4抗體γ1-重鏈和抗⑶4抗體κ-輕鏈、以及賦予對選擇標(biāo)記新霉素的抗性的核酸，其中所述重鏈在倒數(shù)第二個(gè)C末端氨基酸(即重鏈的C末端賴氨酸被除去)上通過SEQIDNO14的甘氨酸-絲氨酸肽接頭與編碼SEQIDNO:13的抗融合肽的核酸連接。注釋的質(zhì)粒圖譜示于圖4中。a)重鏈表達(dá)盒抗⑶4抗體綴合物重鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下列元件組成-來自人巨細(xì)胞病毒的立即早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子(CMVIE),-5，-非翻譯區(qū)(5，UTR)，-在內(nèi)含子-外顯子基因結(jié)構(gòu)中包含信號肽的、抗⑶4抗體yl重鏈綴合物的編碼序列，-SV40早期polyA信號序列。b)輕鏈表達(dá)盒抗⑶4抗體綴合物輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下列元件組成-來自人巨細(xì)胞病毒的立即早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子(CMVIE),-5，-非翻譯區(qū)(5，UTR)，-在內(nèi)含子-外顯子基因結(jié)構(gòu)中編碼抗⑶4抗體κ輕鏈的編碼序列，-SV40早期polyA信號序列。c)表達(dá)質(zhì)粒為了表達(dá)和產(chǎn)生抗⑶4抗體綴合物，將輕鏈和重鏈表達(dá)盒置于單個(gè)表達(dá)載體上(輕鏈在重鏈的上游)。產(chǎn)生相異只在于所包含的選擇標(biāo)記基因(具體地，新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因和潮霉素抗性基因)的3個(gè)相同的表達(dá)載體。除了輕鏈和重鏈表達(dá)盒以外表達(dá)載體還包含下列元件-允許質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制的、取自pUC18(pUC起點(diǎn))的復(fù)制起點(diǎn)，-在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因。實(shí)施例4轉(zhuǎn)染和選擇表達(dá)抗⑶4抗體綴合物的cho細(xì)胞系在振蕩(110-130rpm)的條件下，使用30-50%的標(biāo)稱體積作為工作體積，以及使用標(biāo)準(zhǔn)濕潤條件(95%，37°C和5%C02)，在Erlenmeyer燒瓶(50或125ml)中，于CD_CH0_HT培養(yǎng)基中，擴(kuò)增實(shí)施例2中獲得的細(xì)胞。每3至4天，將細(xì)胞分傳入新鮮培養(yǎng)基(大約3xl05個(gè)細(xì)胞/ml的接種細(xì)胞密度).通過在指數(shù)生長期離心，收獲細(xì)胞，在無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中清洗一次，然后重懸浮于無菌PBS中。在轉(zhuǎn)染前，使用限制性內(nèi)切核酸酶pvui在β-內(nèi)酰胺酶基因(大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因)內(nèi)線性化質(zhì)粒6311。用乙醇沉淀被切割的DNA，在真空下干燥，然后以大約IygDNA/μ1的濃度溶解于無菌PBS中。為了轉(zhuǎn)染，在室溫于200-300μ1PBS的總體積中，用20-50μg線性化的質(zhì)粒DNA/大約0.9xl07個(gè)細(xì)胞，對CHO宿主細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。利用方波技術(shù)(使用160V單脈沖進(jìn)行15ms)，使用GenePulserXCell電穿孔儀(Bio-RadLaboratories)，在2mm間距杯中，進(jìn)行電穿孔。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞涂鋪在CD_CH0_HT培養(yǎng)基中(IO4個(gè)細(xì)胞/100μ1培養(yǎng)基/96孔培養(yǎng)板的孔)。24小時(shí)后，向各孔中加入100μ1補(bǔ)充有2倍濃度的Geneticin(G418:400μg/mi)的cd_cho_ht培養(yǎng)基而不更換原始培養(yǎng)基和板。在每7天后，更換CD_CH0_HT_G418選擇培養(yǎng)基。在2至3周的溫育后，使用對于人IgGl是特異性的ELISA測定法分析培養(yǎng)上清液中抗體的濃度。權(quán)利要求CHO-K1-Gln(-)細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞a)源自以ATCCCCL-61保藏的CHO-K1細(xì)胞，b)于不含多肽的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中懸浮生長，c)在培養(yǎng)基中不需要谷氨酰胺、胰島素和生長因子用于生長，其中與保藏的CHO-K1細(xì)胞ATCCCCL-61細(xì)胞相比較，所述CHO-K1-Gln(-)細(xì)胞未通過導(dǎo)入、缺失或失活核酸進(jìn)行過遺傳修飾。2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，特征在于所述細(xì)胞不需要?jiǎng)游飦碓闯煞钟糜谏L。3.用于產(chǎn)生CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞的方法，其特征在于所述方法以下列順序包括下列步驟a)提供CHO-Kl細(xì)胞ATCCCCL-61，b)使所述CHO-Kl細(xì)胞適應(yīng)在不含多肽、補(bǔ)充有谷氨酰胺的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中懸浮生長，c)使在步驟b)中經(jīng)適應(yīng)的所述CHO-Kl細(xì)胞適應(yīng)在不含多肽的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中懸浮生長，由此獲得所述CHO-Kl細(xì)胞，其中所述不含多肽的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基無谷氨酰胺、胰島素和生長因子，其中未通過分子生物學(xué)方法利用核酸的導(dǎo)入、缺失或失活，對所述CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞進(jìn)行過遺傳修飾。4.通過權(quán)利要求3的方法獲得的CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞。5.用于重組生產(chǎn)異源多肽的方法，其包括下列步驟a)提供權(quán)利要求1或2的CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞，b)提供一個(gè)或多個(gè)編碼所述異源多肽的核酸，c)用所述一個(gè)或多個(gè)核酸轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞a)，d)在不含多肽、無谷氨酰胺的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟c)的所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，e)從所述細(xì)胞的培養(yǎng)基或從該細(xì)胞中回收所述異源多肽。6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述異源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物或非免疫球蛋白治療活性多肽。7.權(quán)利要求5或6的方法，其特征在于在培養(yǎng)期間，培養(yǎng)基中的銨濃度低于0.12mmol/L。8.根據(jù)權(quán)利要求5至7的任一項(xiàng)的方法，其特征在于在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行所述步驟c)和d)。9.權(quán)利要求5至8的任一項(xiàng)的方法，其特征在于在不含多肽、任選地補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸苷的、化學(xué)成分確定的合成培養(yǎng)基中進(jìn)行所述步驟c)和d)，條件是所述培養(yǎng)基不含有以分離的化合物形式存在的或作為肽或多肽的一部分存在的谷氨酰胺，也不含有胰島素和生長因子。10.權(quán)利要求5至9的任一項(xiàng)的方法，其特征在于以補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方式進(jìn)行所述培養(yǎng)，條件是用于培養(yǎng)的進(jìn)料不含以分離的化合物形式存在的或作為肽或多肽的一部分存在的谷氨酰胺，也不含有胰島素和生長因子，也不含有多肽。11.衍生自親本CHO-Kl細(xì)胞的CHO-Kl-Gln(-)細(xì)胞，其中所述衍生的細(xì)胞系在不含多肽的、不含谷氨酰胺的、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中具有不超過所述親本細(xì)胞系在含有血清和谷氨酰胺的培養(yǎng)基中的倍增時(shí)間的120%的倍增時(shí)間。全文摘要本發(fā)明報(bào)導(dǎo)了CHO-K1細(xì)胞，其特征在于所述CHO-K1細(xì)胞來源于以ATCCCCL-61保藏的CHO-K1細(xì)胞，懸浮生長，在培養(yǎng)基中不需要谷氨酰胺、胰島素和生長因子用于生長，其中所述CHO-K1細(xì)胞，與保藏的CHO-K1細(xì)胞ATCCCCL-61細(xì)胞系相比，未通過核酸的導(dǎo)入、缺失或失活進(jìn)行過修飾。還報(bào)導(dǎo)了用于獲得所述CHO-K1細(xì)胞的方法和使用根據(jù)本發(fā)明的該CHO-K1細(xì)胞產(chǎn)生異源多肽的方法。文檔編號C12N15/69GK101821394SQ200880111157公開日2010年9月1日申請日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日發(fā)明者E·科佩茨基,U·施瓦茨申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司